多拷贝产质粒在抗生素耐药性演变中的作用试验
2018年5月2日
在此, 我们提出了一个实验方法来检验多拷贝产质粒在抗生素耐药性进化中的作用。
该实验方法的总体目标是测试多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用。该方法可以帮助回答微生物学领域的关键问题，例如多拷贝质粒在细菌创新进化中的作用。该技术的主要优点是它只需要基本的分子生物学方法和简单的实验设计。
这真的很酷。首先，构建大肠杆菌 MG1655 菌株，该菌株将在方程侧 ATTB 中 lambda 噬菌体的染色体中携带抗体抗性基因。为此，PCR 扩增 ATTB 位点两侧的 500 个碱基旁龙区域。
然后 PCR 扩增抗生素耐药基因。然后在 50 摄氏度下使用等温组装 30 分钟，以将同源区域与 PCR 产物融合。等温组装后，将 1 微升产品转移到 40 微升电感受态 MG1655 细胞中，放入 2 毫米比色皿中。
然后在 4 摄氏度和 2.5 千伏电压下对电池进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移到 1 毫升含 0.2% 阿拉伯糖的 LB 肉汤中。然后将含有细胞的 LB 肉汤移液到微量离心管中。
在 30 摄氏度下强烈摇晃试管 2 小时。两小时后，在 LB 琼脂平板上接种 100 微升培养物，补充抗生素。然后旋转剩余的单元格。
并将沉淀重新悬浮在 100 微升新鲜 LB 肉汤中。将这些细胞重新接种在另一个 LB 琼脂平板上。然后将板在 42 摄氏度下孵育过夜。
第二天，PCR 扩增克隆，以使用外部引物 ybhC extern 和 ybhB extern 验证构建体。然后通过琼脂糖壳电泳确认扩增子大小。同时，进行 DNA 测序以验证插入基因的序列。
为了构建在多拷贝质粒中携带抗体抗性基因的菌株，首先 PCR 扩增抗生素抗性基因 blaTEM-1。PCR 完成后，使用 T4 多核苷酸激酶磷酸化扩增产物。接下来，使用高保真聚合酶和寡核苷酸 PBAD FINV 和 PBAD RINV，PCR 扩增 PBAD 质粒骨架。
然后使用 T4 连接酶连接两个 PCR 片段。接下来，用 1 微升连接产物电穿孔 40 微升 DH5 α 细胞。然后为琼脂平板上的抗生素抗性基因和质粒骨架选择合适的抗生素。
然后按照制造商的说明使用 DNA 提取试剂盒进行质粒提取。然后对感兴趣的抗性基因进行 sanger 测序，以确认在进化实验之前不存在任何可能的突变。验证序列后，对大肠杆菌菌株 MG1655 中的质粒进行电穿孔，最终获得携带 MG1655 菌株的质粒。
该协议中最关键的步骤是模型系统菌株的构建和实验进化过程中观察到的突变的重建。首先，在 LB 琼脂平板上划线感兴趣的 MG1655 菌株。然后在 96 孔板的每个孔中加入 200 μL LB 培养基。
接下来，在板的单个孔中接种每种菌株的 48 个分离菌落。接种后，将板在 37 摄氏度下以每分钟 200 转的速度在摇床上孵育过夜。同样，将每个孔中含有创始群体的 2 微升培养物接种到一个新的 96 孔板中，在单个孔中加入 198 微升 LB 培养基。
这将开始进化救援实验。将板在 37 摄氏度下在摇床上以每分钟 200 转的速度孵育 20 小时。每天，抗生素的浓度是前一天的两倍。
第二天，将 2 微升的相应培养物转移到新鲜的 96 孔板中，并每天继续进行。在读板器上记录距单个孔 600 纳米处的光密度读数。该方案的一个关键步骤是实验进化及其抗生素浓度的增加。
抗生素浓度的变化率是可以修改以促进抗生素耐药性演变的参数之一。同样，将板在 37 摄氏度下在摇床上以每分钟 200 转的速度孵育 20 小时。然后每天在读板器上测量每个幸存群体的 600 纳米光密度读数。
定期冷冻种群，每 3 到 5 天一次。从进化的种群中提取总 DNA 以及来自不同菌株和处理的克隆。接下来，在分光光度计上测量 260：280 和 260：230 纳米处的吸光度比，以确定 DNA 的质量。
然后使用荧光 DNA 结合染料，通过在读板器上测量荧光来确认 DNA 的浓度。此外，对 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，以确认没有 DNA 降解或 RNA 污染。然后，使用从整个群体和单个克隆获得的样本进行深度 DNA 测序，以研究抗生素耐药性的遗传基础。
这项研究是使用三种大肠杆菌菌株的实验系统可能结果的一个例子。这些菌株是大肠杆菌 MG1655、在染色体 MG1655 resA 中携带抗性基因的 MG1655 和在多拷贝质粒 MG1655 pRESA 中携带抗性基因的 MG1655。使用的抗生素是头孢他啶和美罗培南。
左图显示了头孢他啶浓度增加下的生存曲线。从该图中可以清楚地看出，即使每天将头孢他啶浓度加倍，菌株 MG1655 pRESA 的子集也能够增长超过 14 天。相反，当暴露于相似浓度的头孢他啶时，其他菌株不能存活超过 8 天。
然而，当暴露于相似浓度的另一种抗生素美罗培南时，相同的菌株在存活期上没有表现出显着差异。所有三种菌株在暴露于美罗培南时仅存活 6 至 8 天。这表明多拷贝质粒中基因 resA 的存在增强了对头孢他啶的耐药性进化，而不是对美罗培南的耐药性。
一旦掌握，如果作得当，可以在几周内执行完整的实验方案。看完这个视频后，您应该对如何研究多拷贝质粒在细菌创新进化中的作用有了很好的了解。
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概述
本文介绍了一种实验方法，用于研究多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用。该方法旨在解决微生物学中关于细菌创新的重要问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 抗生素耐药性
- 质粒生物学
背景
- 多拷贝质粒可以影响细菌进化。
- 了解它们的作用对解决抗生素耐药性至关重要。
- 本研究利用了基础分子生物学技术。
- 实验设计简单明了且易于理解。
研究目的
- 测试多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用。
- 探索质粒如何促进细菌创新。
- 提供关于抗生素耐药性机制的见解。
使用的方法
- 构建具有抗生素耐药基因的大肠杆菌MG1655菌株。
- PCR扩增ATTB位点两侧区域。
- 利用噬菌体进行基因整合。
- 简单的实验设计，仅需基础分子生物学方法。
主要结果
- 证明了在实验中使用多拷贝质粒的可行性。
- 提供了一种分析质粒对抗生素耐药性影响的方法。
- 突出了进一步研究细菌进化的潜力。
- 显示基础技术可以产生重要见解。
结论
- 多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中发挥重要作用。
- 该方法可以促进微生物学的进一步研究。
- 了解质粒动态对抗击抗生素耐药性至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding how multicopy plasmids accelerate the evolution of antibiotic resistance genes is critical for de-risking early anti-infective discovery and portfolio triage. This experimental system enables direct interrogation of gene copy number effects on resistance acquisition, informing predictive models of bacterial adaptation. The approach supports strategic decision-making at the intersection of target validation and resistance mechanism assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking of resistance gene evolution in bacterial systems.
- Clarifies the impact of gene dosage on functional target validation for resistance pathways.
- Supports predictive confidence in selecting anti-infective targets less prone to rapid resistance.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated E. coli strains for resistance evolution assays.
- Standardizes experimental evolution protocols for reproducible resistance acquisition studies.
- Generates quantitative survival and growth data under defined antibiotic pressures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns experimental outputs with translational biomarker discovery for resistance mechanisms.
- Provides continuity from molecular evolution studies to preclinical resistance validation.
- Informs risk-adjusted advancement of anti-infective candidates based on resistance potential.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of resistance gene evolution and supporting downstream screening and analytics.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing on the role of gene copy number in resistance acquisition.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative survival data for comparative analysis of strain constructs.
- Analytics: Provides deep sequencing outputs to identify and confirm resistance-conferring mutations.
- Translational Research: Bridges molecular evolution findings to preclinical resistance risk assessment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable system for repeated resistance evolution studies across targets and antibiotics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance mechanism identification and target validation.
- Operational Value: Standardizes resistance evolution workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by quantifying resistance acquisition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-infective assets based on resistance evolution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial genetics, and experimental evolution.
- Needs access to PCR, electroporation, plate readers, and deep sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of strain construction and evolution protocols.
- Adaptable to different resistance genes and antibiotics with protocol modifications.
- Dependent on accurate phenotypic and genotypic validation of evolved strains.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Construction of the Experimental System Encoding the Antibiotic Resistance Gene
4:19
Evolutionary Rescue Approach to Experimentally Evolve Antibiotic Resistance
6:14
Molecular Basis of the Evolution of Antibiotic Resistance
7:05
Results: Study of Evolutionary Rescue and Molecular Basis Underlying the Plasmid Mediated Evolution using DNA Sequencing
8:35
Conclusion
