一个协议，用于噬菌体展示和亲和选择以重组蛋白诱饵
2014年2月16日
噬菌体展示是一种强大的技术，以捕获与感兴趣的固定化分子相互作用的蛋白质或蛋白质的部分。一旦噬菌体cDNA文库的类型来创建和屏幕的决定已经作出，这里所描述的协议允许高效亲和选择，导致识别干扰作用的。
该程序的总体目标是发现蛋白质与固定化诱饵分子的相互作用。这是通过首先获取和固定诱饵来实现的。第二步是在促进结合的条件下将要筛选的噬菌体文库引入诱饵。
接下来，通过严格洗涤去除未结合的噬菌体。而结合的噬菌体用于在回收之前感染细菌。最后一步是扩增结合的噬菌体，用于下一次亲和选择的迭代。
最终，当噬菌体滴度达到平台期时，选择单个噬菌斑并对其进行测序，以显示在实验结合条件下哪些蛋白质对固定滞后的亲和力最高。这个过程可以帮助回答蛋白质相互作用中的关键问题。该程序首先将纯化的重组蛋白置于微量滴定板的底部，如文本方案中所述。
下一步是在 250 毫升锥形瓶中接种 50 毫升 Luria burani 培养基，每毫升氨苄青霉素 100 微克，其中有一个先前按照文本方案中所述生长的菌落，在 37 摄氏度、200 RPM 的水平振荡器中孵育，并使用分光光度计监测细胞密度，直到获得 0.5 至 0.6 的 600 纳米光密度。然后将细胞倒入 50 毫升 Falcon 管或类似管中，并保持在 4 摄氏度，直到使用细胞通常在第一天保持活力约一周。按照第二天早上的文本方案中的说明准备亲和选择。
将 9 个空的 250 毫升锥形瓶放入孵育摇床的夹具中，接种 500 毫升 lal burani 和 500 微升，这些细胞来自噬菌体感染的 BLT 5 4 0 3 细胞的过夜培养物之一，前一天晚上开始将培养瓶放入培养箱中，打开分光光度计并将其设置为读取 600 纳米的吸光度。同时，将微量滴定板从 4 摄氏度中取出并取下塑料薄膜。用每孔 200 微升的 1 X tris 缓冲盐水或 TBS pH 7.5 洗涤 10 次，并在两次洗涤之间将板倒置在纸巾上，从板中去除任何未结合的蛋白质。
用每孔 200 μL 的 5% 封闭试剂在 TBS 中封闭 1 小时。将板包裹在保鲜膜中，用 200 微升 X-T-B-S-T 将板倒置在四层纸上洗掉封闭溶液 10 次。两次洗涤之间使用毛巾。
从这里开始，使用过滤屏障吸头以避免噬菌体交叉污染。吸取 100 μL 噬菌体文库与蛋白质一起。用保鲜膜重新密封板，并在室温下孵育 1 小时。
一小时后，从板中取出保鲜膜，立即将噬菌体摇晃到生物危害性废物中清洗。然后使用多移液器快速向每个移液器中加入 200 微升 1 X-T-B-S-T。好吧，设置一个 1 分钟的计时器。
一分钟后，将缓冲液摇匀到生物危害性废物中，将板倒置在纸巾上，然后将其放回工作台上。第 10 次洗涤后重复洗涤步骤 10 次。从 50 毫升 falcon 管中取出 200 微升 BLT 5 4 0 3 细胞，在 4 摄氏度下转移至去除最后一次洗涤液的九个孔中的每一个孔的底部。
用保鲜膜包裹盘子，并在 37 摄氏度下放置 20 分钟，以使任何仍然粘在诱饵上的噬菌体在 20 分钟结束时感染细菌。打开盘子。接下来，在 25 摄氏度下从 BSA 中去除 10 微升细菌，复制一孔，然后转移到 990 微升标记的培养基中。
对该孔再重复此过程两次，导致来自该孔的噬菌体的三个一式三份，一式三份，每次 1 至 100 稀释，这是 BSA 复制，一次采样 3 次。这些稀释度将用于估计平均滴度加上或减去 BSA 复制的平均值的标准误差，对 BSA 的复制 2 和 3 执行相同的作，对于中毒诱饵蛋白的三个复制孔，对于诱饵蛋白，将这 27 个 EOR 管放在一边。如果培养瓶中的细菌光密度为 0.6 至 1.0，则将 50 毫升细胞从蕨类培养瓶倒入 9 250 毫升锥形瓶中。
取 BSA 复制一孔中剩余的 170 微升噬菌体感染的 BLT 5 4 0 3 细菌，将其添加到 50 毫升标记为 BSA rep 的细胞中。一。在 37 摄氏度培养箱中摇动培养瓶之前，对所有 9 个孔执行此作。同时，从最初的 27 次稀释中，从 Einor 管 1 中取出 100 微升含有细菌的 LB，并将其添加到 Einor 管中的 900 微升 LB 中。
4 次稀释 10 至负 3 次稀释，丢弃过滤器屏障尖端换一个新的，然后从 einor 管 4 中取出 100 微升含有细菌的 LB 并将其添加到 eph 管中的 900 微升 LB 中。7 对于第 10 至负第四次稀释，继续稀释所有蛋白质和处理的所有重复的所有一式三份。一旦细胞躺下，总共应该有 135 个试管。
从 5 摩尔氯化钠储备液中加入 5 mL，然后将样品转移到标记的离心瓶中，在 4 °C 下以 8， 000 倍 G 离心 10 分钟，使培养物达到 0.5 摩尔氯化钠。然后将含有病毒的上清液倒入干净、无菌的 50 ml falcon 管中。向 Falcon 管中倾析的上清液中加入几滴氯仿。
上清液可以储存在 4 摄氏度下，以便在第三天进行下一轮亲和选择，将 250 微升 VLT 5 4 0 3 细胞从 4 摄氏度移液到每个先前制备的编号的硼硅酸盐试管中。然后从 einor 管 1 中的稀释液中吸取 100 微升移液到丁硅酸盐试管中的 250 微升细胞中。一。在火焰上短暂加热移液管的前 5 英寸，然后将其插入熔融的顶部 aros。
吸取 3 毫升，并快速输送到细胞和噬菌体顶部的试管中。用另一只手握住试管，用手指轻弹混合，然后将内容物倒入盘子上。倾斜板并用试管追逐气泡和干点，直到整个板被顶部 agros 覆盖。
将其直立放在长凳上冷却。丢弃硼硅酸盐管。弹出过滤器屏障尖端并获取新的喷嘴，然后继续作，直到所有稀释液都已铺板。
从培养箱中取出准备好的板，因为它们已经耗尽，但一次不能超过六个，否则它们会冷却并且顶部 agros 凝固得太快，检查板上形成的斑块并丢弃那些汇合裂解的板。确定哪些剩余的连续稀释液产生了足够少的噬菌斑，以实现准确的 Cali记录这些板的噬菌斑数量，然后按照亲和选择结束时的文本方案中的说明继续计算滴度。第四轮，使用无菌黄色移液器吸头选择 18 个单独的定义明确的噬菌斑菌落。
在埃inor管中用盐酸tris pH 8.5润湿吸头内部。然后，通过将尖端直接穿过一个充分隔离的斑块推到下面的塑料培养皿中并吸出核心，将这些滴定板从滴定板中取芯，在涡旋之前将核心排出到适当的试管中的 100 微升盐酸 pH 8.5 的 tris 盐酸盐中。简而言之，从 65 摄氏度下加热 20 微升，然后按照此处显示的文本方案中所述进行 PCR 和测序，这是通过多次采样得出的典型滴度结果，最终估计的计数不易受到移液错误的影响，并且更准确地估计实际滴度和周围的变化。
随着亲和选择轮数的增加，优先增加非中毒诱饵的噬菌体滴度，估计井到孔。还可以提供该技术正在工作的信心。随着亲和选择数量的增加，在非中毒诱饵孔中保留含有噬菌体的插入片段的百分比增加，这也是在高级轮次亲和选择之后的吉祥之兆。
相对于第一轮，独立回收的具有插入片段的噬菌体数量增加，并且这些扩增子沉淀在几个相同大小的条带上，这很好地表明在亲和选择中选择了特定的克隆，遵循此程序。可以执行其他方法，如 ease two hybrid，以验证噬菌体展示发现的相互作用。
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概述
本文描述了用于识别蛋白质与固定饵分子相互作用的噬菌体展示技术。该协议允许高效的亲和力选择和相互作用物的鉴定。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质相互作用
- 噬菌体展示技术
- 亲和力选择
背景
- 噬菌体展示是一种研究蛋白质相互作用的方法。
- 它涉及cDNA文库的使用。
- 固定饵分子对于该过程至关重要。
- 该技术允许识别特定的相互作用物。
研究目的
- 发现蛋白质与固定饵分子的相互作用。
- 提供噬菌体展示的详细协议。
- 提高亲和力选择的效率。
使用的方法
- 饵分子的获取和固定。
- 将噬菌体文库引入饵中。
- 严格洗涤以去除未结合的噬菌体。
- 感染携带结合噬菌体的细菌以进行恢复。
主要结果
- 成功鉴定了蛋白质相互作用物。
- 高效地扩增了结合的噬菌体。
- 展示了该协议的有效性。
- 在各种生物学研究中的潜在应用。
结论
- 噬菌体展示是研究蛋白质相互作用的有价值工具。
- 描述的协议增强了鉴定过程。
- 进一步的研究可以扩大其在生物学中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Phage display enables high-confidence identification of protein-protein interactions through iterative affinity selection and titer monitoring, supporting target validation in early discovery. By requiring independent clone recovery and amplicon consistency, the method reduces false positives and increases predictive confidence in bait interactors. This workflow informs lead identification by prioritizing targets with reproducible binding evidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying proteins that consistently bind immobilized bait under stringent conditions.
- Operational Value: Supports biological de-risking through replicate screening and titer progression tracking to distinguish specific from nonspecific binding.
- Predictive Value: Increasing phage titer and insert retention across rounds provide quantitative evidence for target engagement strength and specificity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated phage libraries for downstream screening by enriching for high-affinity binders through controlled washing and amplification steps.
- Reproducibility: Monitoring phage titer after each selection round provides a quantifiable metric to assess selection efficacy and control consistency across replicates.
- Scalability: The protocol accommodates multiple baits in parallel using microtiter plates, enabling medium-throughput interaction profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Confirmed interactors from phage display can be forwarded to orthogonal validation (e.g., co-IP, yeast two-hybrid) to support preclinical target assessment.
- Mechanistic De-risking: Isolation of independent plaques and sequencing of amplicons helps confirm that observed binding reflects specific protein-protein interactions rather than artifacts.
- Risk-Adjusted Advancement: The settling of amplicons on identically sized bands after multiple rounds signals clonal enrichment, supporting go/no-go decisions in target prioritization.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead identification, providing biochemical evidence to inform downstream validation efforts.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about protein interactions by selecting for phage encoding proteins that bind bait under defined conditions.
- Screening: Generates enriched phage pools suitable for further characterization through iterative binding and amplification.
- Analytics: Titer measurements and amplicon analysis enable quantitative assessment of selection progress and clone enrichment.
- Translational Research: Identified interactors serve as candidates for functional validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: The standardized workflow can be applied across multiple baits and targets, supporting platform reuse in interaction discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by requiring reproducible recovery of independent clones presenting the same protein.
- Operational Value: Employs standardized washing, blocking, and infection steps to minimize variability and cross-contamination.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by filtering out nonspecific binders early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on binding consistency and enrichment metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology techniques including phage handling, bacterial culture, and nucleic acid manipulation.
- Depends on access to incubators, shakers, spectrophotometers, and centrifugation equipment for titer determination.
- Necessitates standardized reagent preparation (e.g., TBS, blocking agents) and strict adherence to washing protocols to control background.
- Involves adaptation considerations when using non-protein baits, as blocking and washing conditions may require optimization.
- Practical limitations include the time required for multiple affinity selection rounds and the need for careful plaque picking to avoid confluent lysis.
