Name: 多拷贝产质粒在抗生素耐药性演变中的作用试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 了解多拷贝质粒在抗生素耐药性演变中的作用实验方法。本研究利用大肠杆菌MG1655菌株和基础分子生物学技术，帮助研究人员探索质粒对细菌进化的影响机制。

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本工作由卡洛斯三世健康研究所（2013–2016 年国家 I+D+i 计划）资助：项目编号 CP15-00012、PI16-00860 和 CIBER（CB06/02/0053），以上项目由欧洲区域发展基金“迈向欧洲”（ERDF）共同资助。JAE 由 吸引人才 马德里自治区政府项目（2016-T1/BIO-1105）以及西班牙经济、工业与竞争力部卓越研发项目（BIO2017-85056-P）。ASM 获得卡洛斯三世健康研究所 Miguel Servet 奖学金（MS15/00012）资助，该奖学金由欧洲社会基金共同资助。 &#34;投资你的未来&#34; （欧洲结构基金，ESF）和欧洲区域发展基金（ERDF）。

1. 编码抗生素抗性基因的实验系统构建
注意：此处使用大肠杆菌（E. coli）MG1655 作为携带质粒或染色体编码抗生素抗性基因的受体菌株。该抗生素抗性基因位于染色体或高拷贝质粒上，其余遗传背景完全相同（图1）。
<ol>
	<li>将抗生素抗性基因插入染色体 MG1655 的 λ 噬菌体整合位点（attB）20。
	<ol>
		<li>通过 PCR 扩增染色体 attB 位点两侧各 500 bp 长的区域。使用引物 YbhC-F（5'- CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3'）和 attB-R（5'- GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3'）扩增左侧同源区域，使用引物 attB-F（5'- AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3'）和 YbhB/R（5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3'）扩增右侧同源区域。使用引物 Tem1-pBAD-F（5'- TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3'）和 Tem1-pBAD-R（5'- TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'）扩增 blaTEM-1 抗性基因。引物设计时，其 5' 端应包含约 20 bp 与待连接片段互补的序列。</li>
		<li>使用等温组装法21，将同源区域与抗生素抗性基因的 PCR 产物（包括其启动子区域）连接，反应条件为 50 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>对含有质粒 pKOBEG 的 MG1655 细胞进行电穿孔。 
		注：pKOBEG 是一种温度敏感型载体，含有 λ Red 重组系统，可促进染色体与 PCR 产物之间的同源等位交换22。
		<ol>
			<li>将步骤 1.1.223 的产物取 1 µL 加入 40 µL 电转感受态细胞中，置于 4 °C 下的 2 mm 比色杯中，电击参数为 2.5 kV。电击后，将细胞重悬于 1 mL LB 液体培养基 + 0.2% 阿拉伯糖中，以维持 λ Red 系统的表达。</li>
			<li>将全部体积转移至微量离心管中，在 30 °C（pKOBEG 的允许温度）下剧烈振荡（200 rpm，旋转摇床）孵育 2 小时，使染色体中插入的抗性标记得以表型表达。</li>
			<li>将细胞涂布于含适当抗生素的 LB 琼脂平板上，筛选抗生素抗性基因（对于 blaTEM-1，使用氨苄青霉素或羧苄青霉素，浓度为 100 mg/L）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>取 100 µL 涂布于一个培养皿，其余体积离心收集，重悬于 100 µL 新鲜 LB 液体培养基中，涂布于另一培养皿。42 °C 过夜培养。 
		注：该温度不允许 pKOBEG 质粒复制。在此条件下能够生长的菌落将丢失 pKOBEG，并在 attB 位点整合了抗性基因（为简便起见，此后将该菌株称为 MG1655::resA）。</li>
		<li>通过将目标菌落在含氯霉素（pKOBEG 所携带抗性标记对应的抗生素）的平板上复制培养，检测 pKOBEG 是否丢失。 
		注：在 30 °C 允许温度下，若菌落在氯霉素平板上不生长，表明质粒已丢失。</li>
		<li>为验证克隆，使用外侧引物 YbhC-Extern（5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3'）和 YbhB-Extern（5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'）对构建体进行 PCR 扩增，通过凝胶电泳验证扩增片段大小是否正确，并对纯化产物进行测序，以确认插入基因序列无误。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将抗生素抗性基因插入多拷贝质粒中。 
	注：由于极高拷贝数的质粒通常会显著降低宿主细菌的适应性，我们推荐使用具有天然复制起点的中等拷贝数多拷贝质粒，例如 p3655（pSU18T-pBADgfp2，ColE1 型复制起点24）。这类质粒通常每个细胞含有约 15–20 个拷贝。
	<ol>
		<li>PCR 扩增所选抗生素抗性基因（包括启动子区域），对 PCR 产物进行磷酸化处理，并将其连接至质粒骨架的 PCR 扩增产物中：
		<ol>
			<li>PCR 扩增抗生素抗性基因；对于 blaTEM-1 ，使用引物 Tem1-pBAD-F（5'- TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3'）和 Tem1-pBAD-R（5'- TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'）。</li>
			<li>使用 T4 多核苷酸激酶对纯化产物进行磷酸化处理，操作按制造商说明书进行。</li>
			<li>使用高保真聚合酶和引物 pBAD-F（5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3'）与 pBAD-R（5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3'）PCR 扩增质粒骨架。</li>
			<li>使用 T4 DNA 连接酶将两个 PCR 片段连接，操作按制造商指南进行。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>如前所述，取最多 1 µL 连接产物对 40 µL 电转感受态 E. coli DH5-α 细胞进行电穿孔，并在含相应抗生素的平板上筛选（对于 blaTEM-1，使用氨苄青霉素或羧苄青霉素，浓度为 100 mg/L）以及质粒骨架的抗性标记。 
		注：此处无需在 LB 培养基中添加阿拉伯糖。</li>
		<li>使用使用者选择的商用质粒小提试剂盒提取质粒：
		<ol>
			<li>取 5 mL 过夜培养物，室温下以 12,000 x g 离心收集菌体。将菌体重悬于 250 µL 重悬液中并充分混匀。加入 250 µL 裂解液并充分混匀。加入 350 µL 中和液并充分混匀。</li>
			<li>将上清液转移至试剂盒提供的 DNA 结合柱中，离心 1 分钟，弃去穿流液。每次加入 500 µL 洗涤液，离心 1 分钟，弃去穿流液，重复洗涤两次。空柱再离心 1 分钟，以去除残留洗涤缓冲液。</li>
			<li>将柱置于洁净离心管中，加入 50 µL 超纯水至膜上以洗脱纯化 DNA。离心 1–2 分钟，收集含有纯化质粒的穿流液。使用插入序列外的引物对质粒中目标基因进行 Sanger 测序，确认序列正确且在进化实验前抗性基因无突变。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>序列验证无误后，如上所述将该质粒电转入 E. coli MG1655 菌株中。 
		注：由此获得菌株 MG1655/pRESA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验进化抗生素耐药性的进化救援方法（图1）
<ol>
	<li>在LB平板上划线接种待研究的菌株：MG1655::resA 以及 MG1655/pRESA 和敏感亲本菌株 MG1655。 
	注意：质粒pRESA在MG1655中应具有稳定性，因此无需在LB平板中添加抗生素。MG1655中的突变率在 E. coli 足够低，因此一旦验证构建正确后，无需在每一步都验证质粒序列。</li>
	<li>在每个孔中加入200 µL LB培养基，制备96孔板，每株菌分别接种48个独立的单菌落至独立孔中（每株菌使用一块96孔板）。于37 °C、200 rpm条件下过夜培养。保存这些创始种群的冻存菌种。 
	注意：为防止和控制96孔板中的培养物交叉污染，应采用棋盘式板设计，即在整个96孔板中将接种菌液的孔与不含细菌的培养基孔交替排列。整个实验进化过程中均应使用此种板设计。</li>
	<li>通过将含有奠基者种群的平板中每个孔的2 µL菌液接种到新的96孔板中，启动进化拯救实验，每个新孔中含198 µL LB培养基，并添加研究中抗生素的亚抑制浓度。对于进化拯救实验方法，起始抗生素浓度应为最低抑菌浓度（MIC，此前已测定）的¼或1/825在LB培养基中分别加入三种菌株的抗生素最低抑菌浓度，并每天将抗生素浓度加倍。采用此方法以最大化菌群获得耐药性突变的几率。2637 °C、200 rpm条件下孵育平板20小时。 
	注意：测量初始菌群的过夜培养OD值。若不同菌株间的OD值存在显著差异，应调整初始接种量，使每孔起始细胞数量一致。</li>
	<li>每天测量各菌群经 overnight 培养后的 OD 值，并按照 2.3 节所述方法，将培养物转接至新的 96 孔板中，新孔板中抗生素浓度为前一天的两倍。于 37 °C、200 rpm 条件下培养 20 小时。 
	注：1:100的稀释倍数每天可产生约6-7代。</li>
	<li>同时，在不添加抗生素的条件下，按照2.3和2.4节所述相同条件扩增各菌株的对照群体。 
	注意：对照群体有助于区分由抗生素存在引起的突变和帮助细菌适应实验条件的普通突变。在无抗生素情况下出现的平行突变可能有助于细菌适应实验条件，而与抗生素耐药性无关。</li>
	<li>每天使用酶标仪通过测量培养物在600 nm波长处的吸光度（OD）来追踪存活种群的数量。 
	注意：光密度值低于 0.1 表示种群灭绝。参见 图2 生存曲线示例。</li>
	<li>定期（每3-5天）保存所有群体的冷冻储备。</li>
	<li>使用log-rank检验[包 &#34;存活率&#34; 在 RStudio（版本 0.99.486）中分析不同菌株群体在抗生素浓度递增条件下随时间变化的存活率差异12. 
	注意：本实验将确定多拷贝质粒是否会促进针对所研究的特定抗生素和基因的抗生素耐药性进化。</li>
</ol>
3. 抗生素耐药性进化的分子基础（图1）
<ol>
	<li>从不同菌株和处理条件下的代表性种群和克隆中进行全基因组DNA提取。包括亲本菌株（MG1655、MG1655::resA 和 MG1655/pRESA），以便能够检测实验过程中积累的突变。 
	注意：有关DNA提取试剂盒的示例，请参见材料表。不同试剂盒具有不同的操作流程，请遵循制造商提供的说明。</li>
	<li>测定DNA的质量和浓度。有多种方法可用于确定DNA的质量和浓度。通过测定260 nm/280 nm和260 nm/230 nm吸光度比值来评估DNA纯度。使用荧光性DNA结合染料按照制造商说明测定DNA浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳确认无DNA降解或RNA污染。</li>
	<li>对整个种群和单个克隆样本进行深度DNA测序，以研究抗生素耐药性的遗传基础。 
	注意：本研究的所有测序工作均在英国牛津大学惠康信托人类遗传学中心完成。更多细节请参见San Millan et al. 201612。</li>
	<li>使用breseq 0.26.1分析流程27,28检测突变，采用多态性模式估算种群中突变的频率。将不同进化后的基因组与亲本基因组进行比较，以识别实验过程中积累的突变。</li>
	<li>将对照种群中平行积累的突变与在抗生素浓度递增条件下进化出的种群中的突变进行比较，从而区分有助于细菌适应一般实验条件的突变（在对照种群中发现）和参与抗生素耐药性的突变（仅在承受抗生素压力的种群中发现）。 
	注意：平行突变的数量通常较少，因此不同处理组之间的平行突变易于评估。除了研究中的抗生素耐药基因内的突变外，还很可能在染色体上发现其他与抗生素耐药相关的突变，例如孔蛋白或外排系统中的突变12。</li>
	<li>利用本方案第1节中相同的方法，在亲本菌株中重建抗生素耐药基因中的突变。按照本方案的1.1和1.2步骤，将新突变引入亲本背景（使用进化后的基因为PCR模板）。分析这些新构建菌株的抗生素耐药表型，以确认突变的功能作用。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

我们提出了一种新的实验方案，结合分子生物学、实验进化和深度DNA测序技术，旨在研究多拷贝质粒在细菌抗生素耐药性进化中的作用。尽管该方案整合了多个领域的技术，但所需方法均较为简单，可在常规微生物学实验室中完成。方案中最关键的步骤可能是模型系统菌株的构建，以及实验进化后所观察到的突变的重建（这两步采用完全相同的方法）。然而，等温组装系统21显著简化了该流程，因此任何具备中等分子生物学经验的研究人员均可顺利实施。
该方案的另一个关键步骤是在抗生素浓度递增条件下的实验进化。以本方案为例，实验起始时采用 &#188;-1/8 最小抑菌浓度（MIC）的抗生素浓度，并每天将抗生素浓度加倍。然而，较低的抗生素浓度递增速率可能会提高细菌种群通过进化救援避免灭绝的概率26因此，抗生素浓度的变化速率是可被调整以促进抗生素耐药性进化的参数之一。
DNA测序与分析也是实验设计的关键环节。在实验的不同时间点，对整个群体以及单个克隆的DNA样本进行测序，所获得的...

细菌对抗生素的耐药性是一个重大的健康问题1。从基本层面来看，致病菌中抗生素耐药性的传播是自然选择驱动进化的简单实例2,3。简而言之，抗生素的使用会筛选出耐药菌株。因此，进化生物学中的一个关键问题是理解影响细菌种群进化出抗生素耐药性能力的各种因素。选择实验已成为研究细菌进化生物学的强有力工具，该领域已对广泛的进化问题提供了极为深刻的见解4,5,6。在实验进化中，从单一亲本菌株起始的细菌种群在明确定义且严格控制的条件下进行连续传代。在这些培养物生长过程中发生的某些突变可提高细菌的适应性，这些突变通过自然选择在培养物中扩散。实验过程中，会定期将种群样本进行低温冷冻保存，从而建立一个不继续进化的冷冻“化石记录”。可采用多种方法来表征正在进化的细菌种群，其中最常见的两种方法是适合度测定——用于测量进化后的细菌与其远祖菌株竞争的能力——以及全基因组测序，用于鉴定驱动适应性进化的遗传变化。继理查德·伦斯基（Richard Lenski）及其同事的开创性工作之后7,8，实验进化中的标准方法是让数量相对较少的重复种群（通常&#60;10）面临新的环境挑战（例如新的碳源、温度变化或捕食性噬菌体），以观察其适应过程。
当细菌对抗生素产生耐药性达到一定程度，以至于无法将抗生素浓度提高到在患者组织中致死的水平时，由耐药细菌引起的感染便成为一个严重问题。因此，临床医生关注的是，细菌如何能够进化出对高于该阈值浓度（即临床折点）的高剂量抗生素产生耐药性。如何通过实验研究这一现象？如果仅用高剂量抗生素处理少量细菌群体（如类似Lenski实验的设计），最可能的结果是抗生素将所有群体彻底清除。另一方面，如果所使用的抗生素剂量较低，低于亲本菌株的最低抑菌浓度（MIC），则细菌群体不太可能进化出具有临床意义的耐药性水平，特别是当耐药性伴随较大适应性代价时。在这两种情况之间的一种折中方案是采用&#34;进化救援&#34;实验9,10,11。该方法中，使用大量培养物（通常&#62;40个）并随时间逐步提高抗生素剂量，通常每天将抗生素浓度加倍12。该实验的特点在于，任何未能进化出更高耐药性的群体都将被清除。大多数接受此类处理的群体最终会被清除，但有极少数群体可通过进化出高水平耐药性而持续存活。本文中，我们将展示如何利用这种实验设计来研究多拷贝质粒在耐药性进化过程中的作用。
细菌通过两种主要途径获得对抗生素的耐药性：染色体突变和获取可移动遗传元件，其中主要是质粒13。质粒在抗生素耐药性进化过程中起着关键作用，因为它们能够通过接合作用在细菌之间转移耐药基因14,15。根据大小和生物学特性，质粒可分为两类：&#34;小质粒&#34;，每个细菌细胞中拷贝数较高；以及&#34;大质粒&#34;，拷贝数较低16,17。大质粒在抗生素耐药性进化中的作用已有大量文献记载，因为它们包含接合性质粒，而接合性质粒是细菌间耐药性及多重耐药性传播的关键驱动因素15。小拷贝数多的质粒在细菌中也极为常见17,18，且常携带抗生素耐药基因19。然而，小拷贝数多的质粒在抗生素耐药性进化中的作用研究相对较少。
在最近的一项研究中，我们提出，多拷贝质粒可能通过增加每个细胞中的基因拷贝数，提高基因突变率，从而加速其所携带基因的进化12. 采用实验模型进行 大肠杆菌 菌株 MG1655 和 β-内酰胺酶基因 blaTEM-1 研究表明，多拷贝质粒可加速产生赋予对第三代头孢菌素头孢他啶耐药性的TEM-1突变。这些结果表明，多拷贝质粒可能在抗生素耐药性的进化过程中发挥重要作用。
本文详细描述了我们开发的用于研究多拷贝质粒介导抗生素耐药性进化的实验方法。该方法包含三个步骤：首先，将目标基因插入宿主菌的多拷贝质粒或染色体中；其次，利用实验进化（进化救援）评估不同菌株适应选择压力的潜力；最后，通过DNA测序确定质粒介导进化的分子基础，并在亲本基因型中单独重建疑似突变以验证其功能。
最后，尽管本文所述方案旨在研究抗生素耐药性的进化，但可以认为该方法通常也可用于分析由任何多拷贝质粒编码基因突变所获得的创新性状的进化过程。

<table><tbody><tr><td>PCR仪</td><td>BioRad</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>BiorRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>通过测定260nm/280nm和260nm/230nm吸光度比值来评估DNA质量</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Memmert</td><td>UF1060</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Cole-Parmer Ltd</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>电泳槽</td><td>BioRad</td><td>1704405</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Biohit</td><td>725020, 725050, 725060, 725070</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Biohit</td><td>728220, 728230,&lt;br/&gt; 728240</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪 Synergy HTX</td><td>BioTek</td><td>BTS1LF</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8388</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Falcon</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基</td><td>BD Difco</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>LB琼脂</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Phusion聚合酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson组装试剂</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>Fermentas FastDigest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗生素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>质粒提取试剂盒</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>基因组DNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kits</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>基因组DNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9054</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>ClearLine</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>96孔板（-80&amp;ordm;C储存）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>249945</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA检测系统</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>DNA浓度定量</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>BioRad</td><td>1613100</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>50x TAE缓冲液</td><td>BioRad</td><td>1610743</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>T4多聚核苷酸激酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0031</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0014</td><td></td></tr></tbody></table>

检测多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

多拷贝质粒在原核生物中极为常见，但其在细菌进化中的作用仍不清楚。我们最近的研究表明，多拷贝质粒通过增加每个细胞中基因的拷贝数，能够加速质粒编码基因的进化。在本研究中，我们提出了一种实验系统，用于检测多拷贝质粒促进基因进化的潜力。利用简单的分子生物学方法，我们构建了一个模型系统，可将抗生素抗性基因插入大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655 的染色体或一个多拷贝质粒中。我们采用实验进化方法，在逐渐增加抗生素浓度的条件下传代培养不同菌株，并随时间测量细菌群体的存活情况。所选用的抗生素分子和抗性基因具有如下特性：该基因只能通过获得突变才能赋予抗性。这种&#34;进化拯救&#34;方法为检测多拷贝质粒促进抗生素抗性获得的潜力提供了一种简便手段。在实验系统的下一步中，对抗生素抗性的分子基础进行表征。为了鉴定导致抗生素抗性获得的突变，我们对来自全群体和克隆的样本进行深度DNA测序。最后，为了验证这些突变在目标基因中所起的作用，我们将它们重建到亲本背景中，并检测所获得菌株的抗性表型。

在我们之前的研究中，探讨了β-内酰胺酶基因blaTEM-1向赋予对第三代头孢菌素头孢他啶耐药性进化的过程12。选择该基因的原因是，尽管TEM-1本身不赋予对头孢他啶的耐药性，但blaTEM-1中的突变可扩展TEM-1的活性范围，使其能够水解如头孢他啶等头孢菌素29。在抗生素耐药酶（如β-内酰胺酶或氨基糖苷类修饰酶）中，导致其底物谱发生变化的突变十分常见29,30。该实验体系非常适合用于研究此类酶的进化过程。有关按照本方案成功开展实验的详细报告，请参见San Millan et al. 201612。
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本文介绍了一种用于检验多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中作用的实验方法。

多拷贝质粒在原核生物中极为丰富，但其在细菌进化中的作用仍不清楚。我们最近发现，……

本实验方法的总体目标是验证多拷贝质粒在抗生素耐药性进化过程中的作用。该方法有助于回答微生物学领域中的一些关键问题，例如多拷贝质粒在细菌新功能进化中的作用。该技术的主要优势在于仅需基本的分子生物学方法和简单的实验设计。这非常巧妙。首先，构建携带抗体抗性基因的大肠杆菌 MG1655 菌株，该基因将位于染色体上λ噬菌体的 ATTB 位点处。为此，通过 PCR 扩增 ATTB 位点两侧各 500 个碱基对的区域。然后通过PCR扩增抗生素抗性基因。接着在50摄氏度下进行30分钟的等温组装，将同源区域与PCR产物连接。等温组装完成后，取1微升产物加入到含有40微升电转感受态MG1655细胞的2毫米比色皿中。然后在4摄氏度、2.5千伏条件下对细胞进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转入含有0.2%阿拉伯糖的一毫升LB肉汤中。接着用移液器将含有细胞的LB肉汤转移至微量离心管中。在30摄氏度下剧烈振荡试管两小时。两小时后，取100微升培养物涂布于添加了抗生素的LB琼脂平板上。随后离心收集剩余的菌体细胞。将沉淀重悬于100微升新鲜LB肉汤中。将这些细胞重新涂布到另一块LB琼脂平板上。然后在42摄氏度下过夜培养平板。第二天，使用外部引物 ybhC extern 和 ybhB extern 对克隆进行 PCR 扩增，以验证构建体。然后通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的大小。同时，进行DNA测序以验证插入基因的序列。为了构建在多拷贝质粒中携带抗体抗性基因的菌株，首先通过PCR扩增抗生素抗性基因blaTEM-1。PCR完成后，使用T4多聚核苷酸激酶对扩增产物进行磷酸化处理。接下来，使用高保真聚合酶以及寡核苷酸PBAD FINV和PBAD RINV，对PBAD质粒骨架进行PCR扩增。然后使用T4连接酶将两个PCR片段连接。接着，用1微升连接产物电转化40微升DH5 alpha感受态细胞。随后，在含有适当抗生素的琼脂平板上根据抗生素抗性基因和质粒骨架筛选阳性克隆。然后使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书进行质粒提取。接着对目标耐药基因进行Sanger测序，以确认在进化实验前不存在任何可能的突变。序列验证完成后，将质粒通过电转化转入大肠杆菌MG1655菌株，最终获得携带该质粒的MG1655菌株。本方案中最关键的步骤是构建模型系统菌株以及重建在实验进化过程中观察到的突变。首先，将感兴趣的 MG1655 菌株划线接种于 LB 琼脂平板上。然后在 96 孔板的每个孔中加入 200 微升 LB 培养基。接下来，将每种菌株的48个独立菌落分别接种到平板中各个孔内。接种后，将平板置于37摄氏度、200转/分钟的摇床上过夜培养。随后，从每个孔中取2 µL培养物，与原始菌群一起接种至新的96孔板中，每孔含有198 µL LB培养基。这将启动进化拯救实验。将培养板置于37°C、200转/分钟的摇床上孵育20小时。每天将抗生素浓度设置为前一天浓度的两倍。第二天，将相应培养物的 2 微升转移至新的 96 孔板中，并每天持续进行此操作。使用酶标仪记录各孔在 600 纳米处的光密度读数。该实验方案的关键步骤是实验性进化及其抗生素浓度的逐步增加。抗生素浓度的变化速率是可被改变以促进抗生素耐药性进化的参数之一。再次将平板置于37摄氏度、200转/分钟的摇床上培养20小时。随后每天使用酶标仪测量平板上每个存活菌群在600纳米处的光密度读数。每隔三到五天定期冷冻保存菌群。从进化后的菌群以及不同菌株和处理组的克隆中提取总DNA。接着，使用分光光度计测定260:280和260:230纳米处的吸光度比值，以评估DNA的质量。然后使用荧光DNA结合染料，并通过酶标仪测量荧光值来确认DNA的浓度。此外，对DNA进行琼脂糖凝胶电泳，以确认无DNA降解或RNA污染。接着，对来自全群体和单个克隆的样品进行深度DNA测序，以研究抗生素耐药性的遗传基础。本研究展示了利用三种大肠杆菌菌株进行实验系统的可能结果。这些菌株分别为大肠杆菌MG1655、染色体中携带耐药基因的MG1655 resA，以及在多拷贝质粒中携带耐药基因的MG1655 pRESA。所使用的抗生素为头孢他啶和美罗培南。左侧面板显示了在头孢他啶浓度逐渐增加条件下的生存曲线。从图中可以看出，菌株 MG1655 pRESA 的部分群体即使在每天头孢他啶浓度加倍的情况下，仍能生长超过 14 天。相反，在暴露于相似浓度的头孢他啶时，其他菌株在 8 天后均无法存活。然而，当暴露于另一种抗生素美罗培南的相似浓度时，这些菌株在存活时间上并未表现出显著差异。当暴露于美罗培南时，所有三种菌株的存活时间仅为6至8天。这表明，resA基因存在于多拷贝质粒中可增强对头孢他啶耐药性的进化，但不能增强对美罗培南的耐药性。一旦掌握，若操作得当，整个实验方案可在数周内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何研究多拷贝质粒在细菌新功能进化中的作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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本文演示了一种针对特定目标序列构建随机突变文库的简单方案。我们展示了该方法如何在大肠杆菌（Escherichia...

在 E. coli 中进行蛋白质定向进化的诱变与功能筛选方案

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来源： Lea-Smith, D. J., et al. 模式蓝细菌物种中标记型与无标记突变体的构建. J. Vis. Exp.

通过同源重组在蓝细菌中产生抗生素标记突变体

来源：Escudero, J. A., 等. 多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用检测。J. Vis. Exp. (2018)本视频展示了通过逐步增加头孢唑林暴露浓度，比较三种含有不同拷贝数氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌（E.

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表征多重耐药外排系统 鲍曼不动杆菌 利用外排系统&#45;缺陷型细菌菌株与单拷贝&#45;单拷贝基因表达系统

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