细胞形态变化，从三维荧光图像量化的分析工具，

我们开发了一个软件平台，利用神经科学，ImarisXT和MATLAB Imaris未定义形状的三维共聚焦荧光的单细胞形态的变化来衡量。这种新方法可以用来量化受体激活后，细胞形状的变化，因此，为药物发现代表一个可能的额外的工具。

该程序的总体目标是提供一种自动化方法来分析和量化从三维共聚焦荧光图像中获取的未定义形状细胞的形态变化。这是通过首先进行化学刺激实验来实现的，包括用激动剂细胞处理的细胞，用拮抗剂处理的细胞，然后是激动剂和未处理的细胞。然后制备细胞用于免疫荧光分析。

第二步是获取多光谱三维荧光图像。接下来使用 ameris neuroscience、ameris XT 和 MATLAB 计算机软件进行三维形态测量分析。然后，通过三维形态测量分析可视化的单细胞表型变化作为最后一步进行分析和量化。

最终，该软件平台用于量化受体激活后细胞形状的变化，为药物发现提供了额外的工具。一般来说，研究人员在生物系统方面具有标准的专业知识，可能不熟悉计算机应用。在 I 60 模块的此协议中，在此过程开始之前弥合可视化和计算机语言之间的差距。

如书面方案中引用，用血凝素标记的促肾上腺皮质激素释放因子受体 2 或 CRF R 2 转染人胚胎肾细胞。CFR two 是一种 G 蛋白偶联受体或 GPCR。转染后第二天，火焰盖滑落并放入 6 孔板中。

将 10 ml PBS 加入一小瓶 5 mg 冻干聚赖氨酸中并混合。然后在 500 毫升 PBS 中稀释 5 毫升溶解的聚赖氨酸，并将 2 毫升混合物添加到每个盖玻片上。将带有盖玻片的板在室温下放置 20 分钟20 分钟后，加入 2 毫升 PBS 清洗盖玻片，然后去除，重复此过程两次。

在加入 2 毫升含 10% FBS 培养基的 DMEM 后，在盖玻片上加入 2 至 5 滴细胞。细胞应处于必要的浓度，以达到 60% 的 co 流畅度。第二天。

第二天在 37 摄氏度下孵育细胞过夜。检查细胞是否 60% 汇合以进行激动剂处理。通过用两毫升补充有浓度为 1 微摩尔的 CRF R 两种内源性配体促肾上腺皮质激素释放因子的培养基替换培养基来刺激指定的细胞。

将细胞在 37 摄氏度的培养箱中孵育 30 分钟，以便用拮抗剂预处理细胞。用两毫升补充有选择性 CFR 两种拮抗剂抗挽救剂 30 的浓度为 1 微摩尔的培养基替换培养基。将细胞在 37 摄氏度的培养箱中孵育 30 分钟。

拮抗剂治疗后。用激动剂 CRF 刺激细胞，对于未处理的细胞，将其在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。处理后用 2 毫升新鲜培养基更换培养基。

用 2 毫升新鲜培养基更换每个孔中的培养基，并在 37 摄氏度下孵育 60 分钟后，加入稀释 1 到 1000 的抗 HHA。吸出培养基，并向每个培养基中加入 2 毫升固定剂。吸出固定剂后，将板在室温下孵育 20 分钟。

用 tris 泡沫盐水洗涤细胞 3 次。凯恩。在每个盖子上加入 100 μL 血液溶液，放入玻片并在室温下孵育 30 分钟。然后从孔中吸出现有的 blotto 溶液，并在室温下用 TBSC 在黑暗洗涤中孵育 45 分钟后，在孔侧壁轻轻添加和去除溶液，将 100 微升新鲜的二抗混合物添加到每个盖玻片上，同时仍在最终洗涤溶液中。

用针头和弯曲的镊子拿起每个盖玻片。将盖玻片单元面朝下放在载玻片上，滴入一滴带有 dappy fix 的矢量防护罩封固剂和指甲油，然后干燥 15 至 20 分钟。Alexa，4 88 纳米偶联 muse 抗体用于可视化 CFR 2，DAPI 用于可视化细胞核有丝分裂阶段，以开始将固定细胞安装到荧光显微镜上以限制实验主观性，保持实验条件未知，直到获取图像并分析以获取图像。

具有 63 倍放大倍率和 1.4 数值孔径的平面 acro mat 油、DIC 物镜与连接到相干集成双光子激光系统的蔡司 LSM 5 10 元共聚焦显微镜结合使用在数据采集过程中，通过多通道和 c 分区将细胞区室化，以包括从核膜到细胞外受体外肢的数据。使用 amris 处理荧光数据，从而实现 3D 显微镜数据集的可视化和分割。首先按照 Amaris 设计的算法，利用表面渲染来表示 NU 核膜。

Amaris 将确定感兴趣区域或 ROI 中是否有多个细胞核。接下来，利用斑点创建算法定位 CFR 两个扩展点。补偿背景噪声和不规则强度的复杂无定形细胞网络，以最大限度地包含每个单位的荧光检测 CFR 两个，将光斑直径设置为 0.2 微米，这是图像中的最小单位。

这允许以测量强度的形式推断不同的信息。使用高斯滤波器，将污点筛选合并到污点的自动创建过程中。为避免数据阳离子，请将数据集从 8 位定点转换为 32 位浮点数。

选择创建的表面，并通过使用核膜作为参考点执行距离变换来确定核表面外每个点的确切空间位置。使用与 MATLAB 接口的 ameris XT 模块将体素强度数据交换为点坐标数据。选择点，然后在统计类型中选择 statistical coded 。

选择在创建的新通道中报告的强度中心。加载所需的颜色以进行显示，并设置用于分析的颜色图范围。数值数据可以在统计选项卡中可视化，并使用 GraphPad 棱镜导出到 excel。

量化结果数据并以图形格式呈现以进行统计分析。使用双因子 Inova 进行组间比较，Bonferroni 后测将数据呈现为均值正负标准差。为了证明这种方法的力量，由 G 蛋白偶联受体和促肾上腺皮质激素释放因子受体 2 与其内源性配体 CRF 相互作用引起的细胞变化。

在转染的 HT K 2 中，使用 Alexa 4 88 偶联、抗小鼠、二抗和 DPI 对 93 个细胞进行定量，以可视化细胞核。结果显示，CRF R 两种受体位于质膜中，并从细胞膜的有限区域投射出来。使用常规的 2D 分析，只有在分析玻璃盖上的受体粘附点时，才能检测到细胞外 CRF R 两个受体的这个子集。

因此，从 ZS 堆叠多光谱数据派生的任何其他信息都将丢失。结果选择不治疗和激动剂之间没有差异。虽然当细胞用 CRF 处理时受体粘附点有很大不同，但细胞外受体大大减少，如斑点与质膜的距离减小所示。

它们还从主要有限的位置重新分配到许多离散的位置。CRF 对受体膜分布的影响是通过用 CR 两种特异性拮抗剂预处理来防止的。30 30.

在这些情况下，CRFR 两个扩展不会随着 CRF 治疗而改变。以 5 微米光谱颜色编码间隔绘制的光斑远端分布用于可视化体素与核膜的距离。无治疗和激动剂治疗前拮抗剂预处理显示 GPCR 收缩无显著差异。

与不处理或与细胞相比，用激动剂 CRF 处理细胞逐渐减少含有体素的 CFR 2 的数量。在他的发育后用拮抗剂 As 预处理。该技术为定量成像技术领域的研究人员探索和表征许多单细胞表型变化铺平了道路，使这种基于细胞的检测成为药物发现过程的附加单细胞分析工具。