Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

这种体外方法的总体目标是生成三维细胞培养球体，从而能够测试当前头颈部鳞状细胞癌的标准或实验治疗方案。这种方法有助于我们了解头颈部癌细胞在接受放射或化疗时肿瘤的三维生长。仍然需要说的是，处理原代肿瘤细胞是困难的，并且并不总是导致可靠的三维球状体形成。

演示该程序的是我们实验室的技术人员 Sabina Schwenk-Zieger。在使用来自肿瘤标本的原代细胞时，将标本放在合适且无菌的表面上，并用无菌的一次性手术刀将其彻底切成非常小的块。在对原代组织进行充分的机械分离后，将其转移到含有胶原酶 1 和 2 的小瓶中，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。

接下来，通过 70 微米的 Falcon 细胞过滤器筛分混合物，并用 HBSS 洗涤悬浮液。成功分离和随后洗涤后，将含有 1 至 200 万个细胞的悬浮液转移到 T75 细胞培养瓶中，在 37 摄氏度下生长至亚汇合状态，最长可保存 10 天。在显微镜下，确认肿瘤细胞生长。

对培养物中的细胞进行计数。使用凹圆底的超低粘附力 96 孔板，将 5， 000 个原代肿瘤细胞或 1， 000 至 2， 000 个中间细胞系细胞，在 200 至 300 微升培养基中接种到孔中。接下来，在 37 摄氏度下培养细胞。

每隔一天执行一次介质更改。注意在更换培养基期间不要用移液器吸出球状体。培养球体，直到观察到三维球状细胞团。

请记住，将形成不规则或多个球体的孔排除在进一步研究之外。随后，将培养基更换为含有所需浓度的化疗药物和/或单克隆抗体的培养基。添加浓度为 2.5、5 或 10 微摩尔的顺铂或 30 微摩尔的 5-氟尿嘧啶。

在此过程中，使用图形软件在第 6 天、第 10 天和第 16 天测量数码照片记录后的球体大小。将板以 520 g 离心 2.5 分钟后，去除上清液。接下来，用 1x PBS 洗涤细胞并再次离心板，然后去除上清液。

接下来，向每个小瓶中加入 100 μL 酶细胞分离溶液，使球体溶解。随后，将板在 37 摄氏度下孵育 8 分钟。在显微镜下检查球体是否成功溶解。

添加 100 微升 DMEM。接下来，将板以 520 g 离心 2.5 分钟。然后去除上清液，将细胞悬浮在 100 微升 DMEM 中。

随后，如有必要，进行市售的比色增殖测定，并在 ELISA 读数仪中读取该测定结果。所有细胞系都可以产生可靠的球体，但大小和读数时间不同。原代细胞确实在超低附着板中形成了可重复的球状体。

Ki-67 染色显示培养物的外围显示出比中央细胞高得多的增殖率，模拟了通常显示坏死核心的实体粘膜肿瘤中的营养分布。在这里，几种化疗疗法和放疗对球体大小的影响。与单独使用顺铂相比，在用顺铂治疗前用两种灰度放疗导致球体大小显着减小。

随着从原代人类细胞生成球状体的进一步建立，这就是治疗测试概念的实施方式。肿瘤活检后将生成球状体，然后测试分子特征和治疗敏感性。我们能够建立一种方案，从细胞系和原代人肿瘤细胞的细胞悬液中生成可重复的球状体。

这种多模式测定足够敏感，可以识别组之间的微小差异。将来，该测定可用于首先评估个体对标准和实验性治疗方案的反应。其次，进一步表征新鲜标本的肿瘤细胞。

第三，将治疗反应与分子模式相关联。原代细胞的使用和球体的产生将允许保留尽可能多的体内肿瘤生长特征，并结合具有成本效益的测定来研究个体治疗反应。