Name: 一个协议，用于噬菌体展示和亲和选择以重组蛋白诱饵 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 学习噬菌体展示与亲和选择技术，利用固定化蛋白诱饵筛选蛋白质相互作用。该方法通过多轮亲和选择高效鉴定高亲和力结合蛋白，为蛋白质相互作用研究提供可靠实验方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本项目部分由美国国家科学基金会植物学部（NSF IOS，项目号0849230）、哈奇法案基金（Hatch）、麦克英泰尔-斯滕尼斯基金（AD421 CRIS）、美国农业部种子基金（2011-04375）以及授予ABD的弗雷德里克·麦克马斯特爵士研究奖学金资助。

<ol><li>Georgieva, Y., Konthur, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+screening+of+M13+phage+display+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Design and screening of M13 phage display cDNA libraries.</a> Molecules. 16, 1667-1681 (2011).</li>
<li>Beghetto, E., Gargano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda-display%3A+a+powerful+tool+for+antigen+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery.</a> Molecules. 16, 3089-3105 (2011).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORF+phage+display+to+identify+cellular+proteins+with+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">ORF phage display to identify cellular proteins with different functions.</a> Methods. 58, 2-9 (2012).</li>
<li>Willats, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display%3A+practicalities+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phage display: practicalities and prospects.</a> Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).</li>
<li>Konthur, Z., Crameri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+applications+of+phage+display+in+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Targets%22%5BJournal%5D)">High-throughput applications of phage display in proteomic analyses.</a> Targets. 2, 261-270 (2003).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+of+the+Arabidopsis+thaliana+protein+isoaspartyl+methyltransferase+1+identified+using+phage+display+and+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning.</a> J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).</li>
<li>Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+for+improved+protein+stability+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection for improved protein stability by phage display.</a> J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).</li>
<li>Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+LEA+proteins+and+other+hydrophilins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins.</a> Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).</li>
<li>Egli, D. B., Bruening, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source-sink+relationships%2C+seed+sucrose+levels+and+seed+growth+rates+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean.</a> Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).</li>
<li>Badotti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+the+mode+of+sucrose+utilization+by+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae.</a> Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).</li>
<li>Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Late+Embryogenesis+Abundant+%28LEA%29+Protein+Putative+Interactors+Using+Phage+Display%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).</li>
<li>Gasser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+conformational+stress+in+microbial+cells+producing+recombinant+proteins%3A+a+host+comparative+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview.</a> Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).</li>
<li>Daly, R., Hearn, M. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+heterologous+proteins+in+Pichia+pastoris%3A+a+useful+experimental+tool+in+protein+engineering+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production.</a> J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).</li>
<li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+protein+microarrays+for+the+high-throughput+identification+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions.</a> Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cold-shock+response+in+cultured+mammalian+cells%3A+Harnessing+the+response+for+the+improvement+of+recombinant+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production.</a> Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过在三个重复的孔中进行实验，即使为同一克隆（i.e. 所获得的CDS区域核苷酸序列无差异，但这些克隆来自独立的孔），也可区分结合诱饵的相同蛋白质的噬菌体。否则，只有当编码结合诱饵的相同蛋白质的噬菌体来自独立的逆转录区域，并且其核苷酸序列的某些部分存在差异时，才能加以区分。
使用一个 Fernbach 摇瓶培养所有用于扩增亲和筛选噬菌体的细菌，相比同时监测9个锥形瓶，可显著减少感染前细菌生长监测的工作强度。在感染前将这些细菌转移至预热的锥形瓶中，还可消除因个别锥形瓶中细菌生长不良导致的感染复数变化，从而避免亚文库滴度差异。因此，每轮之间噬菌体滴度的变化应主要取决于保留在孔中的噬菌体数量，而重复孔之间的滴度差异应极小。
使用噬菌体展示技术的一个显著优势在于，该方法能够高效地鉴定出对特定诱饵具有亲和力的噬菌体展示蛋白。由于噬菌体在BLT5403宿主中具有高效的复制能力，即使在第一轮亲和筛选中仅有一个代表稀有编码序列（CDS）的噬菌体被保留在某个孔中，只要其外壳融合蛋白对诱饵具有高亲和力，该噬菌体在第二轮筛选中就会...

为何要使用噬菌体展示和亲和筛选，而不是众多其他可用于发现和研究蛋白质与其他分子相互作用的技术？与其他检测蛋白质-配体相互作用的方法相比，噬菌体展示具有一些独特优势1-3，包括以下几点：
诱饵分子的种类非常广泛
最主要的原因在于能够作为亲和筛选诱饵的分子具有高度多样性 4。噬菌体展示是一种非常强大的技术，可用于分离能够与其它蛋白质、核苷酸、碳水化合物等等5&#160;相互作用的蛋白质片段。本质上，只要一种聚合物或分子能够被固定在可回收的载体上，就可以利用它来筛选与噬菌体展示蛋白具有亲和力的分子。此外，还可以对诱饵分子进行检测，以确定其在固定化后是否仍保留生物学活性6，验证用于降低或消除其活性的条件是否有效6，或者在亲和筛选前对诱饵分子引入翻译后修饰。
噬菌体对非特异性因素的抗性
使用噬菌体展示的第二个原因是，某些诱饵可能需要环境胁迫条件（如热、高渗透溶质浓度、特定辅因子， 等等.) 以捕获其相互作用的蛋白质，或者在进行亲和筛选之前可能需要对噬菌体展示的蛋白质进行某种修饰。研究的主要因素是诱饵蛋白与目标蛋白之间的相互作用，而非促成该相互作用发生的条件，或该相互作用是否对测试生物体具有致死性。T7噬菌体特别适用于此类研究，因为它在严苛的实验条件下仍能保持完整性和活性。例如 T7 存活性的已发表耐热上限约为 60 °C 7）。作为改变噬菌体展示蛋白的一个示例，在研究时 拟南芥 用于研究修复酶蛋白异天冬氨酸甲基转移酶（PIMT）底物蛋白的种子蛋白质组，本研究所用病毒为 &#34;老年&#34; 在每轮亲和筛选前，将样品置于上述条件下一周，以促进易感蛋白质中异天冬氨酸（isoAsp）残基的形成6 这在能够识别并修复/代谢此类异常的生物体中是不可能的。
代谢惰性
此外，噬菌体通常对代谢抑制剂和干扰性小分子具有抗性，这些物质至少会对代谢活跃的测试生物体产生多效性影响。在经过严格洗涤步骤后，先去除抑制剂，再引入大量细菌进行感染，从而使抑制剂被稀释至对细菌或后续噬菌体复制无害的浓度。在研究PIMT修复酶的蛋白质靶标时，使用S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）激活微孔板包被的酶，以促进靶蛋白的捕获，同时利用S-腺苷高半胱氨酸（AdoHcy）使酶失活，提供有效的阴性对照；可以确信的是，噬菌体不会受到AdoMet或AdoHcy的不利影响。6此外，某些晚期胚胎发生丰富蛋白&#160;本实验室研究的（LEA）蛋白家族已知在蔗糖等添加剂存在下会改变其构象8，可在大豆种子生理成熟时达到高达200 mM的浓度9该病毒预计不会受到每轮亲和筛选中添加200 mM蔗糖的影响，尽管蔗糖可能对某些LEA-客户蛋白相互作用是必要的，但这种情况不适用于自主存活的测试生物体10.
本实验室致力于研究成熟、脱水或萌发种子中蛋白质-蛋白质相互作用，这些相互作用是种子脱水过程中储存蛋白质组保护机制的基础11，或在种子吸水后修复易发生异天冬氨酸（isoAsp）修饰的储存蛋白质组组分的基础6。因此，制备并纯化作为诱饵所需的、具有活性的重组蛋白，并确保其在固定前后均保持活性，尽管常常具有挑战性，却是我们工作的基石。然而，由于每种重组蛋白的表达条件各不相同，本文不涉及重组蛋白表达条件的优化。建议使用者尽可能尝试确定固定后的蛋白质是否仍具功能活性（例如，若为酶类，可在微量滴定板孔中进行酶活性检测）。这将有助于确认诱饵蛋白具有生物学活性，从而提高所发现的相互作用具有生物学相关性的可能性。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Becton Dickinson 公司</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>研究产品国际公司</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>封闭试剂</td><td>EMD Chemicals 公司</td><td>69064</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; BLT5403</td><td>EMD Chemicals 公司</td><td>BLT5403</td><td>基因型：F- &lt;em&gt;ompT hsdS&lt;/em&gt;&lt;强&gt;&lt;sub&gt;B&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt; (r&lt;强&gt;&lt;sub&gt;B&lt;/sub&gt; - 米&lt;sub&gt;B&lt;/sub&gt; -) &lt;/strong&gt;&lt;em&gt;gal dcm&lt;/em&gt; pAR&lt;强&gt;&lt;sub&gt;5403&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt; (AmpR)</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>研究产品国际公司</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP102-1</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>Penta-HIS 一抗</td><td>Qiagen 公司</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠碱性磷酸酶偶联物</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>A-5153</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;para&lt;/em&gt;对硝基苯磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>N-7653</td><td></td></tr><tr><td>T7-UP 引物</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'</td></tr><tr><td>T7-DOWN 引物</td><td>EMD Chemicals 公司</td><td></td><td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen 公司</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick 凝胶回收试剂盒 </td><td>Qiagen 公司</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Big Dye Terminator v3.1 循环测序试剂盒</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>4336917</td><td></td></tr><tr><td>加热模块</td><td>Pierce化学公司（Thermo Fisher Scientific公司）</td><td>18780</td><td></td></tr><tr><td>96孔细胞培养板</td><td>康宁</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 培养箱烘箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>516D</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管，5 支 &amp;#190; 在</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>ChromaView 透射式凝胶成像仪</td><td>UVP 公司</td><td>TS-15</td><td></td></tr><tr><td>紫外线防护</td><td>Oberon</td><td>071AF</td><td></td></tr><tr><td>丁腈手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-170-010C</td><td></td></tr><tr><td>无菌 1.5 ml 离心管</td><td>USA Scientific 公司</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 硼硅酸盐吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25E</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐培养管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-27</td><td></td></tr><tr><td>Uniskan I 酶标仪</td><td>Labsystem 和 Flow Laboratories，赫尔辛基，芬兰</td><td>362型</td><td></td></tr></tbody></table>

使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

利用重组噬菌体作为支架，展示由定向克隆的cDNA文库编码的各种蛋白质片段，并将其与固定的诱饵分子进行孵育，是发现分子相互作用的有效方法。该技术迄今主要用于发现蛋白质-蛋白质相互作用，但所使用的诱饵分子并不局限于蛋白质。本文所述方案已优化，可对适量的诱饵分子进行重复筛选，以最大限度地识别出展示相同蛋白的独立克隆，从而提高所鉴定出的相互作用蛋白确实是诱饵分子真实互作伙伴的可信度。在每轮亲和筛选后监测噬菌体滴度，有助于了解亲和筛选的进展状况以及阴性对照的有效性。本文介绍了测定噬菌体滴度的一种方法，并说明了为使该过程尽可能高效而需预先准备的材料和步骤。同时强调了在分离独立噬菌斑后获得扩增产物的特征，可用于评估亲和筛选的进行效果。文中还解释了减少假阳性结果或绕过持续回收噬菌体的故障排除技术，并讨论了降低病毒污染爆发的策略。

能够抑制诱饵与噬菌体展示蛋白相互作用的能力（即对诱饵进行代谢抑制）可为该技术提供强有力的阴性对照。此外，建议验证诱饵在结合至微孔板孔壁后是否仍保持其功能。这两项验证均可提高实验结果的可信度，确保由未抑制的诱饵回收到的、能与之相互作用的噬菌体展示蛋白是真实有效的。
从每个孔中取三个重复样会显著增加亲和筛选过程中的时间和工作量，但相比仅取一次样，能更准确地估计每个孔中的滴度。尽管大多数重复样的滴度结果一致性较好，但请注意，在第四轮实验中BSA的第2个重复的三个重复样之间差异较大（表1）。通过多次取样，最终估算值对移液误差的敏感性降低，从而获得了更准确的实际滴度估计值以及孔间滴度变异程度的更可靠评估（表1，图5C）。
随着亲和筛选轮次的增加，针对非毒化诱饵的噬菌体滴度逐渐升高，表明该技术正在有效发挥作用（图5C）。同时，随着亲和筛选次数的增加，含有插入片段的噬菌体在非毒化诱饵孔中的保留比例也逐步上升...

噬菌体展示是一种强大的技术，可用于捕获与固定化目标分子相互作用的蛋白质或蛋白质片段。在确定了要构建和筛选的噬菌体cDNA文库类型后，本文所述方案可实现高效的亲和筛选，从而鉴定出相互作用分子。

利用重组噬菌体作为支架，将由定向克隆cDNA文库编码的多种蛋白质片段呈递给固定的诱饵分子

本实验的总体目标是发现与固定化诱饵分子相互作用的蛋白质。首先获取并固定诱饵分子，随后在促进结合的条件下，将待筛选的噬菌体文库引入诱饵中，从而实现这一目标。接着，通过严格的洗涤步骤去除未结合的噬菌体。而结合的噬菌体则用于感染细菌，随后进行回收。最后一步是扩增结合的噬菌体，以用于下一轮亲和筛选。最终，当噬菌体滴度达到平台期时，选择单个噬斑并进行测序，以确定在实验结合条件下对固定化的滞后链具有最高亲和力的蛋白质。该过程有助于解答蛋白质-蛋白质相互作用中的关键问题。该实验步骤始于将纯化的重组蛋白按照文本方案中的描述加入到微孔板底部。下一步是在一个250毫升的锥形瓶中，加入50毫升含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基，并接种一个先前按文本方案所述培养的单菌落，在37摄氏度、200转/分钟的水平摇床中培养，使用分光光度计监测细胞密度，直至600纳米处的光密度达到0.5至0.6。然后将菌液倒入一个50毫升Falcon管或其他类似容器中，置于4摄氏度保存备用，细胞通常可保持活性约一周。在第一天进行此操作。在第二天早晨，按照文本方案所述准备亲和筛选实验。将九个已灭菌的250毫升锥形瓶放入恒温摇床的夹具中，用前一晚接种的噬菌体感染的BLT 5 4 0 3细胞培养物中的500微升接种500毫升LAL布罗尼培养基。将锥形瓶放入培养箱后，打开分光光度计并设置为在600纳米处读取吸光度。同时，从4摄氏度取出微孔板，揭去塑料封膜。每孔加入200微升1倍浓度的Tris缓冲盐水（TBS，pH 7.5），洗涤10次，每次洗涤后将微孔板倒扣在纸巾上轻拍，以去除未结合的蛋白质。每孔加入 200 µL 含 5% 封闭试剂的 TBS 溶液，封闭 1 小时。用塑料膜包裹酶标板，用 200 µL 1×TBS-T 溶液洗涤 10 次，每次洗涤后将酶标板倒扣在四层纸巾上，吸干液体，两次洗涤之间用纸巾擦拭。此后，使用滤膜屏障吸头以避免噬菌体交叉污染。将100 µL噬菌体文库加入蛋白质中。用塑料封口膜重新密封培养板，并在室温下孵育1小时。一小时后，从培养板上取下封口膜，并立即通过振荡将噬菌体移至生物危害废物中。然后使用多通道移液器迅速向每个孔中加入 200 µL 的一种 X-T-B-S-T。设置计时器，计时一分钟。一分钟后，将缓冲液倒入生物危害废物容器中，将酶标板倒扣在纸巾上轻拍，然后放回实验台。在第10次洗涤后，重复洗涤步骤10次。从4°C的50毫升离心管中取出200微升BLT 5 4 0 3细胞，加入到已去除最后一次洗涤液的九个孔的每个孔底部。用塑料膜包裹平板，置于 37 摄氏度环境中 20 分钟，使仍附着在诱饵上的任何噬菌体在 20 分钟结束时感染细菌。揭开平板的塑料膜。接下来，从 25 摄氏度的 BSA 复制孔一中取出 10 微升细菌，转移至标记为一的 990 微升培养基中。对该孔再重复此过程两次，最终得到该孔噬菌体1:100稀释液的三个重复样本，即BSA第一次复制的三个取样。这些稀释液将用于估算该次BSA复制的平均滴度及其标准误。对BSA的第二次和第三次复制、毒化诱饵蛋白的三个重复孔以及诱饵蛋白组同样进行相同操作。将这27个EOR离心管放置一旁备用。如果锥形瓶中的细菌光密度值处于0.6至1.0之间，将50毫升菌液从三角烧瓶中倒入每个9个250毫升的锥形瓶中。取BSA复制第一孔中剩余的170微升噬菌体感染的BLT5403细菌，加入标记为BSA rep.One的50毫升细胞中。在将所有九个孔的溶液都进行此操作后，将锥形瓶置于37摄氏度培养箱中摇动。同时，从最初的27个稀释液中进行稀释操作：取Einor管1中含细菌的LB培养基100微升，加入Einor管中900微升的LB培养基中。对于10的负3次方稀释度，取四个样本，在从eInor管4中吸取100微升含细菌的LB培养基并加入到ePh管中900微升LB培养基之前，需将滤芯吸头弃去并更换新的吸头。对于10的负4次方稀释度，继续对所有蛋白质及处理组的所有三个重复样本进行稀释。待细胞裂解后，总共应有135个离心管。加入5毫升5摩尔/升的氯化钠储备液，将培养物调至0.5摩尔/升氯化钠浓度，然后将样品转移至已标记的离心瓶中，在4摄氏度下以8,000 × g离心10分钟。随后将含有病毒的上清液倾入干净且无菌的50毫升Falcon离心管中。向Falcon管中倾出的上清液加入几滴氯仿。上清液可在4°C下保存，用于第三天的下一轮亲和筛选。将250 µL VLT 5 4 0 3细胞从4°C取出，用移液器加入到先前准备好的编号硼硅酸盐试管中。然后，从爱诺管一的稀释液中吸取100 µL，加入到硼硅酸盐试管一中的250 µL细胞中。将移液器前五英寸部分短暂地在火焰上加热，然后插入熔化的顶部树脂中。吸取三毫升并迅速加入含有细胞和噬菌体的试管中。用一只手握住试管，另一只手轻弹试管使其混合均匀，然后将内容物倒入培养皿中。倾斜培养皿，并用试管驱赶气泡和干燥区域，直至整个培养皿表面被顶层琼脂完全覆盖。将其直立放置在实验台上冷却。丢弃硼硅酸盐管。弹出滤膜尖端，更换新的滤膜尖端，并继续操作，直至所有稀释液均完成涂布。从培养箱中取出已准备好的平板，随用随取，每次不超过六个，以免平板冷却过快导致顶层琼脂过快凝固。检查平板上形成的噬菌斑，弃去出现完全裂解的平板。确定剩余的系列稀释梯度中哪些产生的噬菌斑数量足够少，以便进行准确计数。记录这些平板上的噬菌斑数量，并按照亲和筛选末尾文本方案中所述方法计算滴度。第四轮：使用无菌黄色吸头挑选18个形态清晰、独立的噬菌斑克隆。用 pH 8.5 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）润湿微量移液器吸头内壁，操作在爱诺管（einor tube）中进行。然后通过将吸头穿过滴定板上分离良好的噬菌斑，直接插入下方的塑料培养皿中，吸取噬菌斑核心，并将芯体排入含有 100 微升（µL）pH 8.5 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的相应试管中，随后涡旋混匀。简要步骤：从此溶液中取 20 微升（µL），在 65 摄氏度（°C）加热 10 分钟，然后按照本文所示文本方案进行 PCR 扩增和测序。通过多次取样获得的典型滴度结果表明，最终估算值对移液误差的敏感性较低，因而能更准确地反映实际滴度及其周围变异情况。随着亲和筛选轮次的增加，非毒化诱饵孔中的噬菌体滴度显著升高，表明各孔间的估计值趋于理想。同时也验证了该技术的有效性。随着亲和筛选轮次的增加，非毒化诱饵孔中携带插入片段的噬菌体比例逐渐上升，此现象在多轮亲和筛选后尤为显著，具有积极意义。与第一轮相比，带有插入片段的独立回收噬菌体数量增加，且这些扩增产物集中在少数几条大小相同的条带上，这表明在亲和筛选过程中特定克隆正在被富集。通过噬菌体展示技术发现的相互作用，还可采用酵母双杂交等其他方法进行验证。

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一个协议，用于噬菌体展示和亲和选择以重组蛋白诱饵

基于亲合力的细胞外相互作用筛选（AVEXIS）用于可扩展检测低亲和力细胞外受体-配体相互作用

在本视频中，我们演示了噬菌体展示技术，用于分离表达对目标蛋白具有高亲和力蛋白的预先改造噬菌体。...

利用噬菌体展示技术筛选高亲和力靶蛋白的蛋白质

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。...

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

生物淘选细菌展示文库是发现肽类亲和试剂的一种成熟技术，可作为抗体的可靠替代方法。本文所述的半自动化分选方法简化了生物淘选流程，降低了假阳性结果的出现频率。本文将阐述在候选分子评估及减少下游分析工作量方面所采用的思路与技术。...

用于肽亲和试剂发现及分离株分析的细菌展示文库半自动生物筛选

本文所述方案可用于构建、表征和筛选（针对特定目标）来源于任意DNA样本的“"结构域组"文库。该流程通过整合多种技术实现：噬菌体展示技术、折叠报告系统、高通量测序以及用于数据分析的网络工具。...

相互作用组测序：通过噬菌体展示与下一代测序进行结构域组文库构建、验证与筛选的实验方案

本方案详细描述了构建具有定制多样性的噬菌体展示合成抗体文库的步骤。合成抗体在基础研究、疾病诊断和治疗中具有广泛的应用。...

构建具有定制多样性的合成噬菌体展示Fab文库

本文介绍一种筛选大肠杆菌（E.

细菌肽展示技术用于筛选新型生物素化酶

构建具有理想亲和力和特异性的、可被任意给定小分子配体化学诱导的蛋白质二聚化系统，在生物学检测与调控方面具有广泛的应用前景。本文中，我们描述了一种高效且可推广的从头设计化学诱导二聚化系统的方法，该方法通过逐步筛选噬菌体展示的组合型单域抗体文库来实现。...

通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

本研究旨在提出一种用于鉴定药物-肽相互作用的策略。该策略基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器进行识别药物的短肽的生物筛选，随后通过生物信息学分析，对获得的药物识别信息及蛋白质上药物结合位点的注释进行定量评估。...

基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

本文详细介绍了一种利用碱性磷酸酶偶联的ScFv...

利用D11 scFv-碱性磷酸酶融合蛋白和免疫荧光法直接检测组织中的异构左旋前列腺素

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰，其失调与多种人类疾病相关。本方案详细介绍了如何利用噬菌体展示技术分离新型泛素变体，这些变体能够结合并调控E3连接酶的活性，从而控制泛素化的特异性、效率和修饰模式。...

利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

学习噬菌体展示与亲和选择技术，利用固定化蛋白诱饵筛选蛋白质相互作用。该方法通过多轮亲和选择高效鉴定高亲和力结合蛋白，为蛋白质相互作用研究提供可靠实验方案。

使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

探索更多视频