Name: 从患者来源的肿瘤样本中建立三维微球并评估其对药物的敏感性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学习从原代癌细胞建立三维肿瘤微球模型并评估抗癌药物敏感性。该方法适用于多种实体瘤研究，成本低廉且可在标准细胞生物学实验室完成，有助于实现个性化癌症治疗策略。

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用于原代肿瘤细胞培养的人类肿瘤样本采集，均按照拉宾医学中心经机构审查委员会（IRB）批准的方案进行，并取得患者的书面知情同意。符合本研究参与资格的患者包括患有非转移性乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、神经内分泌肿瘤、卵巢癌或胰腺癌的成年及儿童癌症患者，所有儿童癌症患者，以及所有转移性癌症患者。唯一的排除标准是无法提供知情同意。
1. 类球体的生成与收集
注意：原代肿瘤细胞的分离可按照 Kodak 等人8所述方法进行。重要的是，用于生成类球体的原代肿瘤细胞可直接来源于患者活检、切除等获取的样本，也可间接来源于患者来源的异种移植（PDX）模型中的肿瘤样本，如 Moskovits 等人9所述。
<ol>
	<li>通过取一个含有单层贴壁原代细胞培养物的小型培养瓶（T25），去除培养基，用PBS洗涤，然后加入1 mL 1× Accutase（一种细胞解离溶液），制备75%–100%融合度的贴壁原代肿瘤细胞培养物的单细胞悬液（参见 材料表在 37 °C 下孵育 3 分钟。</li>
	<li>通过加入5 mL细胞培养基（含10% FBS、1:100青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和1% L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基）中和Accutase溶液；参见 材料表).</li>
	<li>用10 mL血清移液管吸出细胞，转移至15 mL锥形离心管中。以800 x g 室温下放置5分钟。</li>
	<li>移除细胞培养基，加入5 mL新鲜细胞培养基至细胞沉淀上，轻轻混匀。</li>
	<li>使用血细胞计数板对活细胞进行计数10取50 μL细胞悬液，与50 μL台盼蓝混合。计数活细胞（未染成蓝色的细胞），并计算悬液中活细胞的总数。</li>
	<li>制备 &#34;3D 培养基&#34; （添加了5%基底膜基质的细胞培养基；参见 材料表). 
	注意： &#34;3D 培养基&#34; 在室温下呈液态。在37 °C时，其稠度变得更接近凝胶状（使细胞保持聚集），但仍可使用移液器操作（因其仅含有5%的基底膜基质）。</li>
	<li>计算实验所需的细胞数量和总体积；每孔需含有2,000–8,000个细胞，培养基体积为200 μL。</li>
	<li>制备含有所需数量细胞（例如，4,000 个细胞）的细胞悬液，体积为 200 μL &#34;3D 培养基&#34; 用移液器轻轻混匀，以确保均匀分布。</li>
	<li>将悬液转移至排液槽中。使用多通道移液器，向超低吸附96孔板的每孔中加入200 μL细胞悬液（参见 材料表每次收集细胞前，需充分混匀悬液。</li>
	<li>将培养板在300 x g 在室温下孵育10分钟，以促进细胞聚集，从而改善细胞成团，随后将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2&#160;加湿培养箱</li>
	<li>每2-3天更换一次培养基 &#34;3D 培养基&#34;. 将培养板在300 x g 室温孵育10分钟，轻轻移除并弃去50%的培养基（100 μL），加入100 μL新鲜培养基 &#34;3D 培养基&#34; 更换现有溶液。重复步骤 1.11，并将培养板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中。2&#160;加湿培养箱 
	注意：更换培养基时，需将培养板保持在45°角，仅从上部吸取培养基，以避免收集到细胞。不可使用真空抽吸系统。添加新鲜培养基时应缓慢轻柔，以免破坏已开始形成的球状体。</li>
	<li>每隔1-2天在显微镜下观察细胞，以监测球状体的形成情况。使用以下方法测量所形成球状体的直径： &#34;比例尺&#34; 成像软件中的工具（参见 材料表). 
	注意：显微镜检查应首先显示不规则的圆形至椭圆形结构，随着时间推移，这些结构逐渐呈现球形。11,12.
	<ol>
		<li>当类球体直径达到100–200 μm时，进行药物疗效实验。 
		注意：当类球体达到此直径时进行药物疗效实验，因为此时大部分细胞处于增殖状态，有利于评估治疗反应。直径较大的类球体则含有坏死核心及静止层。11,12导致对治疗产生反应的增殖细胞比例降低。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用1,000 μL移液器从每个孔中收集球状体，并将其转移至15 mL锥形管中。 
	注意：类球体本质上较为脆弱，需轻柔操作。将含有类球体的培养基转移至锥形管时，应将管子倾斜呈45°，沿管壁缓慢移液。类球体肉眼可见。</li>
	<li>将锥形管在 300 x g 室温孵育5分钟，然后用移液器小心吸除并弃去上清液。</li>
	<li>加入0.5 mL细胞培养基，轻轻但充分重悬沉淀。避免产生气泡。</li>
	<li>按照以下步骤进行类球体计数。
	<ol>
		<li>使用96孔板，在孔的底部画一个加号，将孔分为四个象限（以帮助记录计数）。</li>
		<li>向孔中加入 50 μL 悬液，在显微镜下手动计数球状体（使用 10x 物镜）。</li>
		<li>统计每个象限中的球状体数量，注意避免重复计数，并计算孔中球状体的总数。 
		注意：为了确保计数的准确性，每个孔中至少计数50个球状体。如果孔中球状体少于50个，应轻轻混匀悬浮液以确保分布均匀，并取更多体积的悬浮液加入新孔中重新计数。或者，若孔中球状体少于50个，可将球状体离心后轻轻重悬于一定体积的悬浮液中 &#60;0.5 mL。如果类球体数量超过100个，向类球体悬液中添加细胞培养基，轻轻混匀后重新计数。</li>
		<li>计算球状体浓度（球状体数量/计数体积 [μL]），然后计算悬浮液中球状体的总数（球状体浓度 × 总体积）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 药物效力检测（MTT 检测）
注意：详细信息请参见 van Meerloo 等人13。此外，进行 MTT 实验时，必须使用细胞培养基，而非&#34;3D 培养基&#34;（无需添加基底膜基质，因其可能干扰 MTT 实验结果）。
<ol>
	<li>在新试管中，用细胞培养基（RPMI-1640 培养基，添加 10% 胎牛血清、1:100 青霉素-链霉素、1% 非必需氨基酸和 1% L-谷氨酰胺）配制浓度为每 200 μL 含 200 个类球体的悬浮液。
	<ol>
		<li>针对每种药物处理，在 15 mL 离心管中准备类球体储备液。根据重复实验所需的孔数计算每种药物所需用量：(5–8) × 200 μL。将药物加入离心管中，使其达到最终所需浓度。 
		注：有关本研究中所用药物及其剂量的信息，请参见代表性结果部分。此外，药物的商业信息列于材料表中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 200 μL 类球体悬浮液转移至超低吸附 96 孔板的各孔中，并在 37 °C、5% CO2&#160;的湿润培养箱中孵育。请勿在 96 孔板的外周行和列进行检测，因为这些孔蒸发量较大，可能导致重复实验间的变异性增加；相反，应在这些孔中加入 PBS。 
	注：在将类球体培养物分装至 96 孔板前，确保其均匀分布至关重要。此外，每次实验均需设置对照条件（即未经处理的类球体）。</li>
	<li>将类球体与研究药物孵育 24–72 小时后，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，然后小心移除 170 μL 细胞培养基，保留底部 30 μL（包含类球体）。 
	注：移除 170 μL 培养基时必须小心操作，避免将类球体一并移除。将培养板倾斜 45°，并将一只手（佩戴深色手套以增强对比度）置于孔下方，以便观察类球体（呈白色小点）。</li>
	<li>配制 MTT 溶液（在无酚 RPMI 中配制成 0.714 mg/mL，详见材料表）。</li>
	<li>向每孔加入 70 μL MTT 溶液，使每孔终体积为 100 μL（每 100 μL 孔内 MTT 终浓度为 0.05 mg）。同时，设置不含细胞但含 MTT 溶液的&#34;空白&#34;孔。 
	注：MTT 对光敏感。因此，操作时需关闭超净台照明，并用铝箔包裹盛有 MTT 溶液的试管。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2&#160;的湿润培养箱中孵育 3–4 小时，直至观察到孔内溶液颜色发生变化（紫色表示活细胞）。</li>
	<li>观察到颜色变化后，向每孔加入 100 μL 终止液（异丙醇中的 0.1 N HCl），并轻轻混匀各孔内容物，避免产生气泡。</li>
	<li>使用荧光酶标仪（详见材料表）在 570 nm 波长下读取吸光度，背景波长设为 630–690 nm。 
	注：若所用荧光酶标仪无法读取超低吸附 96 孔板，可将各孔内容物转移至相应的平底 96 孔板中再进行检测。</li>
	<li>按以下步骤计算细胞活力。
	<ol>
		<li>对每个孔，计算&#34;特异性信号&#34;（&#34;特异性信号&#34; = 570 nm 处信号值减去 630–690 nm 处信号值）。然后计算不含细胞的&#34;空白&#34;孔的平均信号值，并从各孔信号值中减去该平均值。</li>
		<li>计算未接受研究药物处理的对照孔中&#34;特异性信号&#34;的平均值（记为&#34;AV-SS-unt&#34;）。</li>
		<li>计算各孔细胞相对于未处理细胞孔的活力百分比。 
		注：活力 = （每孔特异性信号 / &#34;AV-SS-unt&#34;）× 100</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 类球体形态变化的监测与分析
注意：进行 MTT 检测时，应仅使用细胞培养基，而不应使用&#34;3D 培养基&#34;（无需添加基底膜基质，否则可能干扰分析结果）。
<ol>
	<li>计数类球体后，将悬液用细胞培养基（含10%胎牛血清、1:100青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和1% L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基）稀释至每20 μL含约1–2个类球体。</li>
	<li>向超低吸附96孔板的各孔中加入80 μL细胞培养基，然后向各孔加入20 μL类球体悬液。 
	注意：因此，每孔最终含有1–2个类球体，总体积为100 μL。</li>
	<li>在显微镜下仔细检查各孔，并标记含有单个类球体的孔，这些孔将用于本分析。</li>
	<li>配制浓度为所需浓度两倍的实验药物溶液。向相应孔中加入100 μL药物溶液（孔内最终浓度为1倍）。</li>
	<li>在第0天（添加实验药物前）拍摄每个孔的图像，并使用成像软件中的&#34;scale&#34;工具（见材料表）测定类球体的直径。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2&#160;的湿化培养箱中孵育，每天观察类球体形态，并使用&#34;scale&#34;工具测量其直径，持续3–7天，具体时间取决于药物效应的出现情况（例如细胞扩散、侵袭性突起、结构破坏等）。</li>
	<li>实验结束时，绘制类球体直径随时间的变化曲线（相对于第0天）。 
	注意：变化率（百分比）=（特定日期的类球体直径 / 该类球体在第0天的直径）× 100</li>
</ol>

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<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+The+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种从人类肿瘤样本中生成三维原代细胞培养物（球状体）的简便方法。这些球状体可用于多种分析，包括评估潜在药物候选物及药物组合、鉴定潜在生物标志物或治疗靶点，以及研究应答与耐药机制。该方案可使用直接来源于患者样本的原代肿瘤细胞，或来源于PDX模型的肿瘤细胞，后者可通过患者样本建立。后一种方法使得在 体外 和 体内 使用相同原发肿瘤进行的实验。既往研究已表明，在PDX模型及其衍生的3D培养体系的药物敏感性实验结果之间具有一致性。9，从而支持了这一点的相关性 体外/体内 方法
当前方案的主要优势包括其对大多数实体瘤具有广泛的适用性，以及具有较高的成本效益，后者源于该方案与癌症研究/细胞生物学实验室常见的设备和技术能力相兼容（即无需特殊设备或外包服务）。此外，当前方案可生成均一的类球体细胞群，从而能够使用高通量定量存活率检测方法（例如MTT法）。生成均一的类球体细胞群对于获得有意义的实验结果至关重要，已有研究表明类球体的大小会影响其对治疗的反应。与较小的类球体不...

体外和体内研究是开发癌症治疗方法的两种互补途径。体外模型能够控制大多数实验变量，便于进行定量分析，常作为低成本的筛选平台，也可用于机制研究1。然而，其生物学相关性本质上有限，因为这类模型仅能部分反映肿瘤微环境1。相比之下，体内模型（如患者来源的异种移植模型，PDX）能够更好地模拟肿瘤微环境的复杂性，更适合用于转化研究以及个体化治疗（即研究来源于特定患者的模型对药物的反应）1。然而，体内模型不适用于高通量药物筛选，因为其实验参数难以像体外模型那样精确控制，且模型构建过程耗时长、劳动强度大、成本高1,2。
体外 模型已有100多年的历史，细胞系已有70多年的历史3然而，在过去几十年中，可用的复杂性 体外 实体瘤模型的复杂性已显著增加。这种复杂性涵盖了从二维（2D）培养模型（单层结构），包括来源于肿瘤的永生化细胞系或原代细胞系，到近年来涉及三维（3D）模型的更先进方法1在二维模型中，一个关键区别在于已建立的细胞系与原代细胞系之间4已建立的细胞系具有永生性，因此同一细胞系可在全球范围内多年持续使用，从历史角度看，这有助于促进合作、数据积累以及多种治疗策略的开发。然而，这些细胞系在连续传代过程中会不断积累遗传异常，从而影响其生物学相关性。此外，目前可用的细胞系数量有限，无法反映患者肿瘤的异质性。4,5原代癌细胞系直接来源于切除的肿瘤组织样本 通过 活检组织、胸腔积液或切除标本。因此，原代癌细胞系具有更高的生物学相关性，因其保留了肿瘤微环境及肿瘤特征的诸多要素，例如细胞间行为（如正常细胞与癌细胞之间的相互对话）以及癌细胞的类干细胞表型。然而，原代细胞系的增殖能力有限，导致培养时间较短，限制了可用于分析的肿瘤细胞数量4,5.
与二维培养模型相比，三维培养模型具有更高的生物学相关性，因为其保留了体内环境条件。因此，三维培养模型能够维持细胞的天然形态和生长方式，并模拟肿瘤微环境中的多种特征，如缺氧、坏死和细胞黏附。在癌症研究中，最常用的三维模型包括多细胞球体、基于支架的结构以及基质包埋培养物4,6,7。
本实验方案利用原代癌细胞建立三维肿瘤培养模型（多细胞球状体），并通过两种互补方法评估其对药物的敏感性：细胞活力检测（MTT法）和显微镜观察。文中展示的代表性结果来自乳腺癌和结肠癌，但该方案同样适用于其他多种实体瘤类型（如胆管癌、胃癌、肺癌和胰腺癌），且具有成本效益，因其可在常规癌症研究或细胞生物学实验室中完成，无需依赖特殊设备。通过该方法生成的多细胞球状体可用于评估潜在药物候选物、鉴定潜在生物标志物或治疗靶点，并研究治疗反应与耐药的机制。
本方案分为三个部分：（1）制备用于药物疗效测试模型的类球体，并对其进行生成、收集和计数；（2）采用MTT法评估药物对类球体的疗效；（3）通过显微镜观察类球体经药物处理后的形态学变化，作为评估药物疗效的另一种方法（图1）。

<table><tbody><tr><td>5-氟尿嘧啶</td><td>TEVA Israel</td><td>批号 16c22NA</td><td>氟尿嘧啶，Adrucil</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td></tr><tr><td>顺铂</td><td>TEVA Israel</td><td>20B06LA</td><td>Abiplatin,&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cultrex&amp;nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>3632-010-02</td><td>基底膜基质，3型</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2391595</td><td></td></tr><tr><td>荧光计&amp;nbsp;ELISA 阅读仪</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td>Gen5 3.11</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td>用于终止液</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，美国</td><td>&amp;nbsp;版本 1.52a</td><td>开源软件 ImageJ</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Gadot</td><td>P180008215</td><td>用于终止液</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>1843977</td><td></td></tr><tr><td>MTT&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td>3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐</td></tr><tr><td>非必需氨基酸&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>帕博西尼&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 571190-30-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）*不含钙和镁</td></tr><tr><td>青霉素&amp;ndash;链霉素&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2119399</td><td></td></tr><tr><td>无酚 RPMI 1640</td><td>Biological industries, 中国台湾</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>移液槽</td><td>Alexred</td><td>RED LTT012025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>舒尼替尼</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 341031-54-7</td><td></td></tr><tr><td>曲妥珠单抗</td><td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, 巴塞尔, 瑞士</td><td>10172154 IL</td><td>赫赛汀</td></tr><tr><td>0.5% 台盼蓝溶液</td><td>Biological industries, 中国台湾</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>超低吸附 96 孔板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>长春瑞滨</td><td>Ebewe</td><td>11733027-03</td><td>Navelbine</td></tr></tbody></table>

建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

尽管在理解肿瘤生物学方面已取得显著进展，但进入临床试验的大多数肿瘤药物候选物仍以失败告终，通常原因是缺乏临床有效性。这一高失败率揭示了当前临床前模型在预测临床疗效方面的不足，主要在于其无法充分反映肿瘤异质性和肿瘤微环境。这些问题可通过利用来自个体患者肿瘤样本建立的三维（3D）培养模型（类球体）加以解决。相比无法体现肿瘤异质性的传统细胞系，这些3D培养模型更能真实反映实际生物学特征。此外，3D培养模型优于二维（2D）培养模型（单层结构），因为它们能够模拟肿瘤环境中的多种要素，如缺氧、坏死和细胞黏附，并维持细胞的天然形态和生长方式。本研究建立了一种从个体患者来源的癌细胞制备三维多细胞类球体原代培养物的方法。这些细胞可直接来源于患者的肿瘤组织或患者来源的异种移植瘤。该方法广泛适用于多种实体瘤（如结肠癌、乳腺癌和肺癌），且具有成本效益，可在常规癌症研究或细胞生物学实验室中完成，无需依赖特殊设备。本文提供了一种从原代癌细胞生成3D肿瘤培养模型（多细胞类球体）并利用两种互补方法评估其药物敏感性的实验方案：细胞活力检测（MTT法）和显微镜观察。这些多细胞类球体可用于评估潜在药物候选物、发现潜在生物标志物或治疗靶点，并研究治疗反应与耐药机制。

本方案介绍了从原代肿瘤细胞生成均一球状体培养物的步骤，对药物在球状体培养中的疗效进行定量评估（MTT法），以及确定研究药物对球状体形态的影响。文中展示了由结肠癌和乳腺癌细胞培养物生成的球状体代表性实验数据。类似实验也使用其他肿瘤类型进行，包括胆管癌、胃癌、肺癌和胰腺癌（数据未显示）。本文所展示的所有实验均设三个重复。
图2展示了由原代结肠癌细胞培养生成的类球体。如图2所示，生成的类球体数量取决于最初接种至每个孔中的细胞数量。类球体生长至直径超过100 μm需要10–14天。肿瘤细胞的来源（例如不同患者、不同组织来源）决定了其生长速率。增加接种细胞数量并不能缩短类球体形成所需的时间，而只会增加形成的类球体数量。值得注意的是，在对结肠癌类球体进行长期培养后，它们开始相互黏附，形成葡萄串样的类球体簇（图3），这导致培养体系不均一，因而无法将这些类球体用于MTT实验。
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本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。

尽管在理解肿瘤生物学方面取得了显著进展，但进入临床试验的绝大多数肿瘤药物候选物均告失败，通常由于……

本方案的意义在于，它描述了如何利用原代癌细胞构建三维肿瘤培养模型，该模型相较于细胞系能更真实地反映实际肿瘤的生物学特性。此方法适用于多种实体瘤，且具有成本效益，可在常规细胞生物学实验室中从头至尾完成。利用此方法生成的三维肿瘤模型可用于研究肿瘤对抗癌疗法或联合疗法的敏感性和耐药性。该方法使用原代癌细胞生成三维模型，因此可帮助确定对特定患者可能有效的治疗方案，从而助力实现个体化治疗。本实验操作将由我实验室的博士生 Ella Itzhaki 演示。首先，取一个含有单层贴壁原代细胞培养物的小型 T25 培养瓶，移除细胞培养基。用 PBS 清洗细胞，然后加入 1 毫升 1x Accutase，在 37°C 下作用 3 分钟，以制备汇合度为 75% 至 100% 的贴壁原代肿瘤细胞的单细胞悬液。通过加入五毫升细胞培养基来中和Accutase溶液。用10毫升血清移液管吸取细胞，并将其转移至15毫升锥形离心管中。在室温下以800g离心五分钟。吸去细胞培养基，向细胞沉淀中加入 8 毫升新鲜细胞培养基，轻轻混匀。使用血细胞计数板对活细胞进行计数时，取 50 微升细胞悬液，与 50 微升台盼蓝混合，混匀后计数活细胞，并计算悬液中活细胞的总数。接下来，配制3D培养基。根据实验所需的细胞数量和总体积，用200微升3D培养基制备含有目标数量细胞的细胞悬液。用移液器轻轻混匀，以确保细胞均匀分布。将悬液转移至排液槽中，使用多通道移液器将200微升细胞悬液加入超低吸附96孔板的每孔中。在室温下以300×g离心10分钟，以促进细胞聚集，从而提高细胞成球效果，并将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。再次于室温下以300×g离心10分钟后，轻柔移除并弃去50%的培养基，加入100微升新鲜的3D培养基以替换原有溶液。重复此步骤，并将培养板放回37°C、5%二氧化碳的湿化培养箱中。每隔一至两天在显微镜下观察细胞，以监测球状体的形成情况。使用成像软件中的标尺工具测量所形成球状体的直径。当类球体直径达到100至200微米时，即可进行药物疗效实验。收集类球体时，使用1,000微升移液器从每个孔中收集类球体，并将其转移至15毫升锥形管中。在室温下以300×g离心5分钟，然后用移液器小心吸除并弃去上清液。加入0.5毫升细胞培养基，轻轻但充分重悬沉淀。为进行球状体计数，使用96孔板并在孔的底部画一个加号，将孔分为四个象限。向孔中加入50微升悬浮液。使用10倍物镜，在显微镜下手动计数类球体。分别计数每个象限内的类球体数量，并计算孔中类球体的总数。然后通过将类球体数量乘以计数体积的倒数，计算类球体浓度，并进一步计算悬浮液中类球体的总数。在新的离心管中，用 200 微升细胞培养基制备浓度为每 200 微升含 200 个类球体的悬浮液。每种药物处理需在不同的离心管中分别制备类球体储备液。根据重复实验所需的孔数计算每种药物的总体积需求量，并将药物加入离心管中至所需终浓度。将200微升类球体悬液转移至超低吸附96孔板的各孔中，并将该板置于37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。在研究药物处理类球体24至72小时后，于室温下以300×g离心5分钟，然后轻柔吸除每孔中的170微升细胞培养基，保留孔底30微升。配制MTT溶液，向每孔加入70微升该溶液，使每孔终体积为100微升。孔中最终的 MTT 浓度为每 100 微升 0.05 毫克。此外，准备仅含 MTT 溶液而不含细胞的空白孔。将培养板置于含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中，37°C 孵育三至四小时，直至观察到孔内溶液颜色发生变化。当观察到变化时，向每孔加入 100 微升终止液，并轻轻混匀孔内液体，避免产生气泡。使用参数 ELISA 读板仪在 570 纳米波长下测定吸光度，背景波长设为 630 至 690 纳米。为计算细胞活力，需计算每孔的特异性信号值。然后计算空白孔的平均值，并从每个孔的读数中减去该值。计算对照孔中未用研究药物处理的细胞的特异性信号的平均值。最后，计算每个孔中细胞相对于未处理细胞孔的存活率。此处展示了初始接种细胞数量对原代结肠癌细胞培养随时间形成球状体的影响。从该图可以看出，生成的球状体数量取决于每个孔中最初接种的细胞数量。此处显示了原代结肠癌细胞在培养10天后形成的球状体，初始接种细胞数为每孔2,000个。在长期培养结肠癌类球体后，它们开始相互黏附，形成类球体簇和葡萄状结构，这阻碍了均一化的培养，从而限制了这些类球体在MTT实验中的应用。此处展示了帕博西尼、舒尼替尼以及二者联合处理对来源于原发性肿瘤细胞（包括结肠癌和乳腺癌）的类球体的作用效果。本研究对来源于结肠癌和乳腺癌细胞的类球体进行了MTT实验。MTT信号以DMSO处理的细胞信号值为基准进行归一化处理。数据代表四到八个重复样本的平均值。在第0天以及结肠癌和乳腺癌细胞来源的球状体经处理三天后，还通过显微镜评估了各种处理对细胞生长的影响。本图展示了曲妥珠单抗联合长春瑞滨以及5-氟尿嘧啶联合顺铂随时间对乳腺癌来源类球体的作用效果。图中显示了不同治疗持续时间下类球体直径相对于第0天的变化情况。每个治疗组包含四到六个孔，每孔含有一个类球体。此处展示了平均变化。类球体是多种研究的重要工具，其应用不仅限于对抗癌治疗的响应，还包括药物递送，甚至细胞间相互作用等基础生物学问题的研究。启动类球体生成过程时，必须使用单细胞悬液。同时，必须使用含5%基础膜基质的培养基，并在超低吸附培养板中进行。

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癌症研究

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