Name: 带谱系特异标记的间充质细胞脂肪分化电位的可视化与量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: 了解使用谱系特异性标记物FABP4对间充质细胞进行脂肪分化的可视化与定量分析方法。该技术通过免疫荧光染色和高内涵筛选实现精准评估，适用于高通量药物筛选和细胞生物学研究。

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我们感谢提供脂肪组织的捐赠者以及负责采集并提供该资源供我们用于研究的研究人员。我们感谢艾尔建公司（Allergan）提供的经费支持。同时，我们也感谢奥克兰大学医学与健康科学学部基于绩效的研究基金，为本文投稿所需的视频拍摄与编辑费用提供了资助。

1. 准备脂肪来源干细胞用于分化检测
<ol>
	<li>在无菌细胞培养罩内配制细胞培养试剂并处理活细胞。</li>
	<li>制备A0培养基：DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基与Ham's F12培养基）、1× GlutaMAX、1×青霉素/链霉素。</li>
	<li>配制完全ASC培养基：DMEM/F12，1x GlutaMax，1x 青霉素/链霉素，10% 胎牛血清。</li>
	<li>使用在T75培养瓶中扩增的贴壁纯化ASCs，通过荧光激活细胞分选（FACS）确认ASCs的纯度10.</li>
	<li>从T75培养瓶中移除所有培养基，加入2 mL细胞解离酶以解离细胞。</li>
	<li>将培养瓶置于培养箱中（37 °C，湿润环境，5% CO₂）。2孵育5-10分钟。将培养瓶从培养箱中取出，用力轻敲瓶壁。使用倒置显微镜观察细胞是否已从培养瓶壁上脱落。</li>
	<li>向T75培养瓶中加入13 mL A0培养基。</li>
	<li>将15 mL转移至15 mL离心管中，在400 × g下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL完全ASC培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将细胞悬液稀释至浓度为 25,000 个细胞/mL-1 在完全ASC培养基中。</li>
	<li>向96孔板（平底）的所有边缘孔中加入200 µL A0培养基，以降低中央含细胞孔的蒸发速率。</li>
	<li>将200 µL细胞悬液转移至微孔板中，使最终细胞密度达到5 x 103 每孔细胞数。每个处理组需要四个孔（三个技术重复孔，以及一个用于免疫细胞化学（ICC）的无一抗对照孔）。</li>
	<li>将微孔板置于培养箱中（37 °C，湿润，5% CO₂）2直至细胞达到汇合（3-4 天）。</li>
</ol>
2. 诱导 ASCs 分化
<ol>
	<li>通过在完全ASC培养基中添加1 µM地塞米松、10 µM胰岛素和200 µM吲哚美辛，制备成脂分化培养基。完全分化培养基在4 °C下可稳定保存1个月，因此仅根据单次实验需求配制即可。4 °C保存，使用时将分装 aliquot 置于水浴中加热至37 °C。</li>
	<li>3–4天后，从培养箱中取出微孔板，用成脂分化培养基更换一半的培养液。</li>
	<li>每2–3天更换一次培养基。 
	注意：最佳成脂分化需在分化培养基中培养14天。分化后的细胞可通过传统染料染色法及基因特异性染色法进行分析。</li>
</ol>
3. 分化染色——基于传统染料的染色法
<ol>
	<li>通过将16%甲醛用PBS稀释，配制4%甲醛溶液。仅稀释实验所需量，并密封保存于离心管中。 
	注意：甲醛为潜在致癌物，吸入后可能引起鼻、咽喉和肺部刺激。所有涉及甲醛的操作均应在通风橱中进行。</li>
	<li>通过将300 mg Oil Red O溶于100 mL异丙醇中，配制Oil Red O储备液。</li>
	<li>从培养箱中取出微孔板。以下步骤可在非无菌环境中进行。</li>
	<li>吸除各孔中的全部培养基，并用4%甲醛固定细胞30分钟。</li>
	<li>在固定期间，配制Oil Red O工作液。工作液由6份Oil Red O储备液与4份蒸馏水（dH2O）混合而成。充分混匀后，室温静置20分钟，再使用0.2 µm滤器过滤。工作液仅在2小时内稳定。</li>
	<li>用移液器吸除各孔中的全部甲醛溶液。</li>
	<li>用60%异丙醇洗涤细胞一次，待各孔完全干燥后再进行下一步操作。</li>
	<li>向每孔加入50 µL Oil Red O工作液，室温孵育10分钟。</li>
	<li>移除Oil Red O溶液，立即加入dH2O。在光学显微镜下观察前，用dH2O洗涤4次。</li>
</ol>
4. 分化染色——基因特异性抗体
<ol>
	<li>通过将 80 g NaCl、2 g KCl 和 30 g Tris Base 溶解于 1 L dH2O 中（pH 8），配制 Tris 缓冲盐水（TBS）储备液。使用 dH2O 按 1:10 稀释制备工作液。室温保存。</li>
	<li>配制免疫缓冲液（IB）（含 1% 胎牛血清（FBS）的 TBS）。在 15 mL 离心管上标注日期，并于 4 °C 保存。IB 自配制之日起可使用 1 周。</li>
	<li>通过将 0.5 g 酪蛋白和 0.195 g 叠氮化钠溶解于 200 mL 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，配制 0.25% 酪蛋白封闭液。搅拌过夜以完全溶解成分。分装至 15 mL 离心管中，于 -20 °C 冰箱中保存。解冻后的酪蛋白溶液可在 4 °C 保存 1 个月。</li>
	<li>将 DAPI 储备液用 TBS 按 1:200 稀释，配制 DAPI 溶液。4 °C 避光保存。</li>
	<li>将硫柳汞溶解于无菌 PBS 中，配制 10 mg mL-1 储备液。4 °C 保存，使用时稀释至 0.4 mg mL-1。</li>
	<li>用冰冻甲醇（96 孔板）固定并透化细胞 5 分钟。用 200 µL TBS 洗涤细胞一次。</li>
	<li>加入 50 µL 0.25% 酪蛋白溶液，室温封闭 10 分钟，然后用 TBS 洗涤一次。</li>
	<li>加入 50 µL 用 IB 稀释的一抗溶液（一抗详细信息见表 1），盖紧盖子孵育 1 小时。</li>
	<li>用 200 µL TBS 洗涤一次，再用 TBS 轻柔振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>加入 50 µL 用 IB 稀释的二抗溶液（二抗详细信息见表 2），每孔均含 1:2000 DAPI，盖紧盖子孵育 1 小时。用铝箔包裹培养板以防止光漂白。</li>
	<li>用 TBS 洗涤一次，再用 TBS 轻柔振荡洗涤 2 次，每次 15 分钟。</li>
	<li>移除所有 TBS，加入 200 µL 硫柳汞溶液。</li>
	<li>将培养板于 4 °C 避光保存，直至成像。</li>
</ol>
5. 使用高通量显微镜对细胞进行成像
<ol>
	<li>使用高内涵筛选显微镜及其配套软件，分析经基因特异性抗体和荧光染料偶联的二抗染色的细胞（免疫荧光）。</li>
	<li>将微孔板放入显微镜载物台上。在板扫描控制界面选择中等放大倍数（10X物镜）进行成像。确保每孔图像均采集自孔中心位置，各成像位点之间保持50 µm间距，以避免同一细胞出现在两个相邻视野中。</li>
	<li>选择需要成像的孔位。</li>
	<li>选择合适的通道组合、曝光时间及z轴偏移参数。有关各滤光片的详细信息，请参见表3（补充表2）。</li>
	<li>使用采集向导进行检测（图像将自动存储至数据库服务器）。</li>
	<li>使用不同的通道组合采集经油红O染色的微孔板图像（补充表3）。</li>
</ol>
6. 分析获取的图像
注意：远程访问数据库服务器可实现对所获取图像的快速便捷评估，并可使用图像分析软件。
<ol>
	<li>在分析软件中打开细胞评分模块。</li>
	<li>使用 DAPI 通道（核标记）检测细胞核，并根据用户定义的大小和高于背景的信号强度参数，对目标细胞核进行分割。</li>
	<li>使用 FITC 通道检测 FABP4 信号。根据用户定义的大小和高于背景的信号强度参数，分割已分化的细胞，以选择每张图像中所有 FABP4 阳性区域。</li>
	<li>在分析软件中打开 Transfluor 模块，用于分析经油红 O 染色的孔板。</li>
	<li>将油红 O 染色区域的大小和强度定义为“凹陷”（pits）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文展示了FABP4免疫标记在准确检测和定量源自间充质基质细胞的成熟脂肪细胞方面的实用性和优势。FABP4能够检测成熟脂肪细胞中谱系特异性蛋白表达的变化3,4,5，而不同于其他常用的染料（如油红O15、尼罗红16和苏丹黑17），后者标记的是大分子结构的变化13,14。FABP4免疫标记可实现对细胞形态变化的可视化和分析，这是相较于以往方法的一项显著优势：例如，定量逆转录PCR（RT-qPCR）仅在转录水平分析变化而无法提供可视化信息5,18,19,20；流式细胞术要求细胞处于悬浮状态20；而Western blotting则需裂解细胞以提取蛋白19,20。FABP4免疫标记在固定后的细胞中稳定，不会在溶液中泄漏；且由于其为胞质蛋白，在贴壁单层细胞中标记时会与细胞核重叠，从而便于观察，并在自动分析中提高准确性。
高内涵筛选具有快速、准确、可重复和客观的优势。它为试剂和研究人员时间的高效利用提供了平台，因为图像的采集和分析几乎不需要人工干预，主要依赖仪器的自动处理。已有研究确定了若干对高内涵筛选实验的准确性和可重复性至关重要的因素31。抗原表达量的定量依赖于图像质量。为了实现成功的图像分析，每个孔中各通道的图像必须聚焦清晰，并且灰度值处于最佳动态范围内（自动曝光设置最为理想）。失焦或过饱和的图像会导致错误的结果。
本文所述方法可能存在以下一些局限性。需要使用专业的成像设备和分析软件。尽管这超出了本文的范围，但可采用其他开源软件选项（例如 ImageJ32,33、Fiji34、CellProfiler32,35）来执行类似的图像分割任务；然而，这些软件要求使用者具备下载并修改网上现有宏代码，或为其特定分析流程编写宏命令或指令的能力。所有自动成像分析流程均存在一定程度的背景噪声，这主要归因于碎片残留、图像质量不佳或分析误差，因此强调了精细的样品制备以及成像与分析平台的严谨设置的重要性。已有研究发现，小鼠中的 FABP4 标记物可检测到未分化的前体细胞30；而本研究中的对照样本（由未分化细胞组成）则未出现特异性的 FABP4 染色。这进一步凸显了在每次应用该检测方法时，必须在特定的生物学背景下验证未分化前体细胞中 FABP4 表达情况的必要性。
为了在FABP4标记与油红O染色之间进行有效的比较，图像分析所得的输出测量值必须具有生物学意义。因此，FABP4采用“阳性细胞百分比”作为测量指标，而油红O则采用“每细胞染色面积”作为测量指标。值得注意的是，在本研究中并未对油红O标记的细胞使用“阳性细胞百分比”这一指标，因为无法准确地将标记的脂滴归属于特定的细胞核；脂滴在细胞内的大小、数量和分布差异显著，且很少与细胞核重叠。来源于不同组织来源的细胞之间存在油红O染色的变异性；尽管“阳性细胞百分比”在本研究中并不适用，但另一研究团队已成功将其用于量化来源于人腺体干细胞的脂肪细胞22，在该研究中油红O染色表现为一个贯穿细胞质并覆盖细胞核的大脂滴，从而能够将数据以阳性细胞百分比的形式呈现。
相比之下，源自不同组织来源的脂肪细胞中FABP4免疫标记的形态具有一致性23,24,25。能够量化培养物中具有分化能力的细胞比例，在多个方面具有应用价值。成体间充质基质细胞在多种治疗用途中具有广阔前景。然而，在临床转化过程中出现的一个重要问题是，这些细胞在不同患者之间26、不同分离部位之间27,28，以及不同分离方法12和细胞扩增方法12用于治疗时，其分化能力存在固有的变异性。已有研究表明，贴壁生长的基质细胞培养物通常具有异质性，其中部分细胞具备分化能力，而另一些则不具备12,17，这一点也通过本研究中的FABP4检测在ASC培养物中得到证实。此类检测方法结合富集技术，将有助于识别异质性培养物中具有谱系特异性分化能力的亚群。拥有如本FABP4检测这样标准化且可量化的检测手段，可为上述各种变量之间的比较提供简便方法，并有望用于评估不同临床试验内部及之间的治疗效果。
以半自动化方式定量 FABP4 可在大量供体样本和样品的分析中实现客观性和可重复性。此外，由于该标记位于细胞质中，因此除增生（脂肪细胞数量增加）外，还可用于分析肥大（脂肪细胞体积增大），这一区别在肥胖研究中具有重要意义，因为肥大与肥胖个体中脂肪组织功能障碍密切相关21。肥胖的流行促使人们高度关注寻找能够调控脂质储存的药物。该 FABP4 检测方法还为筛选成千上万种化合物抑制脂质积聚的能力提供了简便的读出手段。

国际细胞治疗学会（ISCT）定义多能间充质基质细胞的关键标准之一是，这些细胞必须具备向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系分化的潜能1。传统检测这三种谱系分化的手段依赖于使用化学染料检测大分子产物1。例如油红O（可染色经历脂肪生成的细胞中的脂滴）等染料价格低廉且操作简便；然而，这些方法无法检测间充质细胞向各谱系分化过程中发生的特异性基因表达变化2。在此，我们开发了一种分化检测方法，用于定量检测脂肪细胞谱系特异性标志物——脂肪酸结合蛋白-4（FABP4）的蛋白表达水平3,4,5。FABP4最初在小鼠3T3-L1脂肪细胞中被发现3，随后被证实也在人皮下脂肪组织中表达6。它是一种胞质蛋白，作为分子伴侣协助细胞摄取脂肪酸，并参与脂解过程4。
用于分化实验的前体细胞为脂肪来源的间充质基质细胞（ASCs）7,8。ASCs 与骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSCs）具有许多相似特性，后者是成人体内主要的间充质干细胞群体8,9。在临床应用中，ASCs 相较于 BM-MSCs 具有多项优势，因其可从更易获取的组织来源中分离出更高产量的细胞8,9。分离得到的细胞群体需满足特定标准方可被定义为 ASCs。首先，在标准培养条件下，这些细胞必须能够贴附于塑料培养器皿表面1。其次，它们必须表达特定的表面抗原1。未培养的 ASCs 特征表现为 CD34、CD73、CD90 表面抗原表达阳性，CD105 表达水平较低，而 CD45 和 HLA-DR 表达阴性10。经塑料培养皿培养 28 天后纯化的 ASCs（贴壁纯化 ASCs）表现为 CD73、CD90 和 CD105 表达阳性，而 CD34、CD45 和 HLA-DR 表达阴性10。最后，这些细胞必须保留向多种谱系分化的潜能1,7,8。
脂肪生成分化方案会诱导FABP4表达及其他脂肪细胞谱系基因的显著上调，因此我们采用免疫化学方法在细胞内可视化FABP4蛋白，并利用自动化的荧光高内涵筛选显微镜在单细胞水平上定量FABP4的表达。该方法相较于传统染料具有优势，能够实现对脂肪细胞谱系分化的高度特异性确认。此类基因特异性的谱系检测方法结合高内涵筛选技术，还可量化在异质性细胞样本中能够向特定谱系分化的细胞所占比例。在我们的研究中，我们利用FABP4检测来确认新鲜分离的ASCs在细胞培养后脂肪生成分化潜能的丧失。

<table><tbody><tr><td>Tris 碱</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td>Tris 缓冲盐水</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>1064041000</td><td>Tris 缓冲盐水</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td>Tris 缓冲盐水</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Scharlau</td><td>SO0091</td><td>酪蛋白封闭液</td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma</td><td>C7078-500G</td><td>酪蛋白封闭液</td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>磷酸盐缓冲盐水</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10091-148</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶（1X），无酚红</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>细胞解离酶</td></tr><tr><td>96 孔板（平底）</td><td>Falcon</td><td>FAL353072</td><td>细胞培养设备</td></tr><tr><td>T75 培养瓶，带滤膜瓶盖</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td>细胞培养设备</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>19278-5ML</td><td>成脂分化培养基</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td>成脂分化培养基</td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td>成脂分化培养基</td></tr><tr><td>油红 O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td>成脂作用的经典染色剂</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td>成脂作用的经典染色剂</td></tr><tr><td>16% 甲醛</td><td>Pierce</td><td>28908</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>抗兔 IgG Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11008</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>硫柳汞</td><td>Sigma</td><td>T5125-10G</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>兔抗人脂肪酸结合蛋白 4（FABP4）抗体</td><td>Cayman Chemicals</td><td>10004944</td><td>成脂作用的标志物</td></tr><tr><td>离心管（15 mL）</td><td>Greiner</td><td>GR188271</td><td>通用</td></tr><tr><td>离心管（50 mL）</td><td>Greiner</td><td>GR227261-P</td><td>通用</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>高内涵筛选仪器</td></tr><tr><td>MetaXpress</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>高内涵筛选软件，版本 5.4.01</td></tr></tbody></table>

利用谱系特异性标记物对间充质细胞成脂分化潜能的可视化与定量分析

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

目前有多种染料可用于检测间充质细胞向脂肪细胞的分化。例如油红O（Oil Red O）等染料价格低廉、使用简便，被分析间充质细胞成脂潜能的实验室广泛采用。然而，这些染料并不能特异性地反映基因转录水平的变化。我们开发了一种基因特异性的分化检测方法，用于分析间充质细胞何时转变为成脂谱系。通过针对脂肪酸结合蛋白-4（FABP4）——一种成脂分化谱系特异性标志物——进行免疫标记，可实现对已分化细胞的可视化和定量分析。该方法能够在96孔微孔板体系中定量评估间充质细胞的成脂分化潜能，具有广泛的应用前景。目前已有数百项临床试验涉及使用成人间充质基质细胞，但要在这些临床试验内部尤其是不同试验之间关联治疗效果仍十分困难。这种简便的高通量FABP4检测方法为评估患者来源细胞的分化潜能提供了定量手段，也是比较不同分离与扩增方法的有力工具。鉴于人们日益认识到间充质细胞产品中所给予患者的细胞具有异质性，这一点尤为重要。此外，该检测方法在高通量药物筛选中也具有潜在应用价值，特别是在肥胖症和糖尿病前期研究领域。

本研究中，采用3种不同方法检测了ASCs的成脂分化潜能。FABP4的免疫荧光标记显示，该标志物定位于分化细胞的细胞质中，且其标记信号与DAPI标记的细胞核存在重叠（图1A）。自动图像分析结果显示，在早期传代细胞中，分化组FABP4阳性细胞比例较对照组增加了24.6倍，而在晚期传代细胞中仅增加了6.9倍（图1B）。油红O染色定位于分化细胞胞质中分散的脂滴，其染色信号极少与DAPI标记的细胞核重叠；然而通过肉眼观察可见，晚期传代细胞中与油红O脂滴相关的细胞核数量少于早期传代细胞（图2A）。自动图像分析显示，早期传代细胞中每个细胞的油红O染色面积增加了11.1倍，而晚期传代细胞中则增加了53.9倍（图2B）。两种染色均进行了成像，并使用软件中的Cell Scoring模块（FABP4）或Transfluor模块（油红O）进行定量分析（补充图1，补充表2-5）。FABP4表达上调通过Western blot分析得到验证（图3，补充图5）。三种分析方法均表明，早期传代ASCs的成脂分化潜能高于晚期传代细胞。成脂分化对每孔总细胞数量无显著影响（补充图2、3）。然而，仅在晚期传代ASCs中，FABP4阳性分化细胞的细胞核尺寸显著小于对照组细胞（补充图3）。
我们证明，随着细胞在培养过程中扩增或传代，培养物中具有成脂分化能力的细胞比例下降，这与先前发表的数据一致11。需要注意的是，本研究未能控制年龄、体重指数或既往病史等因素12，这些因素可能导致不同供体样本之间出现差异（补充表1）。
<img alt="脂肪生成分化成像、FABP4染色、DAPI合并、分割图像、柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：FABP4免疫标记显示，早期传代细胞比晚期传代细胞具有更强的分化潜能。 A) 展示了早期与晚期传代、对照组及分化后细胞的代表性图像，细胞经DAPI（细胞核染色）和FABP4标记，并附有合并图像及分割图像。分割图像中，分化细胞以绿色覆盖显示，未分化细胞以红色覆盖显示。B) 早期和晚期传代细胞在脂肪生成分化过程中均观察到表达FABP4的细胞数量显著增加，但早期传代细胞的分化程度显著高于晚期传代细胞（Mann Whitney检验，*表示P&lt;0.05，***表示P&lt;0.001）。所示数据为早期传代（p4；n=8）或晚期传代（p10；n=4）供体样本的平均值，误差线表示标准误（± SEM）。 <a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂肪成脂分化显微镜结果；DAPI、油红O染色、分割分析、柱状图分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2油红O染色显示，早期传代细胞的分化潜能高于晚期传代细胞。 A) DAPI（细胞核染色）与 Oil Red O（灰色，脂滴染色）的代表性图像分别展示，并附有合并图像及分割图像。分割图像中，所有细胞核以绿色覆盖显示，Oil Red O 染色的脂滴以红色覆盖显示。B) 随着脂肪向分化过程，Oil Red O 染色面积显著增加。早期传代细胞每细胞的 Oil Red O 染色面积大于晚期传代细胞。每细胞 Oil Red O 染色面积（μm2) 在此用作衡量脂肪向分化潜能的指标。所示数据为早期传代（p4；n=8）或晚期传代（p10；n=4）供体样本的平均值，误差范围为±标准误（SEM），Mann-Whitney检验，*表示P=&lt;0.05，*** 表示 P=&lt;0.001). <a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="早期和晚期细胞传代中FABP4和ACTB表达的Western印迹分析，含分化效应的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：分化后的早期和晚期传代ASCs中FABP4蛋白表达水平的Western印迹分析。 以总蛋白上样量内参β-肌动蛋白（ACTB）为参照，对FABP4条带的光密度进行半定量分析，结果显示，早期传代分化细胞中FABP4免疫染色显著升高，晚期传代分化细胞中升高程度较低。数据为早期传代（p4；n=8）或晚期传代（p10；n=4）供体样本的平均值，误差范围以±SEM表示（Mann Whitney检验，*表示P=&lt;0.05，*** 表示 P=&lt;0.001). <a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶抗原</td>
			<td>同种型（克隆号）</td>
			<td>种属</td>
			<td>稀释比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FABP4</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Rabbit</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：一抗
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶向抗体</td>
			<td>荧光染料标记</td>
			<td>物种</td>
			<td>稀释比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG</td>
			<td>Alexa fluoro 488</td>
			<td>Goat</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：二抗
补充图1：图像分析虚拟环境概述。 采用自动化高通量荧光显微镜对染色细胞进行成像，以避免任何潜在的偏差来源。使用ImageXpress Micro XLS获取的图像将直接保存至MDCStore数据管理器数据库，并可通过虚拟桌面连接进行查看，供用户优化和测试其特定的分析参数。图像通过专用的“自动运行”实例进行分析，该实例允许多个不同用户向自动运行队列提交“任务”。用户可在其“任务”完成后，通过虚拟实例获取分析数据。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
补充图2：使用FABP4染色板对早期和晚期传代ASCs的对照组和分化组每孔总细胞数进行比较。 所示数据为早期传代（p4；n=8）或晚期传代（p10；n=4）供体样本的平均值，误差线表示标准误（± SEM）。早期和晚期传代ASCs的对照组与分化组之间细胞数均无统计学显著差异。早期传代细胞每孔的细胞数多于晚期传代细胞。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_2.tif" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
补充图3：使用油红O染色板对早期和晚期传代ASCs的对照组和分化组每孔总细胞数的比较。 所示数据为早期传代（p4；n=8）或晚期传代（p10；n=4）供体样本的平均值，误差范围为±标准误（SEM）。早期和晚期传代ASCs的对照组与分化组细胞之间均无统计学显著差异。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_3.tif" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
补充图4：在后续传代中，FABP4阳性的分化细胞的核面积显著小于对照孔中的细胞。 早期传代中，对照组与分化细胞的细胞核面积之间无统计学显著差异。所示数据为早期传代（p4；n=8）或晚期传代（p10；n=4）供体样本的平均值，± SEM。（非配对t检验。***表示P=&lt;0.001）。数据以均值 ± 标准误表示。） <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_4.tif" target="_blank">请点击此处下载该图片。</a>
补充图5：Western印迹凝胶图像。红色通道显示β-actin，绿色通道显示FABP4免疫标记。 <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_5.tiff" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
补充表1：供体的临床病理学信息 <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 2：成像参数（FABP4） <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表3：成像设置（油红O） <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_3.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表4：所用分析参数表（FABP4）。细胞评分模块。 <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_4.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表5：分析参数表（油红O染色）。Trans Fluor模块。 <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_5.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

评估脂肪生成分化的传统方法成本低廉且易于使用，但无法特异性检测基因表达的变化。我们开发了一种利用谱系特异性标记物来定量间充质细胞分化为成熟脂肪细胞的检测方法。该方法在基础研究和临床医学中具有广泛的应用前景。

目前有多种染料可用于检测间充质细胞向脂肪细胞的分化。例如油红O等染料价格低廉、操作简便……

本实验的总体目标是利用谱系特异性蛋白标志物脂肪酸结合蛋白4，对间充质细胞向脂肪生成谱系的分化过程进行可视化和定量分析。首先分离并扩增目标间充质细胞，随后收获这些细胞并接种至标准的体外培养板中。培养数天后，细胞用成脂分化培养基处理。细胞继续培养14天，并定期更换培养基。分化完成后，细胞经固定后用针对脂肪酸结合蛋白4的抗体进行染色。采用自动化高内涵筛选免疫荧光显微镜对微孔板中的标记细胞进行成像。随后使用专业的图像分析软件对分化程度进行定量分析。与传统的利用油红O等染料检测脂肪向分化的方法相比，本视频所述实验方法采用针对谱系特异性蛋白——脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein four）的抗体，以确认脂肪向分化。通过这种方法，可定量分析与脂肪向分化相关的基因表达变化。该检测方法能够提供大量信息，包括分化细胞的百分比、单个细胞的荧光信号强度以及细胞形态的变化。对多种特征进行分析的能力，有助于识别不同处理条件下分化过程中可能存在的细微变化。该检测还具有高通量能力，非常适合用于高通量药物筛选应用。用完全ASC培养基重悬细胞，该培养基为添加了10%胎牛血清、GlutaMAX和抗生素的DMEM/F-12基础培养基。将细胞悬液以每孔5000个细胞的密度移入96孔培养板中。每个供体需要八个孔。其中四个孔加入对照培养基，其余孔加入分化培养基。每种处理的第四个孔将作为主要对照节点。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳气氛条件下培养四天。目的是使细胞在每个孔中生长至融合。第四天时，将培养板从培养箱中取出。从每个孔中移除一半的培养基。加入等体积的完全ASC培养基或成脂分化培养基，后者添加了胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松和吲哚美辛。将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。充分分化所需的时间为14天。在此期间，每两到三天更换一次培养基以补充培养液。分化完成后，将培养板从培养箱中取出。小心地将每孔中的所有培养基吸出。通过加入冰冷的甲醇固定细胞，在室温下孵育五分钟。除去甲醇，然后用Tris缓冲盐水洗涤。加入0.25%的酪蛋白阻断剂进行封闭。室温孵育10分钟。去除酪蛋白，然后用Tris缓冲盐水洗涤。将抗FABP4抗体用抗体稀释缓冲液稀释200倍，配制一抗混合液。除预留作为空白一抗对照的孔外，向所有孔中加入该混合液。改为向这些孔中加入抗体稀释缓冲液。室温孵育一小时。孵育结束后，用Tris缓冲盐水洗涤细胞一次。取出后加入新鲜的Tris缓冲盐水，在摇床中孵育五分钟。重复此步骤两次。通过将Anti-Rabbit Alexa 488二抗用抗体稀释缓冲液稀释200倍，制备第二抗体混合液。加入DAPI（终浓度为1:2000），用于标记细胞核。将混合液加入所有孔中，并用铝箔包裹培养板以防止光漂白。室温避光孵育30分钟。孵育后，用 TBS 洗涤细胞，并在摇床上再进行两次每次 15 分钟的洗涤。移除孔板中的所有缓冲液，加入含有 0.4 毫克/毫升硫柳汞的储存缓冲液，以防止细菌生长。使用配备自动载物台、聚焦物镜和滤光片的高内涵筛选仪对本生物测定进行成像。检查是否已安装正确的滤光片。为获得最佳质量，清洁板的底部。将板放入载物台时，确保 A1 位于左上角。使用孔板采集向导记录实验的关键信息，例如孔板编号、放大倍数、日期、实验条件和标记细节。选择所使用的微孔板类型。用户可选择待采集的孔位及采集位点的数量。通过高亮网格来选择所有需要成像的孔。将载物台移动至最亮的孔。选择最亮的孔可确保所有图像的像素灰度值均处于线性范围内，从而与染色强度成正比。如果未执行此步骤，则在较亮孔中拍摄的图像可能会过饱和。为实验选择合适的通道组合、曝光时间以及Z轴偏移参数。用于FABP4和DAPI成像的滤光片应与用于显示染色的特定标记相对应。Alexa 488 的激发波长为 480 纳米，发射波长为 560 纳米，用于可视化 FABP4。DAPI 染料的激发波长为 360 纳米，发射波长为 460 纳米，用于可视化细胞核。对于用油红 O 标记的培养板，脂滴通过明亮的透射光进行观察。同时，油红O染料也可通过荧光观察，其激发波长为575纳米，发射波长为630纳米。当所有设置完成后，即可开始采集生物学检测图像。图像将自动保存至在线服务器，便于远程便捷访问。通过远程桌面程序可以访问存储在在线服务器上的完整图像集。随后可使用 MetaXpress 软件对图像进行分析。细胞评分应用程序允许用户选择用于检测某个视野中所有细胞核的波长，例如本实例中的 DAPI。后续的波长可用于检测细胞核、细胞质或同时在这两个细胞位置中的阳性标志物。脂肪酸结合蛋白4（FABP4）是脂肪生成谱系的标志物。FABP4的表达定位于分化后的脂肪细胞的细胞核和细胞质中。在此生物学检测中，我们使用细胞评分模块分析FABP4的表达。首先，利用DAPI通道检测细胞核，根据用户自定义的参数设定高于背景的信号大小和强度。然后，利用足部C通道检测FABP4信号，并根据用户自定义的参数设定高于背景的信号大小和强度。在此项生物学检测中，使用 MetaXpress 平台的 Can 模块 Transflour 分析在 560 纳米波长范围内发出荧光的油红 O 标记的脂滴。该分析算法通过 DAPI 标记的细胞核来识别全部细胞，所识别的细胞核需满足用户设定的细胞大小和染色强度标准。用户还需设定凹坑的大小和强度参数，在本实验中用于检测紧邻细胞核的脂滴。Transflour 检测记录了脂滴大小、染色强度以及每个细胞中脂滴数量等信息。需要注意的是，油红 O 标记物可能从某些细胞中泄漏或溶解出来，这可能会限制并干扰对实际分化程度的准确判断。图中展示了早期和晚期传代的对照细胞及分化细胞的代表性图像，细胞经 DAPI（细胞核染色剂）和 FABP4 标记，并附有合并图像及分割图像。分割图像显示已分化细胞具有绿色覆盖层，未分化细胞具有红色覆盖层。表达FABP4的细胞百分比被用作衡量脂肪向分化潜能的指标。在早期和晚期传代细胞中，经脂肪向分化后，表达FABP4的细胞比例显著增加。早期传代细胞的分化程度显著高于晚期传代细胞。DAPI和油红O的代表性图像与合并图像及分割图像一并展示。分割图像中，所有细胞核以绿色叠加显示，油红O染色的脂滴以红色叠加显示。每细胞的油红O染色面积被用作衡量脂肪向分化潜能的指标。在脂肪向分化过程中，观察到油红O染色面积显著增加。与晚期传代细胞相比，早期传代细胞每细胞的油红O染色面积更大。通过 Western 印迹分析早期和晚期传代的 ASCs 分化后 FABP4 蛋白的表达水平。对 FABP4 条带的光密度进行半定量分析，以总蛋白上样量对照为比值，结果显示，早期传代分化细胞中 FABP4 免疫信号显著升高，晚期传代分化细胞中也有一定程度的升高。通过观看本视频，您应已了解如何将干细胞诱导分化为脂肪细胞谱系，如何使用脂肪细胞基因特异性标志物——脂肪酸结合蛋白 4（fatty acid binding protein four）进行免疫荧光染色，以及最终如何对表达脂肪酸结合蛋白 4 的细胞中所有相关形态学特征进行成像与分析。希望这个视频对您的研究有所帮助。

visualization-quantification-mesenchymal-cell-adipogenic

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

带谱系特异标记的间充质细胞脂肪分化电位的可视化与量化

本方案描述了从猪皮下脂肪组织中分离猪脂肪源性干细胞（pADSC）并检测其多向分化潜能的方法。这种具有多向分化潜能的pADSC可用于阐明脂肪细胞分化过程，并研究其向中胚层间充质或其他外胚层和内胚层谱系细胞的转分化，以用于再生医学研究。...

从猪皮下脂肪组织中分离与分化脂肪源性干细胞

本文报道了一种利用磁性激活细胞分选（MCS）从血管周围脂肪组织（PVAT）中分离脂肪细胞前体细胞（APC）群体的方法。与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法可显著提高每克脂肪组织中APC的分离效率。...

通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

从脂肪组织血管前体细胞分化出白色和米色脂肪细胞在改善肥胖相关代谢方面具有潜在价值。本文描述了从人类脂肪组织中分离CD34+CD31+内皮细胞以及后续的分化方案 体外...

从人网膜和皮下脂肪组织中分离、扩增及诱导CD34+CD31+内皮细胞的脂肪生成

本实验方案的目的是检测来源于人血管周围脂肪组织的前体细胞向多个细胞谱系分化的能力。将这种分化能力与来源于人骨髓的间充质干细胞进行比较，后者已知可分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系。...

人主动脉周围血管脂肪前体细胞的分化潜能

从主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导神经嵴来源的脂肪干细胞向脂肪细胞分化

本方案概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中使用大鼠可提供更多的萎缩肌肉组织用于分析，并具备更丰富的已验证方法，用于评估自由活动动物的肌肉力量和步态。...

大鼠骨骼肌中纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）与肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离与表征

该方案可从诱导性多能干细胞（iPSCs）中获得纯化的脂肪细胞群体。首先使用视黄酸将iPSCs分化为间充质干细胞（MSCs），再利用这些MSCs生成脂肪细胞。随后，通过尼罗红染色结合分选方法，获得纯化的脂肪细胞。...

稳健地将人iPSCs分化为纯脂肪细胞群体以研究脂肪细胞相关疾病

前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。...

从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

本方案描述了一种经济高效的方法，用于纯化、扩增和表征小鼠来源的高度均一的骨髓间充质干细胞（BMSCs）。该方法有助于获得大量具有高增殖和分化潜能的BMSCs，可支持小鼠模型研究并推动临床前研究的进展。...

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增及基于流式细胞术的表型分析

了解使用谱系特异性标记物FABP4对间充质细胞进行脂肪分化的可视化与定量分析方法。该技术通过免疫荧光染色和高内涵筛选实现精准评估，适用于高通量药物筛选和细胞生物学研究。

利用谱系特异性标记物对间充质细胞成脂分化潜能的可视化与定量分析

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