一种可量化三维荧光图像中细胞形态变化的分析工具

本实验的总体目标是提供一种自动化方法，用于分析和量化从三维共聚焦荧光图像中获取的形态不规则细胞的形态学变化。首先进行化学刺激实验，包括以下几组细胞：经激动剂处理的细胞、经拮抗剂处理后再给予激动剂的细胞，以及未经任何处理的细胞。随后对这些细胞进行免疫荧光分析的制备。

第二步是获取多光谱三维荧光图像。接下来使用 Ameris Neuroscience、Ameris XT 和 MATLAB 计算机软件进行三维形态学分析。最后一步是对通过三维形态学分析所观察到的单细胞表型变化进行分析与定量。

最终，该软件平台可用于量化受体激活后细胞形态的变化，为药物发现提供一种额外的工具。通常，研究人员在生物系统方面具有标准的专业知识，但可能不熟悉计算机应用。在本方案的 I 60 模块中，将在本操作开始之前，弥合可视化与计算机语言之间的鸿沟。

按照书面实验方案中的参考方法，用血凝素标签标记的促肾上腺皮质激素释放因子受体2型（corticotropin releasing factor receptor two）或CRF R2转染人胚胎肾细胞。CRF2是一种G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR）。转染后的第二天，对盖玻片进行火焰处理，并将其放入六孔板中。

向含有5毫克冻干多聚赖氨酸的小瓶中加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS），混匀。然后将5毫升溶解的多聚赖氨酸加入500毫升PBS中稀释，再将2毫升该混合液滴加到每一片盖玻片上。将带有盖玻片的培养板在室温下放置20分钟。20分钟后，通过加入2毫升PBS并吸除进行洗涤，重复此过程两次。

向含有10% FBS的DMEM培养基中加入两毫升后，将2至5滴细胞接种到盖玻片上。细胞浓度应足以达到60%的融合度。次日。

次日将细胞在37摄氏度下孵育过夜。检查细胞融合度是否达到60%，以进行激动剂处理。通过更换培养基为含有终浓度为1 µM的CRF R2内源性配体促肾上腺皮质激素释放因子的2 mL培养基，对指定细胞进行刺激。

将细胞置于37摄氏度培养箱中孵育30分钟，以用拮抗剂进行预处理。更换培养基为2毫升添加了选择性CFR2拮抗剂anti salvaging 30（浓度为1 µM）的培养基。将细胞置于37摄氏度培养箱中继续孵育30分钟。

拮抗剂处理后，用激动剂CRF刺激细胞，并在37摄氏度下孵育30分钟（未处理细胞）。处理后，更换为两毫升新鲜培养基。

在37摄氏度孵育60分钟后，将每孔中的培养基更换为2毫升新鲜培养基，并加入1:1000稀释的抗HHA抗体。吸去培养基后，向每孔加入2毫升固定液，在吸去固定液后于室温孵育20分钟。

用三羟甲基氨基甲烷缓冲生理盐水（Tris buffered saline）清洗细胞三次。在每个盖玻片上加入100微升（µL）血液溶液，于室温孵育30分钟。随后吸出孔中已有的封闭液，每张盖玻片上加入100微升（µL）新鲜的二抗混合液，在室温避光条件下孵育45分钟，然后用TBSC缓冲液轻轻沿孔壁加液和吸液，清洗四次，最后一次清洗后保留终末洗涤液。

用针和弯头镊子夹起每张盖玻片。将盖玻片细胞面朝下放置在载玻片上，载玻片上预先滴加一滴含 DAPI 的封片剂，用指甲油封片，室温避光静置 15 至 20 分钟。使用 Alexa 488 纳米荧光标记的抗 CFR 二抗抗体以可视化 CFR 二蛋白，DAPI 用于标记细胞核。为观察有丝分裂阶段，将固定后的细胞置于荧光显微镜下成像。为减少实验主观性，在图像采集和分析完成前，保持实验条件对操作者设盲。

使用平面消色差油镜，搭配63倍放大倍数、1.4数值孔径的微分干涉差（DIC）物镜，并结合蔡司LSM 510 Meta共聚焦显微镜与相干集成双光子激光系统。在数据采集过程中，通过多通道和细胞分区的方式对细胞进行区室化处理，以涵盖从核膜到细胞外受体末端的数据。采用Amira软件处理荧光数据，该软件可实现三维显微图像数据集的可视化与分割。根据Amira设计的算法，首先利用表面渲染来呈现细胞核核膜。

阿玛丽斯将确定感兴趣区域（ROI）内是否存在多个细胞核。接下来，利用点状结构创建算法定位CFR2的两个延伸位点。通过补偿背景噪声以及无定形细胞复杂网络中的不规则荧光强度，以最大程度地包含CFR2荧光检测的每个单位，将点状结构的直径设置为0.2微米，这是图像中的最小单位。

这使得能够以测量强度的形式外推获得不同的信息。使用高斯滤波器，在斑点的自动创建过程中整合斑点过滤。为避免数据截断，将数据集从8位定点数转换为32位浮点数。

选择生成的表面，并以核膜为参考点，通过距离变换确定每个位于核表面之外的斑点的精确空间位置。使用与 MATLAB 联用的 ameris XT 模块，将体素强度数据转换为斑点坐标数据。选择斑点，并选择统计类型中编码的统计方法。

选择在新建通道中报告的强度中心。加载所需的显示颜色，并设置用于分析的颜色图范围。数值数据可在统计标签页中可视化，并使用 GraphPad Prism 导出至 Excel。

量化所得数据，并以图形形式呈现用于统计分析。使用双向方差分析（two-way ANOVA）及邦佛尼事后检验（Bonferroni post-test）进行组间比较，数据以均值±标准差表示。为展示该方法的优势，以G蛋白偶联受体与促肾上腺皮质激素释放因子受体2（corticotropin releasing factor receptor two）与其内源性配体CRF相互作用所引发的细胞变化为例进行说明。

在转染的HT K 2 93细胞中，通过使用Alexa 4 88标记的抗小鼠二抗以及DPI对细胞核进行染色，以可视化合并图像。结果显示，CRF R两个受体位于细胞质膜上，并从细胞膜的特定区域向外延伸。采用常规二维分析时，只有在分析受体与玻璃盖玻片之间的黏附位点时，才可能检测到这一亚群的细胞外CRF R两个受体。

因此，从ZS堆叠的多光谱数据中获得的任何其他信息均会丢失。结果显示，未处理组与激动剂处理组之间无差异。当细胞用CRF处理时，受体黏附位点表现出显著差异，而细胞外受体则明显减少，表现为信号点与质膜之间距离缩短。

它们还从主要的有限位置重新分布到多个离散的位置。预先使用CRF受体2特异性拮抗剂处理可阻止CRF对受体膜分布的影响。30 30。

在这些条件下，CRFR的两个延伸区域在CRF处理后未发生改变。利用以五微米为间隔、光谱颜色编码的斑点远端分布，来可视化显示体素与核膜之间的距离。未处理组以及激动剂处理前的拮抗剂预处理组在GPCR收缩方面无显著差异。

与未处理的细胞或对照细胞相比，用激动剂CRF处理细胞会逐步减少含有CFR两个的体素数量。在拮抗剂As预处理后，这种效应在其发育过程中被逆转。该技术为定量成像领域的研究人员探索和表征多种单细胞表型变化铺平了道路，使这种基于细胞的检测方法成为药物发现过程中一种额外的单细胞分析工具。