Name: 可扩展的高通量选择从噬菌体展示合成抗体库 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学习利用噬菌体展示合成抗体库进行可扩展的高通量选择，以同时针对数百种抗原靶点分离高亲和力Fab片段。该方法无需动物实验，可在六至八周内获得特异性抗体，适用于免疫学研究和生物医学应用。

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我们感谢美国国立卫生研究院共同基金——蛋白质捕获试剂项目对重组抗体网络抗体筛选与表征流程开发提供的资助，以及加拿大创新基金会对机器人筛选平台采购的资助。

<ol><li>Winter, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Man-made antibodies.</a> Nature. 349, 293-299 (1991).</li>
<li>Miersch, S., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antibodies%3A+concepts%2C+potential+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations.</a> Methods. 57, 486-498 (2012).</li>
<li>Schofield, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+phage+display+to+high+throughput+antibody+generation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization.</a> Genome Biol. 8, R254(2007).</li>
<li>Hust, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+scFv+antibody+generation+pipeline+for+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A human scFv antibody generation pipeline for proteome research.</a> J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).</li>
<li>Colwill, K., Graslund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).</li>
<li>Mersmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+proteome+scale+antibody+selections+using+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Towards proteome scale antibody selections using phage display.</a> Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).</li>
<li>Pershad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+a+panel+of+highly+specific+antibodies+to+20+human+SH2+domains+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display.</a> Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).</li>
<li>Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+panning+and+screening+procedure+on+microplates+for+antibody+generation+from+phage+display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries.</a> J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).</li>
<li>Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis: methods and applications.</a> Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).</li>
<li>Boersma, Y. L., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARPins+and+other+repeat+protein+scaffolds%3A+advances+in+engineering+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications.</a> 22, 849-857 (2011).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+tag+protein+fusions%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).</li>
<li>Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Comparison of affinity tags for protein purification.</a> Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).</li>
<li>Fellouse, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+synthetic+antibodies+from+highly+functional+minimalist+phage-displayed+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries.</a> J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).</li>
<li>Paduch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conformation-specific+synthetic+antibodies+to+trap+proteins+in+selected+functional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states.</a> Methods. 60, 3-14 (2013).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Huang, H., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+binding+specificities+of+peptide+recognition+modules+by+high-throughput+phage+display+selections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections.</a> Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).</li>
<li>McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+analysis+of+peptide-recognition+domain+specificities+by+phage+display+and+deep+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing.</a> Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>den Engelsman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+assessment+of+protein+aggregates+in+pharmaceutical+biotech+product+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development.</a> Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).</li>
<li>Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+thermal+scanning%3A+a+general%2C+rapid+dye-binding+thermal+shift+screen+for+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).</li>
<li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFellouse%2C+FA+%22Making+antibodies+in+bacteria.+in+Making+and+Using+Antibodies%3A+A+Practical+Handbook%22">Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook</a>. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).</li>
<li>Acton, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+protein+samples+for+NMR+structure%2C+function%2C+and+small-molecule+screening+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies.</a> Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).</li>
<li>Mahon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+interrogation+of+a+minimalist+synthetic+CDR-H3+library+and+its+ability+to+generate+antibodies+with+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential.</a> J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).</li>
<li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).</li>
<li>Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+natural+antibodies%3A+the+power+of+in+vitro+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

当进行 体外 抗体筛选中，决定筛选成功与否的两个主要因素是：1）分离出正确折叠的抗原靶标用于筛选；2）具备功能多样性高的抗体文库。&#160; 在许多情况下，获得足量正确折叠的全长蛋白质可能受限。&#160; 克服这一局限性的一种方法是利用生物信息学分析鉴定出的结构域22 并合成用于插入带有适当亲和标签的细菌表达载体中。
在生物技术应用中，有多种标签可用于提高溶解度、促进纯化以及稳定不稳定的结构域。11 几乎能够合成任何所需插入序列的能力，使得抗原生成平台具有高度的多功能性。尽管谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签形式较为常见，但此前已成功使用六组氨酸（hexahistidine）、Fc、Halo、麦芽糖结合蛋白以及位点特异性生物素化标签，并且认为还有大量其他亲和标签可被优化后用于类似的平台。然而，亲和标签在后续应用中可能带来有益效果，也可能产生非预期的负面影响，11 因此在基于特定形式建立实验流程之前，应对其进行全面研究。
新用户常会提出如何评估...

随着后基因组时代的到来，获得高质量的结合试剂以表征和调控蛋白质，对于开拓新的研究方向和治疗途径至关重要。抗体作为基础研究、诊断工具以及潜在治疗手段，对学术界和工业界的研究人员而言仍然具有关键作用。毫不奇怪，合同制抗体开发公司数量显著增长，其中大多数公司依赖传统的杂交瘤技术来制备定制抗体。然而 体外 利用噬菌体展示抗体文库进行筛选正成为一种强大的替代技术，在传统技术可能遇到局限的情况下，该技术可提供独特的优势并取得成功1, 2.
鉴于科研工具对抗体质量的高要求，可再生抗体的制备面临两个主要挑战：1）筛选通量；2）抗原的可获得性。目前已有多个研究团队报道了旨在提高通量和抗体鉴定速度的体外筛选流程。这些研究详细描述了多种可行的方法，包括以全长靶标3,4或结构相关的结构域5,6,7为筛选对象，采用基于微珠6,8或基于微孔板3,4的抗原固定策略。此外，基因合成技术的广泛应用9使得系统性抗原制备（尤其是独立结构域）的成本显著降低，有望缓解获取足量纯化全长抗原的困难。通过将上述两种技术结合，研究人员设计出一个自成体系且可扩展的抗原制备与抗体筛选流程，能够并行分离大量表达抗原结构域的抗体，从而促进针对结构或功能相关蛋白家族的整类检测试剂的开发。
为实现这一目标，已开发出一种整合式流程，该流程结合了抗原可表达结构域的计算机预测、基因合成、高通量细菌表达抗原以及可放大的噬菌体展示抗体筛选。该流程仅需大多数生命科学实验室普遍具备的基础设备（包括可通过许可协议或材料转移协议获得的抗体文库），同时也适用于自动化操作，可用于工业化规模生产。利用本方案，可生成数百种带亲和标签的抗原结构域，并能常规性地分离出针对其中多种抗原的高特异性抗体片段。
噬菌体展示技术已展现出与多种重组亲和试剂格式的兼容性，包括 Fab、scFv 和自主 Fv 结构域，以及日益增多的小型“替代支架”（如设计的锚蛋白重复蛋白（DARPINS）、纤连蛋白（Fn）、载脂蛋白结构域等10）。本示例仅限于讨论 Fab 抗体片段的筛选，尽管这些方法可被调整用于其他类型的文库。&#160; 利用该技术，已成功筛选出对小分子标记蛋白结构域（包括转录因子结构域、SH2 结构域、RNA 结合蛋白等）具有低纳摩尔亲和力的 Fab 片段，其中许多片段可结合全长蛋白，并在免疫荧光、免疫沉淀和免疫组织化学等免疫检测中具有功能。重要的是，这些重组结合克隆具有完全可再生性，可通过细菌表达系统从表达载体中重新制备，从而提高一致性、可重复性和成本效益，因此证明了严格克隆验证所需投入的合理性。
在本实验方案及配套视频中，展示了利用固定化抗原结构域从噬菌体展示文库中筛选抗体的基本方法。该方法采用通过被动吸附固定于微孔板中的GST标签蛋白结构域，尽管其他标签11,12,13和筛选形式13,14,2也已成功应用。文中详细阐述了筛选实验设置与操作过程中的关键考虑因素，并对筛选参数进行平行监测，旨在识别和分离特异性富集的单克隆抗体以进行后续验证。

<table><tbody><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova44 可堆叠培养摇床</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Liquidator 96 通道手动台式移液系统</td><td>Anachem Ltd</td><td>LIQ-96-200</td><td></td></tr><tr><td>微孔板摇床</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Sorvall ST-40 台式离心机</td><td>Thermo Product</td><td>75004525</td><td></td></tr><tr><td>ELx405 Select 深孔微孔板洗板机</td><td>Biotek</td><td>ELX405USD</td><td></td></tr><tr><td>定制高通量自动化噬菌体筛选机器人</td><td>S&amp;P Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料锥形 Falcon 管：50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>塑料锥形 Falcon 管：15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 1.7 ml 微量离心管</td><td>Corning</td><td>MCT-175-L-C</td><td></td></tr><tr><td>96 孔/384 孔 Maxisorp 板</td><td>Sigma</td><td>M9410-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 孔 V 型底深孔板</td><td>Corning</td><td>3960</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Mini-tube 96 孔无菌微孔板蓝色盒装</td><td>Corning</td><td>AXY-MTS-06-C-R-S</td><td></td></tr><tr><td>透气性粘性微孔板封膜</td><td>VWR</td><td>60941-084</td><td></td></tr><tr><td>试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>名称</td><td>公司</td><td>货号</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.1</td><td></td></tr><tr><td>生物蛋白胨</td><td>Bioshop</td><td>TRP402.1</td><td></td></tr><tr><td>N-Z 胺</td><td>Sigma</td><td>C7290</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>乳糖</td><td>Bioshop</td><td>LAC234</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.500</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素&amp;nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>CAR544.10</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Bioshop</td><td>KAN201.25</td><td></td></tr><tr><td>四环素&amp;nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>TET701.25</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Bioshop</td><td>PPM302.1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Anachemia</td><td>84486-440</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.10</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Bioshop</td><td>POC308.1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Bioshop</td><td>CCL302.500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Bioshop</td><td>MAG510.500</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>SOS513.500</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA 凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>磷酸</td><td>Acros Organics</td><td>201140010</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.25</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶</td><td>Novagen</td><td>71205</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Bioshop</td><td>TRX506.500</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 树脂&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>1,000 倍辅助噬菌体（M13K07）储备液（每毫升含 10&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt; 噬菌体）</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的 M13 特异性抗体（抗-M13-HRP）</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9241-01</td><td></td></tr><tr><td>TMB 底物：等体积混合 TMB 与 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 过氧化物酶底物&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Biobasic</td><td>DD0056</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>Genscript</td><td>E00007</td><td></td></tr><tr><td>外切核酸酶</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>EZ0073X-EZ</td><td></td></tr><tr><td>虾碱性磷酸酶</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z-EZ</td><td></td></tr></tbody></table>

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

满足基础研究和临床研究应用需求的抗体需求量很高，并且未来将急剧增加。然而，传统的单克隆抗体技术显然已无法单独胜任这一任务。这促使人们开发出替代方法，以满足针对整个可及蛋白质组元件的高质量、可再生亲和试剂的需求。为此，已设计出用于从噬菌体展示的合成抗体文库中进行高通量筛选的方法，适用于多种抗原，并针对快速通量和高成功率进行了优化。本文详细描述了一种实验方案，通过视频演示，展示了如何利用手动96通道液体处理仪或自动化机器人系统，从高多样性文库中平行筛选出针对数百个靶标的Fab-噬菌体克隆。采用该方案，单个研究人员可在6至8周内生成数百种抗原，平行筛选出相应抗体，并完成抗体结合能力的验证。本文重点强调了以下四个方面：i）一种可行的抗原形式；ii）筛选前的抗原表征；iii）影响特异性及高亲和力克隆筛选的关键步骤；以及iv）监测筛选效率和早期抗体克隆表征的方法。通过该方法，我们已获得针对多种靶标类别的合成抗体片段（Fab），包括单次跨膜受体、分泌型蛋白激素以及多结构域胞内蛋白。这些片段可轻松转化为全长抗体，并经验证具有高亲和力和高特异性。此外，这些抗体片段已在多种标准免疫检测中证实具有功能性，包括Western印迹、ELISA、细胞免疫荧光、免疫沉淀及相关检测。该方法将加速抗体的发现进程，并最终推动实现针对整个蛋白质组生成可再生、高质量抗体的目标。

本方案已用于并行地从组合型噬菌体展示Fab文库中分离出针对多种结构相关和功能相关抗原结构域的抗体片段。在许多情况下，可通过计算机模拟识别出适合抗体筛选的可表达抗原结构域，从而规避与抗原可获得性相关的问题23。通过在同一实验室中将抗原表达与抗体筛选相结合（图1），可建立一体化的筛选流程，从而更易于控制对抗原筛选至关重要的抗原参数。在大多数情况下，通过仔细确定结构域边界，可在96孔或24孔深孔板中实现高通量表达，并获得足够纯度和数量的抗原，用于后续成功的抗体筛选（图2）。在筛选过程的连续多轮中，可通过噬菌体滴定法（图3）或ELISA检测噬菌体库，监测洗脱噬菌体的浓度以及特异性结合抗原的噬菌体的富集情况（图4）。结合比值（>2）通常表明存在特异性结合的克隆；相反，较低的比值（<2）有助于判断筛选失败的原因。例如，若比值<2且非特异性光密度值较高，则提示非特异性克隆（或粘性结合物）去除不充分，可能需要进一步优化筛选方案。一旦检测到富集现象，即可分离单个高亲和力克隆，进行测序和表征。克隆的结...

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。

满足基础与临床研究应用需求的抗体需求量很高，并将在未来显著增长。

本可扩展流程的总体目标是利用高通量方法，从噬菌体展示文库中分离出针对数百种抗原靶标区域并行筛选的特异性强且高亲和力的Fab噬菌体克隆。该目标首先通过将纯化的抗原区域固定在微孔板中来实现，随后在多轮筛选中依次进行暴露、捕获、释放和扩增能够特异性结合微孔板上固定抗原的Fab噬菌体克隆。在此过程中，每一步均采用混合方法监测筛选的有效性。最后一步是评估分离得到的 Fab 克隆的特异性、亲和力和/或活性。最终可平行分离出针对大量抗原的特异性高亲和力 Fab 片段，从而获得可用于分析结构或功能相关蛋白质大类的抗体。该方法的重要性在于，它提供了一种替代方案，有助于克服传统抗体开发技术的局限性，并加快学术或工业实验室中抗体研发的进程。与杂交瘤等传统抗体开发技术相比，该技术的主要优势在于无需使用动物，且几乎适用于任何蛋白质，包括有毒蛋白和非免疫原性蛋白。正如我们将看到的，该方法易于实现并行化操作，最终可在短短六到八周内获得编码高亲和力抗体的可再生重组DNA，该抗体特异性针对特定抗原，并可用于标准的功能性免疫检测。鉴于抗体在生物医学研究中的重要性，我们认为有必要对抗原制备以及抗体的筛选与鉴定流程进行改进，以适应高通量模式，同时确保不同规模和资源条件的实验室均能便捷使用。在进行噬菌体筛选当天的早晨，挑取一个对T1噬菌体具有抗性的大肠杆菌单菌落。将其加入含有50微克/毫升四环素的1毫升或2毫升YT培养基中。在2.5厘米轨道摇床中，以200转/分钟的转速振荡培养菌落。当菌液生长明显可见时，将菌体转移至含有四环素的适量培养基中。每个筛选孔需要有100微升，即每个96孔板约需10毫升。将培养物等分扩增至含碳青霉烯和坎宁补充剂的培养基中。这些培养物可确保用于扩增的细胞无预先感染。当培养物在595纳米处的光吸收值达到0.4至0.8时，经过五到七小时，细胞即可用于抗原板。为确保本方案中文库的预期覆盖度，请准备足够数量的重复抗原板以及非特异性对照蛋白板。使用显示的计算细节在文本方案中提供。在目标蛋白和非特异性对照蛋白过夜固定后，从平板中移除蛋白溶液。加入200微升封闭缓冲液，振荡封闭一小时，并在加入噬菌体文库前将平板洗涤四次，此时细胞正在生长。在噬菌体筛选当天，我们通过将100微升噬菌体文库转移至阴性筛选板中进行额外的阴性筛选，以预先去除文库中非特异性结合或标签特异性结合的展示FAB克隆的噬菌体。通过加入过量的可溶性亲和标签来去除标签结合型噬菌体。具体操作为：向每份样品中加入终浓度为10微摩尔的可溶性GST。随后将培养板置于摇床上，室温孵育1至2小时。为制备靶蛋白包被板，从板中吸去蛋白溶液，每孔加入200 µL封闭缓冲液，振荡封闭1小时，然后洗涤4次，再加入噬菌体文库。孵育结束后，从培养板中收集噬菌体上清液。使用96通道液体处理仪，将噬菌体上清转移至包被抗原的酶标板中。随后在室温下于摇床上孵育1

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

可扩展的高通量选择从噬菌体展示合成抗体库

在本视频中，我们演示了噬菌体展示技术，用于分离表达对目标蛋白具有高亲和力蛋白的预先改造噬菌体。...

利用噬菌体展示技术筛选高亲和力靶蛋白的蛋白质

噬菌体展示是一种强大的技术，可用于捕获与固定化目标分子相互作用的蛋白质或蛋白质片段。在确定了要构建和筛选的噬菌体cDNA文库类型后，本文所述方案可实现高效的亲和筛选，从而鉴定出相互作用分子。...

使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

本文所述方案可用于构建、表征和筛选（针对特定目标）来源于任意DNA样本的“"结构域组"文库。该流程通过整合多种技术实现：噬菌体展示技术、折叠报告系统、高通量测序以及用于数据分析的网络工具。...

相互作用组测序：通过噬菌体展示与下一代测序进行结构域组文库构建、验证与筛选的实验方案

本方案详细描述了构建具有定制多样性的噬菌体展示合成抗体文库的步骤。合成抗体在基础研究、疾病诊断和治疗中具有广泛的应用。...

构建具有定制多样性的合成噬菌体展示Fab文库

构建具有理想亲和力和特异性的、可被任意给定小分子配体化学诱导的蛋白质二聚化系统，在生物学检测与调控方面具有广泛的应用前景。本文中，我们描述了一种高效且可推广的从头设计化学诱导二聚化系统的方法，该方法通过逐步筛选噬菌体展示的组合型单域抗体文库来实现。...

通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

本研究旨在提出一种用于鉴定药物-肽相互作用的策略。该策略基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器进行识别药物的短肽的生物筛选，随后通过生物信息学分析，对获得的药物识别信息及蛋白质上药物结合位点的注释进行定量评估。...

基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰，其失调与多种人类疾病相关。本方案详细介绍了如何利用噬菌体展示技术分离新型泛素变体，这些变体能够结合并调控E3连接酶的活性，从而控制泛素化的特异性、效率和修饰模式。...

利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

本方案描述了进行酵母表面展示筛选实验的关键步骤，以富集能够结合目标抗原的蛋白质变体。...

利用酵母表面展示技术进行蛋白质工程

本方法描述了利用基于红外染料的成像系统，以高灵敏度检测感染小鼠支气管肺泡灌洗（BAL）液中的H1N1病毒。该方法可在96孔或384孔板中进行，所需检测样品体积小于&lt;10...

高通量流感病毒检测方法

介绍了两种不同的根结线虫植物筛选方法。所述方法包括以非破坏性方式对线虫进行高通量筛选，从而便于将这些植物用于育种项目。...

高通量与低通量根结线虫筛选 Meloidogyne spp.

学习利用噬菌体展示合成抗体库进行可扩展的高通量选择，以同时针对数百种抗原靶点分离高亲和力Fab片段。该方法无需动物实验，可在六至八周内获得特异性抗体，适用于免疫学研究和生物医学应用。

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

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