多拷贝产质粒在抗生素耐药性演变中的作用试验

在此, 我们提出了一个实验方法来检验多拷贝产质粒在抗生素耐药性进化中的作用。

该实验方法的总体目标是测试多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用。该方法可以帮助回答微生物学领域的关键问题，例如多拷贝质粒在细菌创新进化中的作用。该技术的主要优点是它只需要基本的分子生物学方法和简单的实验设计。

这真的很酷。首先，构建大肠杆菌 MG1655 菌株，该菌株将在方程侧 ATTB 中 lambda 噬菌体的染色体中携带抗体抗性基因。为此，PCR 扩增 ATTB 位点两侧的 500 个碱基旁龙区域。

然后 PCR 扩增抗生素耐药基因。然后在 50 摄氏度下使用等温组装 30 分钟，以将同源区域与 PCR 产物融合。等温组装后，将 1 微升产品转移到 40 微升电感受态 MG1655 细胞中，放入 2 毫米比色皿中。

然后在 4 摄氏度和 2.5 千伏电压下对电池进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移到 1 毫升含 0.2% 阿拉伯糖的 LB 肉汤中。然后将含有细胞的 LB 肉汤移液到微量离心管中。

在 30 摄氏度下强烈摇晃试管 2 小时。两小时后，在 LB 琼脂平板上接种 100 微升培养物，补充抗生素。然后旋转剩余的单元格。

并将沉淀重新悬浮在 100 微升新鲜 LB 肉汤中。将这些细胞重新接种在另一个 LB 琼脂平板上。然后将板在 42 摄氏度下孵育过夜。

第二天，PCR 扩增克隆，以使用外部引物 ybhC extern 和 ybhB extern 验证构建体。然后通过琼脂糖壳电泳确认扩增子大小。同时，进行 DNA 测序以验证插入基因的序列。

为了构建在多拷贝质粒中携带抗体抗性基因的菌株，首先 PCR 扩增抗生素抗性基因 blaTEM-1。PCR 完成后，使用 T4 多核苷酸激酶磷酸化扩增产物。接下来，使用高保真聚合酶和寡核苷酸 PBAD FINV 和 PBAD RINV，PCR 扩增 PBAD 质粒骨架。

然后使用 T4 连接酶连接两个 PCR 片段。接下来，用 1 微升连接产物电穿孔 40 微升 DH5 α 细胞。然后为琼脂平板上的抗生素抗性基因和质粒骨架选择合适的抗生素。

然后按照制造商的说明使用 DNA 提取试剂盒进行质粒提取。然后对感兴趣的抗性基因进行 sanger 测序，以确认在进化实验之前不存在任何可能的突变。验证序列后，对大肠杆菌菌株 MG1655 中的质粒进行电穿孔，最终获得携带 MG1655 菌株的质粒。

该协议中最关键的步骤是模型系统菌株的构建和实验进化过程中观察到的突变的重建。首先，在 LB 琼脂平板上划线感兴趣的 MG1655 菌株。然后在 96 孔板的每个孔中加入 200 μL LB 培养基。

接下来，在板的单个孔中接种每种菌株的 48 个分离菌落。接种后，将板在 37 摄氏度下以每分钟 200 转的速度在摇床上孵育过夜。同样，将每个孔中含有创始群体的 2 微升培养物接种到一个新的 96 孔板中，在单个孔中加入 198 微升 LB 培养基。

这将开始进化救援实验。将板在 37 摄氏度下在摇床上以每分钟 200 转的速度孵育 20 小时。每天，抗生素的浓度是前一天的两倍。

第二天，将 2 微升的相应培养物转移到新鲜的 96 孔板中，并每天继续进行。在读板器上记录距单个孔 600 纳米处的光密度读数。该方案的一个关键步骤是实验进化及其抗生素浓度的增加。

抗生素浓度的变化率是可以修改以促进抗生素耐药性演变的参数之一。同样，将板在 37 摄氏度下在摇床上以每分钟 200 转的速度孵育 20 小时。然后每天在读板器上测量每个幸存群体的 600 纳米光密度读数。

定期冷冻种群，每 3 到 5 天一次。从进化的种群中提取总 DNA 以及来自不同菌株和处理的克隆。接下来，在分光光度计上测量 260：280 和 260：230 纳米处的吸光度比，以确定 DNA 的质量。

然后使用荧光 DNA 结合染料，通过在读板器上测量荧光来确认 DNA 的浓度。此外，对 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，以确认没有 DNA 降解或 RNA 污染。然后，使用从整个群体和单个克隆获得的样本进行深度 DNA 测序，以研究抗生素耐药性的遗传基础。

这项研究是使用三种大肠杆菌菌株的实验系统可能结果的一个例子。这些菌株是大肠杆菌 MG1655、在染色体 MG1655 resA 中携带抗性基因的 MG1655 和在多拷贝质粒 MG1655 pRESA 中携带抗性基因的 MG1655。使用的抗生素是头孢他啶和美罗培南。

左图显示了头孢他啶浓度增加下的生存曲线。从该图中可以清楚地看出，即使每天将头孢他啶浓度加倍，菌株 MG1655 pRESA 的子集也能够增长超过 14 天。相反，当暴露于相似浓度的头孢他啶时，其他菌株不能存活超过 8 天。

然而，当暴露于相似浓度的另一种抗生素美罗培南时，相同的菌株在存活期上没有表现出显着差异。所有三种菌株在暴露于美罗培南时仅存活 6 至 8 天。这表明多拷贝质粒中基因 resA 的存在增强了对头孢他啶的耐药性进化，而不是对美罗培南的耐药性。

一旦掌握，如果作得当，可以在几周内执行完整的实验方案。看完这个视频后，您应该对如何研究多拷贝质粒在细菌创新进化中的作用有了很好的了解。