利用谱系特异性标记物对间充质细胞成脂分化潜能的可视化与定量分析

本实验的总体目标是利用谱系特异性蛋白标志物脂肪酸结合蛋白4，对间充质细胞向脂肪生成谱系的分化过程进行可视化和定量分析。首先分离并扩增目标间充质细胞，随后收获这些细胞并接种至标准的体外培养板中。

培养数天后，细胞用成脂分化培养基处理。细胞继续培养14天，并定期更换培养基。分化完成后，细胞经固定后用针对脂肪酸结合蛋白4的抗体进行染色。

采用自动化高内涵筛选免疫荧光显微镜对微孔板中的标记细胞进行成像。随后使用专业的图像分析软件对分化程度进行定量分析。与传统的利用油红O等染料检测脂肪向分化的方法相比，本视频所述实验方法采用针对谱系特异性蛋白——脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein four）的抗体，以确认脂肪向分化。

通过这种方法，可定量分析与脂肪向分化相关的基因表达变化。该检测方法能够提供大量信息，包括分化细胞的百分比、单个细胞的荧光信号强度以及细胞形态的变化。对多种特征进行分析的能力，有助于识别不同处理条件下分化过程中可能存在的细微变化。

该检测还具有高通量能力，非常适合用于高通量药物筛选应用。用完全ASC培养基重悬细胞，该培养基为添加了10%胎牛血清、GlutaMAX和抗生素的DMEM/F-12基础培养基。将细胞悬液以每孔5000个细胞的密度移入96孔培养板中。

每个供体需要八个孔。其中四个孔加入对照培养基，其余孔加入分化培养基。每种处理的第四个孔将作为主要对照节点。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳气氛条件下培养四天。目的是使细胞在每个孔中生长至融合。第四天时，将培养板从培养箱中取出。

从每个孔中移除一半的培养基。加入等体积的完全ASC培养基或成脂分化培养基，后者添加了胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松和吲哚美辛。将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。

充分分化所需的时间为14天。在此期间，每两到三天更换一次培养基以补充培养液。分化完成后，将培养板从培养箱中取出。

小心地将每孔中的所有培养基吸出。通过加入冰冷的甲醇固定细胞，在室温下孵育五分钟。

除去甲醇，然后用Tris缓冲盐水洗涤。加入0.25%的酪蛋白阻断剂进行封闭。室温孵育10分钟。

去除酪蛋白，然后用Tris缓冲盐水洗涤。将抗FABP4抗体用抗体稀释缓冲液稀释200倍，配制一抗混合液。除预留作为空白一抗对照的孔外，向所有孔中加入该混合液。

改为向这些孔中加入抗体稀释缓冲液。室温孵育一小时。孵育结束后，用Tris缓冲盐水洗涤细胞一次。

取出后加入新鲜的Tris缓冲盐水，在摇床中孵育五分钟。重复此步骤两次。通过将Anti-Rabbit Alexa 488二抗用抗体稀释缓冲液稀释200倍，制备第二抗体混合液。

加入DAPI（终浓度为1:2000），用于标记细胞核。将混合液加入所有孔中，并用铝箔包裹培养板以防止光漂白。室温避光孵育30分钟。

孵育后，用 TBS 洗涤细胞，并在摇床上再进行两次每次 15 分钟的洗涤。移除孔板中的所有缓冲液，加入含有 0.4 毫克/毫升硫柳汞的储存缓冲液，以防止细菌生长。使用配备自动载物台、聚焦物镜和滤光片的高内涵筛选仪对本生物测定进行成像。

检查是否已安装正确的滤光片。为获得最佳质量，清洁板的底部。将板放入载物台时，确保 A1 位于左上角。

使用孔板采集向导记录实验的关键信息，例如孔板编号、放大倍数、日期、实验条件和标记细节。选择所使用的微孔板类型。用户可选择待采集的孔位及采集位点的数量。

通过高亮网格来选择所有需要成像的孔。将载物台移动至最亮的孔。选择最亮的孔可确保所有图像的像素灰度值均处于线性范围内，从而与染色强度成正比。

如果未执行此步骤，则在较亮孔中拍摄的图像可能会过饱和。为实验选择合适的通道组合、曝光时间以及Z轴偏移参数。用于FABP4和DAPI成像的滤光片应与用于显示染色的特定标记相对应。

Alexa 488 的激发波长为 480 纳米，发射波长为 560 纳米，用于可视化 FABP4。DAPI 染料的激发波长为 360 纳米，发射波长为 460 纳米，用于可视化细胞核。对于用油红 O 标记的培养板，脂滴通过明亮的透射光进行观察。

同时，油红O染料也可通过荧光观察，其激发波长为575纳米，发射波长为630纳米。当所有设置完成后，即可开始采集生物学检测图像。图像将自动保存至在线服务器，便于远程便捷访问。

通过远程桌面程序可以访问存储在在线服务器上的完整图像集。随后可使用 MetaXpress 软件对图像进行分析。细胞评分应用程序允许用户选择用于检测某个视野中所有细胞核的波长，例如本实例中的 DAPI。

后续的波长可用于检测细胞核、细胞质或同时在这两个细胞位置中的阳性标志物。脂肪酸结合蛋白4（FABP4）是脂肪生成谱系的标志物。FABP4的表达定位于分化后的脂肪细胞的细胞核和细胞质中。

在此生物学检测中，我们使用细胞评分模块分析FABP4的表达。首先，利用DAPI通道检测细胞核，根据用户自定义的参数设定高于背景的信号大小和强度。然后，利用足部C通道检测FABP4信号，并根据用户自定义的参数设定高于背景的信号大小和强度。

在此项生物学检测中，使用 MetaXpress 平台的 Can 模块 Transflour 分析在 560 纳米波长范围内发出荧光的油红 O 标记的脂滴。该分析算法通过 DAPI 标记的细胞核来识别全部细胞，所识别的细胞核需满足用户设定的细胞大小和染色强度标准。用户还需设定凹坑的大小和强度参数，在本实验中用于检测紧邻细胞核的脂滴。

Transflour 检测记录了脂滴大小、染色强度以及每个细胞中脂滴数量等信息。需要注意的是，油红 O 标记物可能从某些细胞中泄漏或溶解出来，这可能会限制并干扰对实际分化程度的准确判断。图中展示了早期和晚期传代的对照细胞及分化细胞的代表性图像，细胞经 DAPI（细胞核染色剂）和 FABP4 标记，并附有合并图像及分割图像。

分割图像显示已分化细胞具有绿色覆盖层，未分化细胞具有红色覆盖层。表达FABP4的细胞百分比被用作衡量脂肪向分化潜能的指标。在早期和晚期传代细胞中，经脂肪向分化后，表达FABP4的细胞比例显著增加。

早期传代细胞的分化程度显著高于晚期传代细胞。DAPI和油红O的代表性图像与合并图像及分割图像一并展示。分割图像中，所有细胞核以绿色叠加显示，油红O染色的脂滴以红色叠加显示。

每细胞的油红O染色面积被用作衡量脂肪向分化潜能的指标。在脂肪向分化过程中，观察到油红O染色面积显著增加。与晚期传代细胞相比，早期传代细胞每细胞的油红O染色面积更大。

通过 Western 印迹分析早期和晚期传代的 ASCs 分化后 FABP4 蛋白的表达水平。对 FABP4 条带的光密度进行半定量分析，以总蛋白上样量对照为比值，结果显示，早期传代分化细胞中 FABP4 免疫信号显著升高，晚期传代分化细胞中也有一定程度的升高。通过观看本视频，您应已了解如何将干细胞诱导分化为脂肪细胞谱系，如何使用脂肪细胞基因特异性标志物——脂肪酸结合蛋白 4（fatty acid binding protein four）进行免疫荧光染色，以及最终如何对表达脂肪酸结合蛋白 4 的细胞中所有相关形态学特征进行成像与分析。

希望这个视频对您的研究有所帮助。