Name: 细胞形态变化，从三维荧光图像量化的分析工具， (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 了解如何利用三维共聚焦荧光图像和Imaris、MATLAB软件平台，对化学刺激后的细胞形态变化进行自动化定量分析。该方法为药物发现中的单细胞表型研究提供了高效工具。

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我们感谢加州大学旧金山分校生物成像开发中心（BIDC）提供 Imaris、Imaris XT 和 Matlab 软件的使用权限。感谢 V. Kharazia 提供的技术支持，感谢 A.T. Henry、L.K. Floren 和 L. Daitch 在稿件编辑过程中的贡献。本研究获得了以下资助：加州酒精与药物滥用医学研究项目通过加州大学旧金山分校（UCSF）对 SEB 的资助，美国国立卫生研究院（NIH）项目 1R21DA029966-01 及 NIH 快速通道奖（用于对 MLSMR 化合物库进行筛选，授予 SEB），以及加州大学旧金山分校药学院（院长办公室和临床药学系）和医学院（临床药理学与实验治疗学系）对 CLHK 的资助。

1. 单细胞表型变化的三维形态计量分析
<ol>
	<li>采用血凝素（HA）标签的促肾上腺皮质激素释放因子受体-2（CRF-R2）转染人胚肾（HEK293）细胞，该受体为G蛋白偶联受体（GPCR），转染方法如前所述4, 5。</li>
	<li>细胞分别进行如下处理：不作处理（无处理，NT）、用CRF-R2内源性配体促肾上腺皮质激素释放因子（CRF，1 μM，30 min）刺激，或在激动剂处理前先用选择性CRF-R2拮抗剂anti-sauvagine 30（AS-30，1 μM，30 min）预处理。</li>
	<li>随后将细胞固定、通透化，并用抗HA抗体处理。使用Alexa 594 nm偶联的抗小鼠（IgG1）抗体对CRF-R2进行荧光标记，DAPI用于显示细胞核的有丝分裂阶段。</li>
	<li>为减少实验人员主观偏差，在图像采集和分析完成前，实验人员对实验分组情况保持盲态。</li>
	<li>使用配备Coherent集成双光子激光系统（包括Verdi-V5激光器和Mira 900-F激光系统）的Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜，结合Plan-apochromat 63x/1.4油镜DIC物镜，采集固定后的HEK293细胞图像。</li>
	<li>在数据采集过程中，通过多光谱切片（488 nm和790 nm，约350 nm双光子激发）和z轴分层扫描（0.5 μm步进）对细胞进行分区，以涵盖从核膜到细胞外受体末端的全部区域数据。</li>
	<li>首先使用Imaris软件对荧光数据进行处理，该软件可实现三维显微图像数据集的可视化与分割，并构建由立方体素组成的三维模型用于形态计量分析。 
	随后利用Imaris XT模块将Imaris与MATLAB编程语言连接，以确定GPCR突起的斑点坐标。 
	为考虑细胞间的变异性，我们获取并分析了来自22个细胞的荧光图像：无处理组（NT）（n = 7）、激动剂（CRF）处理组（n = 8）以及激动剂处理前经拮抗剂（AS-30）预处理组（n = 7）（图2）。
	<ol>
		<li>兴趣区域（ROI）应包含一个未处于活跃有丝分裂阶段且不靠近其他细胞的单个细胞。这样可确保分析对象为仅含一个细胞核的细胞，且受体突起不受邻近细胞干扰。</li>
		<li>利用Imaris软件（v.7.1.1）从多光谱荧光数据中首先重建细胞的三维结构。</li>
		<li>根据Imaris设计的算法，首先使用“表面渲染”功能描绘核膜。Imaris将自动判断ROI内是否存在多个细胞核。</li>
		<li>随后使用“斑点生成”算法定位CRF-R2的突起结构。采用斑点检测是因为其可有效补偿背景噪声以及非规则形状细胞复杂网络中的荧光强度不均问题。</li>
		<li>为最大程度包含CRF-R2荧光信号的每一个检测单位，将斑点直径设为0.2 μm，这是图像中可利用高斯滤波器提取独立强度信息的最小单位。斑点滤波功能已整合至斑点自动生成功能中。然而，软件允许用户灵活选择滤波参数以自定义设置。</li>
		<li>为避免数据截断，将数据集从8位（无符号）定点格式转换为32位浮点格式。</li>
		<li>通过连接MATLAB的Imaris XT模块，将体素强度数据转换为斑点坐标数据，并以核膜为参考点进行距离变换，确定每个斑点的精确空间位置（图3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所得数据可进行量化并以图形形式呈现，用于统计分析。组间比较采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）及Bonferroni事后检验。数据以均值±标准差（SD）表示。*p &lt; 0.05视为差异具有统计学意义。所有计算使用GraphPad Prism 5.02完成（图4）。</li>
</ol>
2. 代表性结果
为了展示本方法的强大功能，我们定量分析了转染的HEK293细胞中G蛋白偶联受体（GPCRs）和促肾上腺皮质激素释放因子受体-2（CRF-R2）与其内源性配体CRF相互作用所引起的细胞变化。
我们发现CRF-R2受体位于细胞的质膜上，并从细胞膜的有限区域向外延伸（图2A 和 视频1）。使用传统的二维分析方法，仅当分析受体在玻璃盖玻片上的黏附点时，才能检测到这一部分细胞外的CRF-R2受体。因此，我们将丢失来自z轴堆叠多光谱数据的所有其他信息（图5）。
当细胞用CRF处理后，细胞外受体显著减少，表现为荧光斑点与质膜之间的距离缩短。此外，受体从原先主要位于有限区域重新分布为多个离散的位置（图2B 和 视频2）。
CRF对受体膜分布的影响可被CRF-R2特异性拮抗剂antisavagine 30（AS-30）预处理所阻断，我们发现CRF-R2的突起长度未发生改变（图2C 和 视频3）。
远端斑点分布以5 μm为间隔进行光谱颜色编码，用于可视化体素与核膜之间的距离。与未处理组相比，在激动剂处理（CRF，1 μM，30 min）前进行拮抗剂预处理（AS-30，1 μM，30 min）对GPCR收缩无显著性差异（n.s.）。与未处理组相比，使用激动剂（CRF，1 μM，30 min）处理细胞后，含有CRF-R2的体素数量在0–5 μm范围内无显著差异（n.s.），但在6–15 μm（**p&lt;0.01）和&gt;15 μm（***p&lt; 0.005）范围内显著减少；与AS-30处理组相比，在0–10 μm范围内无显著差异（n.s.），但在11–15 μm（**p&lt;0.01）和&gt;15 μm（***p&lt; 0.005）范围内也显著减少（图4）。
<img alt="三维荧光成像方法示意图；自动化；局限性；神经元结构。" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1 . 当前可用技术及其在分析荧光图像方面的局限性示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233fig1large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="不同处理条件下细胞结构的荧光显微镜图像对比：NT、CRF、AS-30。" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. HEK293细胞转染HA-CRF-R2后，在激动剂与拮抗剂处理前后的三维多光谱荧光图像。融合图像显示了使用抗HA抗体标记，并通过Alexa 488标记的抗小鼠（IgG1）二抗进行可视化检测的HA-CRF-R2；DAPI用于细胞核染色。图像由共聚焦激光扫描（CLS）显微镜采集。比例尺为5 μm。
<img alt="细胞形态学分析；共聚焦显微镜图像；带有颜色编码的细胞结构数据。" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 利用 Imaris 软件从 CLS 图像重建的转染 HA-CRF-R2 的 HEK293 细胞的三维模型。细胞核的表面渲染以及描述 GPCR 延伸结构并转化为小囊泡的斑点生成结果。荧光数据首先通过 Imaris 软件进行处理，该软件可实现三维显微图像数据集的可视化与分割。随后使用 Imaris XT 将 Imaris 与 MATLAB 进行接口连接，将体素强度转换为斑点坐标。斑点采用光谱编码颜色表示（蓝色 0–5 μm，绿色 6–10 μm，黄色 11–15 μm，红色 >15 μm），代表距核膜的距离。比例尺：5 μm。
<img alt="柱状图；囊泡数量与细胞核距离的关系，统计学显著性；细胞生物学分析。" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 以光谱颜色编码、按5 μm间隔绘制的斑点远端分布图示，用于可视化体素与核膜之间的距离。未经处理组与激动剂（CRF，1 μM，30 min）处理前给予拮抗剂（AS-30，1 μM，30 min）预处理组之间，在GPCR收缩方面无显著性差异（n.s.）。与未处理组相比，细胞经激动剂（CRF，1 μM，30 min）处理后，含CRF-R2的体素数量在距离上的分布显著减少，表现为0–5 μm（n.s.）、6–15 μm（**p&lt;0.01）和&gt;15 μm（***p&lt;0.005）区间的变化；与AS-30处理组相比，也观察到0–10 μm（n.s.）、11–15 μm（**p&lt;0.01）和&gt;15 μm（***p&lt;0.005）区间的显著减少。
<img alt="细胞黏附分析，荧光显微镜；NT与CRF，z轴焦平面变化示意图。" src="/files/ftp_upload/4233/4233fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 对转染HA-CRF-R2的HEK 293细胞进行二维形态计量分析的局限性。细胞中段切面（位于玻璃盖玻片上方3-4μm处）显示DAPI标记的细胞核中心，以及通过抗HA抗体结合Alexa 488nm标记的抗小鼠（IgG1）二抗检测并利用共聚焦激光扫描显微镜（CLS）获取的HA-CRF-R2信号，在（A）未处理组（NT）与（B）激动剂处理组（CRF，1 μM，30分钟）之间无明显差异，而受体黏附位点则表现出显著差异。
视频 1. 在“Surpass”模式下，对未处理的转染 HA-CRF-R2 的 HEK 293 细胞进行自由旋转的三维模型观察，以评估受体蛋白之间的细胞表型差异。比例尺范围为 5 到 20 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi" target="_blank"> 点击此处观看视频。</a>
视频 2. 在“Surpass”模式下，对经 HA-CRF-R2 转染并用激动剂 CRF（CRF，1 μM，30 分钟）处理的 HEK 293 细胞进行自由旋转的三维模型观察，以评估受体蛋白之间的细胞表型差异。比例尺为 5 至 20 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie2.avi" target="_blank"> 点击此处观看视频。</a>
视频 3. 在“Surpass”模式下自由旋转的转染了 HA-CRF-R2 的 HEK 293 细胞的三维图像，激动剂处理（CRF，1 μM，30 分钟）前先用拮抗剂（AS-30，1 μM，30 分钟）预处理，以评估受体蛋白之间的细胞表型差异。比例尺范围为 5 至 20 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4233/4233movie3.avi" target="_blank"> 点击此处观看视频。</a>

<ol><li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereological+methods+for+counting+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog%2C+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Design-based stereological methods for counting neurons.</a> Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).</li>
<li>Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knowing+what+counts%3A+unbiased+stereology+in+the+non-human+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain.</a> J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).</li>
<li>Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+morphometry+and+cell-cell+communication+of+the+osteocyte+network+in+chick+and+mouse+embryonic+calvaria%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria.</a> Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).</li>
<li>Vickery, R. G., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dynamin-dependent+and+-independent+mechanisms+target+structurally+homologous+dopamine+receptors+to+different+endocytic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes.</a> J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).</li>
<li>Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+responsiveness+is+regulated+by+targeted+sorting+of+D2+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pro.c+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors.</a> Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).</li>
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<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).</li>
<li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> J. Microsc. 227, 140-156 (2007).</li>
<li>Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measurement of single-cell dynamics.</a> Nature. 465, 736-745 (2010).</li>
<li>Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+multivariate+profiling+of+drug+responses+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells.</a> Nat Methods. 4, 445-453 (2007).</li>
<li>Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+cell+migration+inhibitors+via+automated+microscopy+reveals+a+Rho-kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor.</a> Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们发现，CRF 处理可诱导 CRF-R2 在形态和定位上发生显著变化，而该变化可被选择性拮抗剂处理所抑制。我们证实，使用标准的二维多光谱技术无法检测到受体的修饰，也无法对其进行测量。研究复杂三维图像的能力对于纳入生物参数的复杂性以进行形态计量分析至关重要。我们能够在不存在预定义形状且荧光网络组分不一致的情况下，对细胞进行三维测量。我们这套可由用户修改的自动化方法体系，使我们能够在细胞所处的环境中对单个非定形细胞的分子动态进行定量，从而提取有关细胞动态的信息。该工具可帮助预测药理学化合物在抑制剂存在条件下对细胞通路及细胞形态改变的影响，并提供关于细胞存活的信息。
我们这种三维定量方法的优势在于，它使那些在生物学机制方面具有丰富专业知识但不熟悉计算机代码的研究人员能够将显微镜技术与计算机应用相结合。我们进行了单细胞测量，以揭示反映细胞群体特征的信息6。单细胞测量使我们能够分析复杂形态的细胞，且不受邻近细胞干扰的影响。该方法将有助于科学家研究化学刺激后细胞形态的变化以及膜结合蛋白的位置变化7, 8。对细胞的分析应包含从细胞内部核心区域到其胞...

<table><tbody><tr><td>人胚胎肾细胞（HEK293）</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>英韦特洛根</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>英韦特洛根</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-488（IgG2b）</td><td>英韦特洛根</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗HA.11（IgG&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;）</td><td>科万斯</td><td>16B12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>维克多实验室</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>CRF</td><td>西格玛</td><td>C2917</td><td></td></tr><tr><td>抗蛙皮素-30（AS-30）</td><td>西格玛</td><td>A4727</td><td></td></tr></tbody></table>

一种可量化三维荧光图像中细胞形态变化的分析工具

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

目前可用于测量荧光图像的最常见软件分析工具主要针对二维（2D）数据，依赖手动设置来确定数据点的纳入与排除，并借助计算机辅助的模式识别来支持分析结果的解读与发现。为了能够捕捉细胞动态的复杂性并理解生物系统中细胞可塑性的基础，测量由三维（3D）数据集构建的荧光图像变得日益重要。先进的显微镜设备通过获取多光谱荧光图像，并结合强大的分析软件对共聚焦图像序列进行重建，从而实现了三维荧光图像的可视化，进而提供所采集二维图像的三维表征。基于先进设计的体视学方法已从最初基于模型的体视学所依赖的近似与假设中发展而来1，即使在复杂组织切片中也得以应用2。尽管显微技术取得了这些科学进步，但仍亟需一种自动化分析方法，能够充分挖掘固有的三维数据，以实现对细胞形态、蛋白质定位及受体转运等复杂变化的分析与定量。
目前可用于量化荧光图像的技术包括提供手动分析功能的 Meta-Morph（Molecular Devices，加利福尼亚州森尼韦尔）和 Image J（美国国立卫生研究院）。Imaris（Andor Technology，北爱尔兰贝尔法斯特）软件提供了 MeasurementPro 功能，允许手动创建测量点，这些测量点可放置在三维图像中，或绘制在一系列二维切片上以构建三维对象。该方法适用于单击式点测量，可用于测量两个物体之间的线性距离，或创建包围感兴趣区域的多边形，但在应用于复杂的细胞网络结构时存在困难。Filament Tracer（Andor）模块可实现对三维神经元样细丝结构的自动检测，然而该模块是为测量具有树突、轴突和棘突（树状结构）等明确定义结构的神经元而开发的。尽管该模块已被巧妙地用于非神经元细胞的形态学测量3，但其输出数据是通过依赖于特定细胞形状而非无定形细胞模型的软件获得的，因此仅能提供扩展细胞网络的信息。为解决无定形细胞分析的问题，并使软件更适用于生物学应用，Imaris 开发了 Imaris Cell。该项目是与瑞士联邦理工学院（Eidgenössische Technische Hochschule）合作开展的科学项目，旨在计算细胞与细胞器之间的关系。尽管该软件可通过限定每个细胞仅含一个细胞核并利用细胞膜对细胞进行分割，从而识别生物学约束条件，但由于其理想状态下构建的细胞表面不含空隙，因此无法用于分析不连续的荧光数据。据我们所知，目前尚未开发出一种用户可自定义的自动化方法，能够从三维荧光图像中获取形态计量学信息，并实现对形状未定义细胞的空间分布分析（图1）。
我们开发了一个分析平台，该平台使用 Imaris 核心软件模块以及与 MATLAB（Mat Works, Inc.）连接的 Imaris XT。这些工具能够对无预定义形状且荧光网络组分不一致的细胞进行三维测量。此外，该方法可使在生物系统方面具有丰富经验但不熟悉计算机应用的研究人员，对细胞动态中的形态学变化进行定量分析。

我们开发了一个软件平台，利用 Imaris Neuroscience、ImarisXT 和 MATLAB 来测量从单个细胞三维共聚焦荧光图像中提取的不规则形状的形态学变化。这种新方法可用于量化受体激活后细胞形态的变化，因此可能成为药物发现的另一种辅助工具。

最常用的可用于测量荧光图像的软件分析工具针对的是二维（2D）数据，且依赖于手动设置以进行……

本实验的总体目标是提供一种自动化方法，用于分析和量化从三维共聚焦荧光图像中获取的形态不规则细胞的形态学变化。首先进行化学刺激实验，包括以下几组细胞：经激动剂处理的细胞、经拮抗剂处理后再给予激动剂的细胞，以及未经任何处理的细胞。随后对这些细胞进行免疫荧光分析的制备。第二步是获取多光谱三维荧光图像。接下来使用 Ameris Neuroscience、Ameris XT 和 MATLAB 计算机软件进行三维形态学分析。最后一步是对通过三维形态学分析所观察到的单细胞表型变化进行分析与定量。最终，该软件平台可用于量化受体激活后细胞形态的变化，为药物发现提供一种额外的工具。通常，研究人员在生物系统方面具有标准的专业知识，但可能不熟悉计算机应用。在本方案的 I 60 模块中，将在本操作开始之前，弥合可视化与计算机语言之间的鸿沟。按照书面实验方案中的参考方法，用血凝素标签标记的促肾上腺皮质激素释放因子受体2型（corticotropin releasing factor receptor two）或CRF R2转染人胚胎肾细胞。CRF2是一种G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR）。转染后的第二天，对盖玻片进行火焰处理，并将其放入六孔板中。向含有5毫克冻干多聚赖氨酸的小瓶中加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS），混匀。然后将5毫升溶解的多聚赖氨酸加入500毫升PBS中稀释，再将2毫升该混合液滴加到每一片盖玻片上。将带有盖玻片的培养板在室温下放置20分钟。20分钟后，通过加入2毫升PBS并吸除进行洗涤，重复此过程两次。向含有10% FBS的DMEM培养基中加入两毫升后，将2至5滴细胞接种到盖玻片上。细胞浓度应足以达到60%的融合度。次日。次日将细胞在37摄氏度下孵育过夜。检查细胞融合度是否达到60%，以进行激动剂处理。通过更换培养基为含有终浓度为1 µM的CRF R2内源性配体促肾上腺皮质激素释放因子的2 mL培养基，对指定细胞进行刺激。将细胞置于37摄氏度培养箱中孵育30分钟，以用拮抗剂进行预处理。更换培养基为2毫升添加了选择性CFR2拮抗剂anti salvaging 30（浓度为1 µM）的培养基。将细胞置于37摄氏度培养箱中继续孵育30分钟。拮抗剂处理后，用激动剂CRF刺激细胞，并在37摄氏度下孵育30分钟（未处理细胞）。处理后，更换为两毫升新鲜培养基。在37摄氏度孵育60分钟后，将每孔中的培养基更换为2毫升新鲜培养基，并加入1:1000稀释的抗HHA抗体。吸去培养基后，向每孔加入2毫升固定液，在吸去固定液后于室温孵育20分钟。用三羟甲基氨基甲烷缓冲生理盐水（Tris buffered saline）清洗细胞三次。在每个盖玻片上加入100微升（µL）血液溶液，于室温孵育30分钟。随后吸出孔中已有的封闭液，每张盖玻片上加入100微升

an-analytical-tool-that-quantifies-cellular-morphology-changes-from

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

细胞形态变化，从三维荧光图像量化的分析工具，

本文展示了一种灵活的信息学工作流程，可实现对荧光标记细胞的多重基于图像的分析。该工作流程可定量分析细胞核和细胞质标志物，并计算这些标志物在不同区室间的转位情况。文中提供了利用siRNA对细胞进行扰动的实验步骤，以及在96孔板体系中通过间接免疫荧光法可靠检测标志物的方法。...

基于开源软件的通用显微镜数据中荧光标记物高内涵单细胞定量分析工作流程

荧光共振能量转移（FRET）成像是一种用于实时细胞生物学研究的有力工具。本文介绍了一种利用常规落射荧光显微镜在生理性的三维（3D）水凝胶微环境中进行FRET成像细胞的方法。同时描述了一种针对比率型FRET探针的分析方法，该方法在激活范围内可产生线性比率结果。...

三维水凝胶中的FRET成像

本文描述了一种用于可视化并定量亚细胞区室中局部翻译事件的方法。该方法仅需基础的共聚焦成像系统及试剂，具有快速、经济高效的特点。...

定量免疫荧光法检测全局限域性翻译

小胶质细胞是大脑中的免疫细胞，可通过形态学变化来监测并响应大脑生理状态的改变，这些形态变化可进行定量评估。本方案概述了一种基于 ImageJ...

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本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在 C.

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一种球形体成像装置的制备方案。该装置可实现对癌细胞球形体的动态或长期荧光成像。本方案还提供了一种简单的图像处理流程，用于分析癌细胞的侵袭行为。...

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本文介绍了多种多细胞球体的形成方法，用于后续的多参数活细胞显微成像。通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）、细胞自发荧光、染色染料和纳米颗粒，展示了对活体三维（3D）肿瘤细胞和干细胞来源的球体中细胞代谢、缺氧状态及细胞死亡进行分析的方法。...

多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析

本文介绍了线粒体事件定位器（MEL），这是一种ImageJ插件，可用于定量分析随时间变化的线粒体分裂与融合活性的三维动态。我们还描述了一种图像处理流程，可用于在ImageJ中进行分析前对显微图像进行预处理和优化。...

通过动态三维荧光显微图像理解线粒体形态的变化

对多维显微图像数据的准确分析需要复杂的流程。本文演示了如何使用软件...

使用 Cell-ACDC 分析多维显微镜数据

了解如何利用三维共聚焦荧光图像和Imaris、MATLAB软件平台，对化学刺激后的细胞形态变化进行自动化定量分析。该方法为药物发现中的单细胞表型研究提供了高效工具。

一种可量化三维荧光图像中细胞形态变化的分析工具

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