Name: 基于球形的头颈部鳞状细胞癌3D 细胞培养模型的治疗试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 了解基于球形的头颈部鳞状细胞癌三维细胞培养模型，用于评估放疗和化疗的疗效。该方法利用原代肿瘤细胞形成球状体，帮助研究人员在体外模拟肿瘤生长并测试个体化治疗方案。

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本项目由慕尼黑大学资助（FöFoLe项目编号：789-781）。

本论文中所示的所有研究，即人类肿瘤标本的使用，均受美因茨大学医学中心/慕尼黑大学医学中心伦理委员会先前决定的保护，并符合其规定。患者已根据国家法律法规签署知情同意书，同意将其治疗过程中产生的多余生物材料用于科学研究。本研究的开展严格遵守所有机构、国家及国际关于人类福祉的指导原则。
1. 头颈部鳞状细胞癌的肿瘤活检取样
<ol>
	<li>在手术室或耳鼻喉科检查椅上实施全身麻醉（丙泊酚和/或七氟烷、肌松剂）或局部浸润麻醉（2% 超卡因，含肾上腺素）/表面麻醉（利多卡因）。使用标准手术器械观察口腔/咽部/喉部/上消化道和呼吸道其他部位的肿瘤组织，必要时在显微镜下进行。</li>
	<li>使用钝性或切割器械从癌变病灶边缘获取新鲜肿瘤活检组织。避免采集病灶中心区域，因该区域常有大量坏死。将获取的组织置于含等渗氯化钠溶液的无菌容器中。</li>
	<li>活检后，根据需要进行止血。 例如，除使用血管收缩物质外，还可采用双极或单极凝固装置。</li>
	<li>将拟用于细胞培养实验的肿瘤活检样本直接送至相邻的实验室区域。其余肿瘤活检样本按常规送至病理科，以排除癌症诊断。</li>
	<li>确保有实验室技术人员随时准备直接处理样本。</li>
</ol>
2. 肿瘤标本的处理
<ol>
	<li>将肿瘤标本置于合适且无菌的表面上，使用无菌一次性手术刀将其尽可能彻底地切成小块。 
	注意：务必确认传染性疾病和血源性疾病的状况已充分记录，并确保技术人员了解所在机构的标准操作规程，以防止被可能具有生物危害性的患者材料造成针刺伤或切割伤，并熟悉发生可能受伤后的处理流程。</li>
	<li>在充分进行机械分离原代组织后，将组织放入含有胶原酶 I/II 的小瓶中，在 37 °C 下孵育 1 小时。用 70 µm 的 Falcon 细胞滤网过滤，并用 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞悬液。</li>
	<li>成功分离并完成后续洗涤后，将含有 1–2 × 106 个细胞的细胞悬液接种至 T75 细胞培养瓶（75 cm2）中，在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养至亚汇合状态。此步骤可能需要长达 10 天。
	<ol>
		<li>使用特制的角质形成细胞培养基，其组分如下：125 mL 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、250 mL 补充型角质形成细胞培养基（补充型培养基由 500 mL 角质形成细胞无血清培养基、15 mg 牛垂体提取物（BPE）、2.5 mL 青霉素/链霉素、150 ng 重组人表皮生长因子（EGF）、516 µL 300 mM CaCl2 组成，需预先配制成储备液）、125 mL F12 营养混合物、10 mg BPE（0.75 mL）、75 ng 重组人 EGF（2 µL）、3.75 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽（材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将细胞接种至超低吸附细胞培养板
<ol>
	<li>在显微镜下确认肿瘤细胞生长情况。对培养物（原代细胞或细胞系）中的细胞进行计数，并将5,000个原代肿瘤细胞或1,000–2,000个中间细胞系/其他细胞系细胞接种于200–300 µL培养基中（步骤3.2），接种至具有凹形圆底的超低吸附培养板（96孔板）中。</li>
	<li>将细胞在5% CO2、37 °C条件下培养，使用等体积混合的DMEM和气道上皮细胞培养基（BEGM），并添加10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1%丙酮酸钠、1%非必需氨基酸和1% L-谷氨酰胺（步骤2.3）。若使用细胞系，则以DMEM为基础的培养基已足够。
	<ol>
		<li>每隔一天更换一次培养基。换液时注意避免用移液器吸走类球体结构。持续培养类球体，直至达到步骤3.3中所述的生长程度（约7–10天）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜下观察是否存在三维结构、呈球形的细胞聚集体，以确认类球体是否自发形成。将出现不规则或多个类球体形成的孔排除在后续实验之外。 
	注意：类球体也应肉眼可见，便于后续操作及如下所述的培养基更换。</li>
</ol>
4. 对类球体进行多模式标准或实验性肿瘤治疗处理
<ol>
	<li>选择一种理想的治疗方案。设计足够大的对照组，以便将治疗组与未经治疗的类球体或仅接受部分治疗方案的类球体进行比较。 例如仅辐射处理。对照组的大小取决于实验组的设计，无法一概而论。</li>
	<li>更换为含有添加剂的培养基，即含有化疗药物和/或单克隆抗体且浓度符合实验要求的培养基。加入顺铂（Cisplatin），使其终浓度为 2.5/5/10 µM，或加入 5-氟尿嘧啶（5FU），使其终浓度为 30 µM。 
	注意：对于高通量实验或大样本量/多组别实验，可使用自动移液机器人，我们将在后续实验中进一步建立该方法。</li>
	<li>或者，使用合适的辐射设备对含有类球体的细胞培养板进行2 Gy辐照。 
	注意：遵守机构关于防止员工受到有害辐射暴露的规程。仅可按照辐射防护指南，由指定且经过培训的技术人员进行操作。如需，可在之后按照4.2节所述添加化疗药物。</li>
	<li>在先前所述的培养条件下（37 °C，步骤 3.2）将细胞孵育 24 小时。</li>
	<li>孵育后，继续培养细胞至少6天，每隔一天更换一次培养基。</li>
</ol>
5. 类球体大小及细胞增殖程度的评估用于实验检测读数
<ol>
	<li>在第6天（第10天、第16天）对类球体进行数码拍照记录后，使用图形软件测量其面积大小（参数1）。</li>
	<li>将培养板在520 × g条件下离心2.5分钟，吸除上清液。用足量的1× PBS洗涤细胞，按前述方法再次离心培养板，随后吸除上清液（PBS）。</li>
	<li>向每个小瓶中加入100 µL酶解细胞解离溶液，使类球体溶解。将培养板在37 °C孵育8分钟。</li>
	<li>在显微镜下检查类球体是否完全溶解。加入100 µL DMEM。在520 × g条件下离心2.5分钟，吸除上清液，并将细胞重悬于100 µL DMEM中。</li>
	<li>按照生产商说明书，对每个小瓶进行商用比色法增殖检测，例如WST-8检测25。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）读板仪读取结果（参数2）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们成功建立了一种从细胞悬液中生成可重复性球体的实验方案，该方案适用于细胞系，并在初步实验中也成功应用于原代人肿瘤细胞。我们首先评估了两种既往报道的方法，发现ULA法（即使用超低黏附表面培养板的方法）在生成均一的三维球体方面更为安全可靠。通过结合两种独立的检测读出方法（尺寸/面积和细胞活力），该多模态检测具有足够的灵敏度，能够识别组间微小差异。这是验证技术可行性的第一步，为将来将该检测整合入本院三级医疗中心临床路径奠定了基础。未来该方法可应用于：（i）评估个体肿瘤对常用一线或二线/三线治疗方案（化疗试剂、放疗）及实验性治疗方案的敏感性；（ii）进一步表征新鲜标本来源的肿瘤细胞，并将分子表面或胞质表达模式与治疗反应相关联。来自不同肿瘤部位标本的球体， 例如，原发性和淋巴结转移是可能的。
在建立本实验方案和方法的过程中，我们使用了多种已知的细胞系，其中一些细胞系已被广泛使用数十年。细胞系的使用年限本身引发了它们与当前实际人类肿瘤细胞之间关联性和可比性的疑问，这些细胞系可能已丢失了若干特性和标志性的分子标记。体外（in vitro）实验的结果在人体或体...

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见癌症，其发病率近年来呈上升趋势，其中部分病例与黏膜人乳头瘤病毒（HPV）感染相关的发病机制有关，而大多数病例则由过量摄入尼古丁和酒精引起1,2。尽管较小的肿瘤和癌前病变通常可通过手术切除治疗（通常联合颈部淋巴结清扫），但晚期及复发性HNSCC的治疗仍具挑战性，主要由于肿瘤具有侵袭性强、易发生转移扩散，以及对放疗和化疗方案产生耐药性3,4,5,6,7,8。近期研究表明，肿瘤细胞表型具有高度异质性，而对循环肿瘤细胞和播散性肿瘤细胞的亚群分类研究才刚刚起步9,10。过去数年中的最新研究已推翻了早先认为肿瘤为结构致密且均一组织的观点11,12,13,14。目前用于肿瘤特征分析和关键突变识别的方法虽已鉴定出多个可能与治疗耐药性相关的基因，但这类方法成本较高。此外，基因型的信息并不总能可靠地预测表型及其对治疗的反应。
对于晚期及复发性疾病，总体生存率和无病生存率的改善进展甚微。对于尼古丁以及病毒相关性癌，除手术外，目前的治疗选择包括强化放疗和基于铂类的化疗方案。人乳头瘤病毒（HPV）阴性与阳性癌之间的治疗反应率可能存在差异，但这一发现尚未导致常规治疗指南的改变。对放疗和化疗的耐药现象在所有肿瘤阶段均普遍存在，不仅见于铂类化疗，也见于靶向治疗（抗EGFR；表皮生长因子受体）以及近年来新兴的免疫检查点抑制治疗15。无效的放疗和化疗会带来高昂代价，导致患者出现显著的并发症，包括吞咽困难、黏膜炎、口干，以及肾功能或心功能下降的风险等。在为每位患者确定总体治疗方案之前，预测其对治疗的反应似乎是关键目标，有助于避免不必要的治疗方案、减轻不良反应并降低医疗成本。
我们旨在建立一种模型，用于检测个体患者对当前标准放化疗的治疗敏感性，该模型可从技术角度整合到常规且经过质量控制的肿瘤治疗流程中。最终目标是使用该模型时避免依赖经过高度传代和老化改造的细胞系，因为目前已知这些细胞系无法充分代表真实人体肿瘤细胞的变异性与异质性，尽管本方案的建立过程仍使用了多种细胞系。为了不完全依赖商业来源的细胞系，我们近期已成功从人肿瘤标本的原代头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞中建立了一种中间型细胞系，命名为&#34;PiCa&#34;，其细胞表面保留了特定的细胞标志物，且传代次数有限16。该PiCa细胞系将作为模型开发的前期准备，为后续使用肿瘤活检来源的新鲜人癌细胞开展实验奠定基础。已有研究表明，与单层培养的细胞相比，三维细胞培养中的细胞对抗癌药物的反应更为不同且更接近体内（in vivo）状态17,18,19,20,21，这主要归因于某些细胞亚群的迁移能力和亚分化特性的保留22,23,24。本文描述了一种基于类球体的三维模型的实验方案，该模型来源于中间型细胞系及原代人鳞状细胞癌细胞，并介绍了如何将此类模型整合至头颈外科医生与肿瘤科医生的癌症治疗实践中的方法（图1）。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Biochrom，德国柏林</td><td>F 0425</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco Life Technologies，Paisley，英国</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biochrom，德国柏林</td><td>A2212</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Biochrom，德国柏林</td><td>L0473</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Biochrom，德国柏林</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biochrom，德国柏林</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>罗氏生命科学，巴塞尔，瑞士</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>GravityPLUS 3D 培养与检测平台</td><td>InSphero，瑞士施利伦</td><td>PB-CS 06-001</td><td></td></tr><tr><td>重力TRAP板</td><td>InSphero，瑞士施利伦</td><td>PB-CS-01-001</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附（ULA）培养板</td><td>康宁公司，美国纽约州康宁市</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>气道上皮细胞生长培养基</td><td>Promocell，德国海德堡</td><td>C-21060</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Biochrom，德国柏林</td><td>A 2612</td><td></td></tr><tr><td>气道上皮细胞生长培养基补充剂混合物</td><td>Promocell，德国海德堡</td><td>C39165</td><td></td></tr><tr><td>WST-8 检测</td><td>Promocell，德国海德堡</td><td>PC PK-CA705-CK04</td><td></td></tr><tr><td>角质形成细胞SF培养基 + L-谷氨酰胺 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>#17005-034</td><td></td></tr><tr><td>牛垂体提取物（BPE），25mg</td><td>Invitrogen</td><td>#37000015</td><td></td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子 2.5 &amp;micro;g</td><td>Invitrogen</td><td>#37000015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖</td><td>Invitrogen</td><td>#21068-028</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液 10000 U/mL 青霉素 / 10000&amp;micro;g/mL 链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F12 营养混合物</td><td>Invitrogen</td><td>#21765-029</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺替代物Glutamax（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽，溶于NaCl）</td><td>Invitrogen</td><td>#35050087</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（含Ca、Mg）</td><td>Life Technologies</td><td>#14025-092</td><td>（无酚红）</td></tr><tr><td>1x TrypLE Expres 酶</td><td>Invitrogen</td><td>#12604-013</td><td>（无酚红）</td></tr><tr><td>Accutase（酶解细胞解离液）</td><td>创新细胞技术</td><td>货号 AT104</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Falcon细胞筛</td><td>BD 生物科学公司，美国</td><td>#352350</td><td></td></tr></tbody></table>

基于球体的三维细胞培养模型在头颈部鳞状细胞癌治疗测试中的应用

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

晚期及复发性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的现有治疗方案包括放疗和化疗-放疗联合方案，可选择性结合手术治疗。尽管基于铂类的化疗方案目前在疗效方面仍被视为金标准，并在绝大多数病例中被采用，但新型化疗方案，尤其是免疫治疗，正在兴起。然而，无论是传统化疗还是免疫治疗，其应答率及治疗耐药机制均难以预测，且尚未被充分阐明。迄今为止，已知存在多种多样的化疗和放疗耐药机制。本研究描述了一种标准化、高通量 体外 用于评估头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系对不同治疗方案的反应，并有望未来应用于个体患者原代细胞，作为个体化肿瘤治疗的工具。该检测方法旨在整合至本医疗中心针对HNSCC患者的质控标准化诊疗流程中，但此目标有待后续研究验证。从真实患者肿瘤活检样本中获取原代细胞的技术可行性前景良好。样本随后被转移至实验室，活检组织经机械分离后进行酶消化处理。细胞被培养于超低吸附细胞培养管中，以促进其可重复、标准化且自发形成三维球状细胞聚集体。根据需要，这些类球体可进一步接受化疗-放疗方案或免疫治疗方案处理。最终的细胞活力与类球体大小可作为治疗敏感性的指标，未来或可用于评估患者对治疗的可能反应。该模型有望成为一种有价值的、经济高效的头颈部癌症个体化治疗工具。

关键词：头颈部鳞状细胞癌，HNSCC，个体化治疗，类球体，原代细胞，化疗-放疗，免疫治疗，细胞活力，三维培养，肿瘤活检

我们能够从单细胞悬液中可重复地生成球状体，最初来自不同细胞系，包括 proprietary PiCa 细胞系，随后来自新鲜肿瘤活检获得的原代人癌细胞，具体方法如 Hagemann 所述。 等.26我们评估了两种已建立的类球体生成方法，即所谓的悬滴法（HD）和超低黏附力法（ULA），其中后者更为有效且安全。我们能够突出ULA方法相较于HD方法的优势，包括类球体生长更快、板操作问题更少、因剧烈振动导致的类球体丢失情况减少，以及在均匀性方面具有更高的可重复性图2）。HD 方法中每瓶出现多个类球体的情况更为常见。我们对类球体形态进行了更明确的表征分析。 图3 显示了PiCa细胞来源的球体中增殖标志物Ki67的免疫组化染色结果。如文献所述，球体由增殖较少的核心区域和增殖活跃的外层区域组成，模拟了人类头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）实体瘤中不同区域的增殖特征。 体外 作为 体内...

我们描述了一种基于球体的三维模型的演变过程 体外 一种模型，可用于在细胞系上测试头颈部鳞状细胞癌当前的标准实验治疗方案，旨在未来评估来源于人体标本的原代细胞对治疗的敏感性与耐药性。

晚期及复发性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的当前治疗方案包括放疗以及放化疗方法，其……

本体外方法的总体目标是生成三维细胞培养类球体，以用于头颈部鳞状细胞癌现有标准治疗或实验性治疗方案的测试。该方法有助于我们理解头颈部癌细胞在暴露于放射治疗或放化疗处理时的三维肿瘤生长特性。需要指出的是，原代肿瘤细胞的处理较为困难，且并不总能可靠地形成三维类球体。演示该操作的是来自我们实验室的技术员 Sabina Schwenk-Zieger。在使用肿瘤样本的原代细胞时，将样本置于合适且无菌的表面上，用无菌的一次性解剖刀将其充分切割成非常小的碎片。在充分进行机械分离原代组织后，将其转移至含有胶原酶1和胶原酶2的试管中，在37摄氏度下孵育一小时。接下来，使用70微米的Falcon细胞筛过滤该混合物，并用HBSS洗涤悬液。成功分离并充分洗涤后，将含有100万至200万细胞的悬液转移至T75细胞培养瓶中，在37摄氏度下培养至亚融合状态，最长可培养10天。在显微镜下确认肿瘤细胞的生长情况。计数培养中的细胞。使用带有凹形圆底的超低吸附96孔板，将5,000个原代肿瘤细胞或1,000至2,000个中间细胞系细胞接种到每孔200至300 µL培养基中。随后，将细胞在37 °C条件下进行培养。每隔一天更换一次培养基。更换培养基时注意不要用移液器吸走类球体。继续培养类球体，直至观察到三维的类球状细胞聚集体。请注意，将出现不规则或多个类球体形成的孔排除在后续研究之外。随后，更换培养基为含有化疗药物和/或单克隆抗体的培养基，浓度按需设定。加入顺铂，浓度分别为 2.5、5 或 10 µM，或加入 5-氟尿嘧啶至浓度为 30 µM。在此实验步骤中，在第6天、第10天和第16天对类球体进行数字拍照记录后，使用图形软件测量其大小。以520×g离心微孔板2.5分钟，弃去上清液。随后用1×PBS洗涤细胞，再次离心微孔板，然后弃去上清液。接下来，向每支小瓶中加入 100 µL 酶法细胞解离溶液，使类球体溶解。随后，将培养板在 37 °C 条件下孵育 8 分钟。在显微镜下检查类球体是否成功溶解。加入 100 微升 DMEM。接着，以 520g 离心 2.5 分钟。然后吸去上清液，并将细胞重悬于 100 微升 DMEM 中。随后，如有必要，可进行商品化的比色法增殖检测，并使用ELISA读板仪读取结果。所有细胞系均可形成可靠的球状体，但在大小和检测时间上存在差异。原代细胞在超低吸附培养板中也能形成可重复的球状体。Ki-67 染色显示，培养物周边区域的细胞增殖率明显高于中心区域，这模拟了实体黏膜肿瘤中常见的营养物质分布情况，此类肿瘤常出现坏死的核心。此处展示了多种化疗药物及放射治疗对类球体大小的影响。在顺铂治疗前给予 2 Gy 放射剂量，与单独使用顺铂相比，可显著减小类球体的体积。随着从原代人细胞生成类球体技术的进一步建立，这一疗法测试概念得以实现。在肿瘤活检后，可生成类球体，并用于分子特征分析及治疗敏感性检测。我们已建立了一种可重复的方案，能够从细胞系和原代人肿瘤细胞的细胞悬液中生成可重复的类球体。该多模态检测方法具有足够的灵敏度，可识别组间微小差异。未来，该检测可用于：第一，评估个体对标准治疗方案和实验性治疗方案的反应；第二，进一步表征新鲜标本中的肿瘤细胞。第三，将治疗反应与分子模式相关联。利用原代细胞并生成球状体，可在保留体内肿瘤生长尽可能多特征的同时，结合一种成本效益高的检测方法，用于研究个体对治疗的反应。

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Cancer Research

癌症研究

基于球形的头颈部鳞状细胞癌3D 细胞培养模型的治疗试验

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侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

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我们介绍了一种用于培养高可重复性类球体并通过图像采集和蛋白质组学进行表型表征的实验方案。...

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了解基于球形的头颈部鳞状细胞癌三维细胞培养模型，用于评估放疗和化疗的疗效。该方法利用原代肿瘤细胞形成球状体，帮助研究人员在体外模拟肿瘤生长并测试个体化治疗方案。

基于球体的三维细胞培养模型在头颈部鳞状细胞癌治疗测试中的应用

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