共聚焦显微镜通过图像相关谱揭示细胞表面受体聚集
2018年8月2日
与细胞表面上的靶受体结合的抗体可以赋予构象和聚类改变。这些动态变化对表征靶细胞内药物的发展有影响。该协议利用共焦显微和图像相关光谱学通过 ImageJ/斐济, 以量化的程度, 受体聚类在细胞表面。
该图像相关光谱协议的总体目标是为量化细胞表面发生的聚类事件提供一种可访问的方法。与细胞表面受体结合的抗体可以赋予确认和聚集改变。对这些动态过程的分析对于药物靶标的表征非常重要。
该技术的主要优点是它提供了一种可访问的方法，用于使用易于访问的成像设备量化细胞表面的聚类事件。首先，将 10， 000 个 A431 表皮样癌细胞接种到八腔成像载玻片的每个孔中。第二天，向细胞中立即添加每毫升 100 纳克的 EGF 配体，以刺激 EGF 受体聚集。
在固定细胞之前，将细胞与配体在室温下孵育 10 分钟。接下来，遵循随附文本协议中的免疫细胞化学和共聚焦成像协议，密切注意收集过程中使用的设置，并将获取的数据集加载到斐济。必须避免过度饱和。
最终图像必须包含小于 1 平方微米的像素大小。此外，捕获顶端或基底表面的平坦表面以及无细胞区域，以便以后进行样品归一化。首先在第一张图像中确定感兴趣的顶端或基底细胞表面膜区域。
在 256 x 256、128 x 128 或 64 x 64 的范围内选择 2 到 n 的像素大小。然后，转到图像菜单，然后选择复制。接下来，转到 analyze，然后转到 measurements。
计算裁剪的感兴趣区域的平均强度。现在，从原始图像中识别相同大小的背景区域。像以前一样复制它。
并计算背景裁剪感兴趣区域的平均强度。测量感兴趣区域和背景后，转到 处理，然后选择 图像计算器.将感兴趣区域作为 Image 1 放置，将背景图像作为 Image 2 放置，然后选择 subtract 作为作。
接下来，转到 Process 菜单。转到 FFT 并选择 FD Math。在 FFT math （FFT 数学） 对话框中，选择 Enter the images （输入此处所示的图像），并将运算设置为 correlate。
确保逆变换处于打开状态。通过选择 process（处理），向下滚动到 math（数学），选择 divide（除法），然后在对话框中输入像素总数来标准化生成的图像。然后，通过除以标准化裁剪区域的平方的平均强度来再次标准化。
接下来，通过点扩散函数绘制一条线。通过转到 analyze（分析）并选择 plot profile（绘制曲线）来绘制此线的曲线以计算峰值。通过将峰值转移到电子表格来计算每个光束面积的簇数。
然后将每个光束面积的簇数设置为等于峰值减 1 的 1。为了批量处理图像，建议建立 Fiji 宏。这允许对多个共聚焦图像进行一致和快速的分析，以进行图像相关光谱分析。
要为图像相关光谱工作流程建立宏，请设置程序以记录协议中的每个菜单命令。为此，请转到 plug ins，向下到 marcos，然后选择 record。然后，返回到主窗口并运行本视频上一节中描述的协议。
完成后，返回到宏窗口，然后选择 create 以生成宏。接下来，在宏编辑窗口中，确保选择语言作为 LJ1 宏。如果未选择，程序将无法运行。
最后，保存宏。显微镜的光学传递函数确保即使是分子大小的物体在 XY 平面上也能显示为 200 至 300 纳米的图像。通过以与本协议中描述的细胞相同的方式对亚分辨率树脂珠进行成像，可以计算显微镜的点扩散函数的面积。
这些图像代表了 EGF 刺激和非模拟的贴壁 A431 表皮样癌细胞，这些细胞用靶向细胞表面 EGF 受体的西妥昔单抗一抗标记。黄色框表示包含像素尺寸为 64 x 64 的裁剪区域的细胞膜。这些图像用于进行图像相关光谱分析。
在自相关函数归一化后，可以使用线工具测量点扩散函数。绘制此线函数的轮廓以检测峰值。使用这些方法，观察到 EGF 刺激诱导的每束区域检测到的 EGFR 簇与未刺激的细胞相比减少了 2.56 倍。
掌握后，每张图像的共聚焦图像分析只需几分钟。在尝试此过程时，重要的是使用本协议中概述的设置收集每个实验条件的多个重复。按照此程序，可以扩展图像相关光谱，以使用延时显微镜探索活细胞中聚集事件的时间变化。
开发后，这项技术为研究人员使用光漂白 ICS 探索高阶聚集态铺平了道路，同时使用图像互相关光谱方法探索两种基于膜的蛋白质的共定位。观看此视频后，您应该对如何计算目标细胞表面分子的聚集状态有很好的了解。
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概述
本协议概述了一种使用图像相关光谱法来量化细胞表面受体聚集的方法。该技术对于理解药物靶点特征非常重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 药理学
背景
- 抗体可以诱导细胞表面受体的构象变化。
- 受体聚集对药物开发具有重要意义。
- 图像相关光谱法可以对这些过程进行详细分析。
- 易于使用的成像技术促进了更广泛的研究应用。
研究目的
- 量化细胞表面的聚集事件。
- 为研究人员提供可靠的协议。
- 增进对药物靶向中的受体动力学的理解。
使用的方法
- 共聚焦显微镜
- 图像相关光谱法
- 使用ImageJ/FIJI软件
- 细胞接种和EGF配体刺激
主要结果
- 实现了受体聚集的量化。
- 证明了EGF对受体聚集的影响。
- 为未来的研究提供了清晰的方法。
- 强调了受体动力学在药物开发中的重要性。
结论
- 该协议有效用于研究受体聚集。
- 易于使用的成像方法可以推进药物靶点研究。
- 理解受体动力学对于药理学应用至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying receptor aggregation on the cell surface provides critical insights into target engagement and mechanism of action for antibody-based therapeutics. This methodology enables preclinical assessment of receptor dynamics, supporting target validation and lead optimization by linking ligand-induced clustering to functional outcomes. Accessible confocal-based image correlation spectroscopy offers a scalable approach to de-risk therapeutic candidates through quantitative, reproducible measurements of membrane protein organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypothesis by quantifying ligand-induced receptor clustering as a functional readout of target engagement.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, reproducible assessment of receptor aggregation states using widely available confocal microscopy.
- Predictive Value: Provides quantitative data on receptor clustering that informs target confidence and portfolio triage decisions in early discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline receptor clustering metrics under controlled conditions.
- Reproducibility: Delivers quantitative, normalized outputs suitable for assay standardization and cross-laboratory comparability in target validation workflows.
- Scalability: Enables high-throughput analysis via Fiji macro automation, supporting consistent evaluation of compound effects on receptor dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses EGFR in A431 cells as a disease-relevant system to model receptor aggregation mechanisms applicable to oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by quantifying receptor dynamics that correlate with internalization and signaling outcomes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from receptor aggregation, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead identification, providing quantitative receptor clustering data that informs hit-to-lead progression and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring ligand-induced changes in receptor organization as a direct functional output of target modulation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts on receptor clustering that enable reliable comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Analytics: Generates normalized cluster density measurements per beam area, enabling statistical comparison of aggregation states under stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Connects in vitro receptor dynamics to preclinical relevance by modeling EGFR aggregation mechanisms observed in tumorigenic cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline via Fiji macros, allowing consistent application across multiple targets and experimental settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct quantification of receptor clustering events.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined imaging parameters, normalization protocols, and automated macro-based analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target engagement metrics to functional receptor aggregation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on receptor dynamics that inform advancement decisions in preclinical pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, fluorescent immunocytochemistry, and image analysis using Fiji/ImageJ.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate laser lines and detectors for fluorophore excitation.
- Necessitates standardization of cell seeding density, ligand stimulation timing, and imaging settings across experimental replicates.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different receptor systems, cell types, or fluorescent labels beyond EGFR and cetuximab.
- Limited to fixed-cell analysis in this protocol; temporal dynamics in live cells would require additional validation and optimization for time-lapse applications.
