带谱系特异标记的间充质细胞脂肪分化电位的可视化与量化
March 31st, 2018
传统的评价脂肪分化的方法既便宜又容易使用, 但并不特定于基因表达的变化。我们已经开发出一种用谱系特异标记将间充质细胞分化为成熟脂肪的实验。这种检测方法在基础研究和临床医学中有不同的应用。
该程序的总体目标是使用谱系特异性蛋白质标记物脂肪酸结合蛋白 4 可视化和量化基质细胞向成脂谱系的分化。这是通过首先分离和扩增目标基质细胞来实现的。然后收获基质细胞并接种到标准体外培养板中。
孵育几天后，用成脂分化培养基处理细胞。将细胞孵育 14 天，并定期更换培养基。分化后，固定细胞并用抗脂肪酸结合蛋白 4 的抗体染色。
使用自动高内涵筛选免疫荧光显微镜捕获微孔板中标记细胞的图像。然后使用专门的图像分析软件对差异化进行量化。与使用染料（如 Oil Red O）测量成脂分化的传统方法相比，本视频中描述的检测利用针对谱系特异性蛋白脂肪酸结合蛋白 4 的抗体来确认成脂分化。
在此过程中，该方法量化了对应于成脂分化的基因表达变化。该检测能够提供丰富的信息，包括分化细胞的百分比、每个细胞的荧光信号强度以及细胞形态的变化。分析多种特征的能力能够识别响应各种处理的潜在细微分化变化。
该分析还具有高穿透拉力，使其成为高穿透拉力药物筛选应用的理想选择。将细胞重悬于完全 ASC 培养基中，该培养基是 DMEM/F-12 基础培养基，补充有 10% 胎牛血清、GlutaMAX 和抗生素。移液到 96 孔培养板中，每孔 5000 个细胞。
每个供体需要 8 个孔。4 个孔接收对照培养基，而其余孔接收分化培养基。每次处理的每四个孔将用于节点初级对照。
在 37 度下孵育细胞，在 5% 二氧化碳的大气条件下加湿 4 天。这是为了让细胞在每个孔中生长到汇合。第 4 天，将板从培养箱中取出。
从每个孔中取出一半的介质。加入等体积的完全 ASC 培养基或成脂分化培养基，其中补充有胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松和吲哚米松。在 37 度下孵育板，在 5% 二氧化碳的大气条件下加湿。
充分区分所需的时间为 14 天。在此期间，通过每 2 到 3 天执行一次介质更换来补充介质。分化后，从培养箱中取出板。
小心地从每个孔中移出所有培养基。通过添加冰冷的甲醇来固定细胞。在室温下孵育 5 分钟。
除去甲醇，然后用 Tris 缓冲盐水洗涤。通过添加 0.25% 的酪蛋白阻断剂进行封闭。在室温下孵育 10 分钟。
去除酪蛋白，然后用 Tris 缓冲盐水洗涤。通过在抗体稀释缓冲液中将抗 FABP4 抗体稀释 200 倍来制备一抗混合物。将混合物添加到所有孔中，但保留为节点主要对照的孔除外。
向这些孔中加入抗体稀释缓冲液。在室温下孵育 1 小时。孵育后，用 Tris 缓冲盐水洗涤细胞一次。
取出，加入新鲜的 Tris 缓冲盐水，在摇床上孵育 5 分钟。重复此过程两次。通过在抗体稀释缓冲液中将抗兔 Alexa 488 第二再抗体稀释 200 倍来制备第二种再抗体混合物。
添加标记细胞核的 DAPI，最终稀释度为 1 至 2000。将混合物添加到所有孔中，并用箔纸包裹板以防止光漂白。在室温下孵育 30 分钟。
孵育后，用 TBS 洗涤细胞，然后在摇床上再洗涤两次 15 分钟。从孔中取出所有缓冲液并加入储存缓冲液，补充 0.4 毫克/毫升硫柳汞，以防止细菌生长。配备自动载物台、聚焦物镜和滤光片的高内涵筛选机用于对该生物测定进行成像。
检查过滤器是否正确。清洁板的底部以获得最佳质量。将板装入载物台，A1 位于左上角。
使用板采集向导，记录有关实验的基本信息，例如板号、放大倍率、日期、实验条件和标记详细信息。选择使用的微孔板类型。用户可以选择井和要采集的站点数量。
通过突出显示网格来选择要成像的所有井。将载物台移至最亮的井。选择最亮的井将确保所有图像都将使用线性范围内的像素灰度值获取，因此与染色强度成正比。
如果不执行此步骤，则在较亮的孔中拍摄的图像可能会过度饱和。为实验选择合适的通道组合、曝光时间和 Z 偏移参数。用于 FABP4 和 DAPI 成像的滤光片对应于用于可视化染色的特定标记。
Alexa 488 在 480 纳米处激发，在 560 纳米处发射，用于可视化 FABP4。DAPI染料在360纳米处激发，在460纳米处发射，用于观察细胞核。对于用油红 O 标记的板，脂肪滴在明亮的燃料透射光下可见。
油红 O 标记也用荧光可视化，因为它在 575 纳米处激发，在 630 纳米处发射。所有设置完成后，即可进行生物测定。图像会自动保存到在线服务器，以便轻松远程访问图像。
存储在在线服务器上的完整图像集可以使用远程桌面程序访问。然后可以使用 MetaXpress 软件分析图像。细胞评分应用程序允许用户选择用于检测场中所有细胞核的波长，例如在这种情况下，DAPI。
后续波长可用于检测细胞核、细胞质或两者细胞位置的阳性标志物。脂肪酸结合蛋白 4 或 FABP4 是成脂谱系的标志物。FABP4 的表达定位于分化脂肪细胞的细胞核和细胞质。
在该生物测定中，我们使用细胞评分模块分析 FABP4 表达。首先，使用 DAPI 通道检测细胞核，使用用户定义的大小和背景信号强度参数。使用脚 C 通道检测 FABP4 信号，以及用户定义的背景以上大小和信号强度参数。
在该生物测定中，使用 MetaXpress 罐模块 Transflour 分析了荧光在 560 纳米范围内的油红-O 标记的脂肪滴。该分析算法使用 DAPI 标记的细胞核检测总细胞，这些细胞核符合用户指定的细胞大小和染色强度标准。用户还指定了凹坑的大小和强度，在这种情况下，凹坑可以检测细胞核附近的脂肪滴。
Transflour 测定记录有关脂肪滴大小、染色强度、每个细胞数量的信息。需要注意的是，油红 O 标记确实泄漏或溶解了某些细胞，这可能会限制和混淆发生的真实分化量。用 DAPI、核染色和 FABP4 标记的早期和晚期传代细胞、对照细胞和分化细胞的代表性图像与合并和分割图像一起显示。
分割图像显示带有绿色叠加层的分化细胞和带有红色叠加层的未分化细胞。表达 FABP4 的细胞百分比用作成脂分化电位的量度。在早期和晚期传代细胞中观察到成脂分化时，表达 FABP4 的细胞显著增加。
早期传代细胞的分化增加显著大于晚期传代细胞。DAPI 和 Oil Red O 的代表性图像与合并和分割图像一起显示。分割图像用绿色覆盖描绘了所有细胞核，用红色覆盖描绘了油红-O 染色的脂滴。
每个细胞的油红 O 染色面积用作成脂分化电位的量度。随着成脂分化，观察到油红 O 染色面积显着增加。与晚期传代细胞相比，早期传代细胞每个细胞的油红 O 染色面积更大。
Western blot 分析分化早期和晚期传代 ASCs 的 FABP4 蛋白表达水平。FABP4 条带光密度与总蛋白负载对照的比率的半定量分析表明，FABP4 免疫标记在早期传代中显著增加，而在较小程度上，晚期传代分化细胞增加。通过观看此视频，您应该已经了解了如何将干细胞分化为成脂谱系，如何使用成脂基因特异性标记物进行免疫荧光染色，脂肪酸结合蛋白 4，最后，如何成像和分析脂肪酸结合蛋白 4 免疫阳性细胞的所有相关形态特征。
我希望您发现此视频对您的研究有用。
概述
本文介绍了一种新型的检测方法，用于定量测定间充质细胞分化为成熟脂肪细胞的过程，使用一种系统特异性标记物，脂肪酸结合蛋白四。与传统技术相比，这种方法提高了脂肪分化评估的特异性。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 脂肪生成
- 免疫荧光
背景
- 传统的脂肪分化评估方法缺乏特异性。
- 系统特异性标记物可以提供更准确的测量。
- 高内容筛选技术允许对细胞分化进行详细分析。
- 了解脂肪分化对于各种生物医学应用至关重要。
研究目的
- 开发一种更为特异的测定脂肪分化的方法。
- 利用系统特异性蛋白质标记物进行定量。
- 为药物筛选应用提供高通量。
使用的方法
- 基质细胞的分离和扩展。
- 在脂肪分化培养基中培养细胞14天。
- 使用针对脂肪酸结合蛋白四的抗体进行免疫荧光染色。
- 自动高内容筛选用于图像采集和分析。
主要结果
- 分化细胞和荧光强度的定量。
- 分化过程中细胞形态变化的分析。
- 鉴定对治疗的细微分化变化。
- 展示了药物筛选的高通量能力。
结论
- 开发的检测方法提供了一种可靠的脂肪分化评估方法。
- 利用系统特异性标记物提高了分化测量的特异性。
- 这种方法对基础研究和临床应用都有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mesenchymal cell adipogenic differentiation using a lineage-specific marker (FABP4) addresses a critical need for predictive confidence in cell therapy and drug discovery pipelines. This high-content, gene-specific assay enables robust comparison of cell populations and manufacturing methods, supporting risk-adjusted decisions in preclinical and translational research. Its high-throughput format aligns with enterprise-scale screening and standardization requirements for cell-based product development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of adipogenic lineage commitment via gene-specific marker quantification.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing true differentiation from nonspecific lipid accumulation.
- Facilitates comparative analysis of donor variability and cell expansion protocols for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative outputs suitable for high-throughput compound screening in 96-well format.
- Improves assay reproducibility and cross-lab comparability through automated imaging and analysis.
- Enables reliable evaluation of differentiation-modulating agents in obesity and metabolic disease research.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation potential with translational biomarker (FABP4) relevant to clinical cell therapy products.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by quantifying functional cell attributes.
- Reduces biological risk by enabling batch-to-batch and donor-to-donor comparability in cell product development.
Pipeline & Workflow Integration
This FABP4-based assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational cell product evaluation.
- Discovery Biology: Provides quantitative hypothesis testing for adipogenic differentiation and pathway interrogation.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for scalable compound evaluation.
- Analytics: Generates multi-parametric readouts including differentiation percentage, fluorescence intensity, and morphology.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro differentiation with clinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse cell sources and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fate determination.
- Operational Value: Standardizes differentiation assessment and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling robust cross-study comparisons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell sources and manufacturing protocols.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, high-content imaging, and quantitative image analysis.
- Needs access to automated imaging platforms and specialized analysis software.
- Demands cross-team standardization of assay setup, imaging parameters, and data interpretation.
- Adaptable to various mesenchymal cell sources and expansion methods with appropriate controls.
- Potential limitations include antibody specificity and imaging saturation, requiring careful optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:55
Inducing the differentiation of human adipose derived stromal cells
3:36
Staining for differentiation
5:53
Imaging cells using high content screening microscope
8:23
Image Analysis: Cell Scoring
9:43
Image Analysis: Transfluor
10:43
Representative results
