可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

该可扩展流程的总体目标是利用高通量方法，从噬菌体展示文库中分离出针对数百种抗原靶标区域并行筛选的特异性强且高亲和力的Fab噬菌体克隆。该目标首先通过将纯化的抗原区域固定在微孔板中来实现，随后在多轮筛选中依次进行暴露、捕获、释放和扩增能够特异性结合微孔板上固定化抗原的Fab噬菌体克隆。

在此过程中，每一步均采用混合方法监测筛选的有效性。最后一步是评估分离得到的 Fab 克隆的特异性、亲和力和/或活性。最终可平行分离出针对大量抗原的特异性高亲和力 Fab 片段，从而获得可用于分析结构或功能相关蛋白质大类的抗体。

该方法的重要性在于，它提供了一种替代方案，有助于克服传统抗体开发技术的局限性，并加快学术或工业实验室中抗体研发的进程。与杂交瘤等传统抗体开发技术相比，该技术的主要优势在于无需使用动物，且几乎适用于任何蛋白质，包括有毒蛋白和非免疫原性蛋白。

正如我们将看到的，该方法易于实现并行化操作，最终可在短短六到八周内获得编码高亲和力抗体的可再生重组DNA，该抗体特异性针对特定抗原，并可用于标准的功能性免疫检测。鉴于抗体在生物医学研究中的重要性，我们认为有必要对抗原制备以及抗体的筛选与鉴定流程进行改进，以适应高通量模式，同时确保不同规模和资源条件的实验室均能便捷使用。在进行噬菌体筛选当天的早晨，挑取一个对T1噬菌体具有抗性的大肠杆菌单菌落。

将其加入含有50微克/毫升四环素的1毫升或2毫升YT培养基中。将菌落置于2.5厘米轨道摇床中，在200转/分钟的振荡条件下培养。当菌液生长明显可见时，将细胞转接到含有四环素的适量培养基中。

每个筛选孔需要准备100微升，即每个96孔板约需10毫升。将培养物等分扩增至含碳青霉烯和坎宁补充剂的培养基中。这些培养物可确保用于扩增的细胞免受预先感染。

当培养物在595纳米处的光吸收值达到0.4至0.8时，经过五到七小时后，细胞即可用于抗原板。为确保本方案中文库的预期覆盖度，请准备足够数量的重复抗原板以及非特异性对照蛋白板。

使用显示的计算细节在文本方案中提供。在目标蛋白和非特异性对照蛋白过夜固定后，从平板中移除蛋白溶液。加入200微升封闭缓冲液，振荡封闭一小时，并在添加噬菌体文库前将平板洗涤四次，此时细胞正在生长。

在噬菌体筛选当天，我们通过将100微升噬菌体文库转移至阴性筛选平板进行额外的阴性筛选，以预先去除文库中非特异性结合或标签特异性结合的展示FAB克隆的噬菌体。通过加入过量的可溶性亲和标签来去除标签结合型噬菌体。具体操作为：向每个样品中加入终浓度为10微摩尔的可溶性GST。

将平板在室温下于摇床上孵育1至2小时。为准备靶蛋白平板，从平板中吸出蛋白溶液，加入200微升封闭缓冲液，在摇床上封闭1小时，然后洗涤4次，再加入噬菌体文库。孵育结束后，从平板中收集噬菌体上清液。

使用96通道液体处理仪，将噬菌体上清转移至包被抗原的板孔中。随后在室温下于摇床上孵育1至2小时。孵育结束后，用PT缓冲液洗涤孔板8到15次，以去除未结合的噬菌体。

此步骤可手动操作，也可使用自动洗板机完成。在准备加入细胞前，当细胞和抗原板准备就绪时，需将所有多余的洗涤缓冲液彻底移除。通过向每个孔中加入 100 µL 的生长细胞，使噬菌体洗脱，并将板在 37 °C 下孵育 30 分钟。

最初的几轮筛选通常不会产生显著的富集效果，但通过定量测定输出噬菌体的滴度，可以确保达到成功筛选所需的最低噬菌体浓度。为此，可在加入辅助噬菌体之前，取出一部分细胞样品，通过制备细胞系列稀释液并涂布于添加抗生素的琼脂平板上，以测定噬菌体的输出量。孵育半小时后，向每个孔中加入M13KO7辅助噬菌体，使其终浓度为每毫升100亿个菌落形成单位。

将平板再次孵育45分钟，期间在200 RPM条件下振荡。接着，将细胞转移至含有V型底的96深孔板中，每孔加入1.2毫升添加了补充物的2×YT培养基。将深孔板于37摄氏度下振荡培养过夜，次日继续在200 RPM条件下振荡。

将培养皿在 4,000 ×g、4 °C 条件下离心 15 分钟，使细菌沉淀。然后从每个重复培养皿中取等体积含有噬菌体的上清液转移至微量离心管中。将 96 孔微孔板蓝色盒子用于后续筛选轮次中作为混合噬菌体的输入，加入十分之一体积的 10× PBT 并混匀以中和。

现在，从文库中重复筛选过程。使用上一轮筛选中扩增的噬菌体，进行三到四次的预清除和抗原噬菌体孵育。重复此步骤，直至观察到与非特异性对照蛋白相比，靶标结合富集现象。具体操作如下：使用每毫升含2微克抗原或对照蛋白的酶标板（ELISA微孔板），参照文库预清除和抗原噬菌体孵育的前述方法进行包被；随后像之前一样对包被了抗原和对照蛋白的酶标板进行封闭和洗涤。向各孔中加入100微升稀释后的噬菌体上清液，室温下振荡孵育15分钟。孵育结束后，用PT缓冲液洗涤酶标板八次。

洗涤后，向每孔中加入100 µL以PBT按1:5,000稀释的抗M13 HRP抗体，孵育半小时，使抗体与结合在抗原上的噬菌体结合。随后用PT缓冲液洗涤平板6次，再用PBS洗涤2次。配制并混匀TMB底物（1:1），向每孔中加入100 µL。反应5至15分钟，当出现明显颜色变化时终止反应。

通过加入100微升1摩尔的磷酸终止反应。随后在450纳米波长下读取各孔的吸光度，并将目标结合信号与对照蛋白的结合信号进行比较。富集后，可分离单个克隆，并通过测序噬菌体、将结合游离Fab的噬菌体DNA转化，以及利用克隆FabuLisa评估其与靶标的直接结合能力来表征克隆，具体方法如方案文本部分所述。

对于需要更高通量的实验室，该方法可进行规模放大并实现自动化。为此，已开发出定制化的机器人系统，可通过自动化操作包括封闭、噬菌体结合、结合及洗脱等在内的各个实验步骤，从而大幅提升筛选能力。用于抗体筛选的抗原获取策略之一，是利用合成基因技术获得用于表达分离蛋白结构域的构建体。

在大多数情况下，这能够实现高通量表达并分离出足够纯度和足量的抗原用于筛选。在连续多轮筛选过程中，通过噬菌体滴定（如前所述）或使用噬菌体文库，监测逃逸噬菌体的浓度以及特异性结合抗原的噬菌体的富集情况。在ELA检测中，结合比值大于2通常表明存在特异性结合的克隆。

相反，较低的比值有助于确定筛选失败的原因。利用比色氨基酸检测对克隆结合特性进行表征，可以比较 Fab 噬菌体或 Fab 与固定化抗原的结合能力与结合阴性对照蛋白的情况，从而在使用机器人液体处理系统进行筛选扩增和自动化时，提供特异性程度的评估。利用吸收性发色团有助于检测流路系统中特定通道是否发生堵塞或失去密封，导致液体输送体积不足，并可在优化洗涤步骤过程中辅助故障排查；使用已知的结合克隆可确保在洗涤过程中保留目标结合，同时去除背景结合。

此外，有效的去污染方案可确保在多轮筛选或不同筛选流程之间不存在交叉污染，文中还推荐了其他故障排除参数供参考。通过将该技术扩展至工业应用，我们希望帮助研究人员加速筛选和鉴定高亲和力的可再生抗体，从而探索结构或功能相关蛋白的完整类别，最终实现对蛋白质组最大程度的覆盖。