导演蛋白质的演化突变和功能选择协议 E。大肠杆菌
March 16th, 2011
在这里，我们展示了一个简单的协议来创建一个给定的目标序列的随机突变体库。我们表明，这种方法，这是在大肠杆菌体内进行，如何可以再加上功能选择进化出新的酶活动。
该程序的总体目标是为给定的目标 DNA 序列创建随机突变体文库，并使用半定量功能选择快速识别和表征突变体。这是通过首先用大肠杆菌转化质粒来实现的，大肠杆菌是包含靶序列的一个复制起点，是突变菌株。将细胞铺板和孵育过夜后，收获它们并分离目标质粒以获得突变文库，然后将突变文库转化到读出菌株中以表征方案第二部分中的突变，构建梯度生长板并将读出菌株的细菌培养物加载到含有软 aer 的单独培养皿中。
该程序的最后一步是将这些细菌培养物邮票转移至梯度。最终，可以获得结果，通过药物梯度上的生长差异显示给定靶序列的表型谱的变化。本视频介绍了一种在大肠杆菌中定向进化蛋白质的方法。
这个过程模拟了随机营养文库生成的自然进化，然后是限制这种多样性的选择。因此，它提高了我们为工业或生物医学目的产生新生化活动的能力。该程序有两个组成部分，随机突变体文库的生成和获得功能突变增益的功能选择将由我实验室的技术人员 Jennifer Allen 演示。
在该方案开始之前，认为电感受态 JS 200 细胞表达 DNA 聚合酶 1 的低保真变体或低保真极，先前已按照书面方案中的描述制备，这些细胞包含极 1 的温度敏感等位基因，因此低保真极 1 活性在 37 摄氏度下占主导地位， 构建。一个含有大肠杆菌的靶质粒，一个复制起点，与复制起点相邻的靶序列克隆，低保真极一个启动大肠杆菌，一个质粒复制。从而引入突变以启动诱变。
将 40 μL 电感受态细胞和 30 至 250 ng 目标血浆 DNA 混合在 2 mm 的间隙中。电穿孔兽医脉冲，混合物在 1800 伏特的电中。检查时间常数或 TC 以确保每个样品的条件一致。
理想情况下，TC 等于 5 到 6 毫秒。让细胞 DNA 混合物在一毫升 LB 肉汤中以 37 至 250 RPM 的转速振荡 40 分钟。获得 100 毫米 LV 农业培养皿，预热至 37 摄氏度，含有适当的抗生素，为两种质粒选择，以适当的稀释度接种回收的细胞，以获得接近草坪的浓度，其定义为不同但不可计数的菌落数量，如本例所示。
孵育过夜后，用 LB 肉汤收获培养皿的细菌菌落。从收获的细胞中分离质粒、DNA，得到质粒。DNA 构成随机突变文库。
通过使用限制性内切酶切割质粒文库来进行限制性消化，该内切酶将目标质粒和极点线性化。一个质粒在分离的质粒 DNA 上运行分析性 aro 凝胶以确认质量和数量。验证质粒后，用限制性内切酶消化文库的 1 微克，该内切酶使 1 极质粒线性化，但不切割目标质粒。
限制性酶切完成后，使用 DNA 纯化试剂盒清理文库。最后，将干净的文库转化为读出菌株以表征突变。要开始梯度准备，请在方形培养皿底部的一个边缘上均匀标记 10 个泳道。
将培养皿放在一个斜坡上，使底部标记的边缘升高 7 毫米。将 25 毫升温热的 lb 琼脂与适当浓度的选择剂充分混合倒入倾斜皿中。这是渐变的底层。
确保 LB 琼脂覆盖培养皿，使培养皿的升高标记端包含约 1 毫米的 LB 琼脂，而降低的部分包含约 8 毫米的琼脂。用盖子 KU 盖住盘子通风，让 agri 凝固 10 到 15 分钟。LB 琼脂的底层硬化后，将培养皿移至平坦的表面。
接下来，倒入 25 毫升温热的 lb 琼脂，不使用选择剂覆盖第一个农业表面，确保覆盖整个底层。用盖子 KU 盖住盘子通风，然后让农作物凝固 10 到 15 分钟，以进行细菌的邮票转移。首先，获得读出菌株的细菌培养物并稀释它们以具有相同的细胞密度，600 纳米的光密度小于 1.0。
接下来，将两毫升平衡至 42 摄氏度的液体软琼脂转移到 100 毫米圆形培养皿的底部，将 40 微升细菌培养物移液到较软的培养皿中，然后通过摇动板混合。用较软的混合物涂覆玻璃显微镜载玻片的长边。然后将载玻片的涂层边缘与梯度培养皿上的底部标记对齐。
将载玻片接触琼脂表面。柔软的触感足以将软琼脂的条带转移到渐变表面。然后将玻片放在一边进行清洁和重复使用。
重复此过程。其余样品、实验对照应包含在每个梯度培养皿中。如果正在运行多个梯度，请将梯度培养皿在 37 摄氏度下孵育过夜，不同读数的细菌菌株的孵育温度可能不同，但在 37 摄氏度下过夜通常足以实现可见生长。
最后，按照书面方案中的描述对细胞生长进行成像和分析。显示。以下是使用未屏蔽的 P-G-F-U-V 或 PG FPUV 突变体库转换的读出菌株的图像。四轮诱变深色或暗淡菌落表明含有 GFP 灭活突变的质粒。
该图表示靶质粒的整个中性序列以 100 个碱基对的间隔发生突变的频率。请注意，突变发生在整个质粒序列中，但最接近复制起点的频率最高。在这里，突变体的生长与药物梯度相反。
向梯度顶部增长的距离表明突变体之间的不同耐药性特征。在这个例子中，使用药物选择梯度筛选人氧化脱甲基酶 ABH 2 的质粒文库以查找对甲烷磺酸甲酯耐药性增加的突变体。二。代表诱变方案的两次和四次迭代的此类文库与亲本野生型和空载体进行比较。
白线表示分离单个突变菌落的阈值。为了进一步进行表型分析，先前使用低保真 P one 诱变和 astri 和 m 选择鉴定的 β-内酰胺酶突变体 R 1 64 H 和 E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R 显示在 0.4 μg/mL 和 4 μg/mL 上。头孢噻肟对头孢噻肟的梯度保护表明超广谱 β-内酰胺酶活性。
请注意，野生型 β-内酰胺酶相对于表达空载体的细胞不具有保护作用。因此，这些突变体代表了一种新的生化活性的适应或进化。在这里，我们提出了这一代新生化活性的诱变和功能选择的强大组合。
功能选择可以通过药物选择或遗传互补获得，它利用我们产生大量遗传多样性的能力。发病机制可能必须仅限于给定序列，以优化预先存在的蛋白质活性或用于位点定向发病机制。这些可以通过克隆轻松完成。
此外，诱变可以与功能选择解耦，以获得特征攻击或突变足迹。
概述
本文介绍了在大肠杆菌中针对特定DNA序列创建随机突变库的协议。该方法包括功能性筛选以进化新的酶活性。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 基因工程
- 蛋白质进化
背景
- 定向进化模仿自然选择以开发新的蛋白质。
- 随机突变库可以增强生化活性。
- 功能性筛选对于识别有益突变至关重要。
- 本研究利用大肠杆菌的诱变株以获得更高的突变率。
研究目的
- 开发生成随机突变库的协议。
- 展示功能性筛选以识别功能获得突变。
- 提高进化新的酶功能的效率。
使用的方法
- 将质粒转化到大肠杆菌的诱变株中。
- 分离质粒DNA以创建突变库。
- 使用读出菌株表征突变。
- 构建梯度生长平板用于功能性筛选。
主要结果
- 成功从转化的大肠杆菌中创建随机突变库。
- 通过在药物梯度上的生长识别出具有改变表型的突变体。
- 展示了该协议在进化新的酶活性方面的有效性。
- 结果表明目标序列的表型特征发生了显著变化。
结论
- 该协议有效地生成了针对目标序列的随机突变库。
- 功能性筛选增强了有益突变的识别。
- 该方法可用于工业和生物医学目的。
常见问题
Executive Industry Relevance
Directed evolution using random mutagenesis and functional selection in E. coli enables rapid exploration of protein sequence space for novel biochemical activities. This approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by generating and selecting gain-of-function variants under defined selection pressures. The protocol's scalability and simplicity position it as a reusable platform for portfolio-wide protein engineering initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein function through large-scale mutational diversity.
- Supports mechanistic de-risking by identifying gain-of-function or resistance mutations.
- Facilitates rapid triage of protein targets based on selectable phenotypes.
Screening & Assay Development
- Generates validated mutant libraries for downstream functional screening workflows.
- Provides reproducible, quantitative outputs via drug gradient selection plates.
- Enables scalable screening of protein variants for desired biochemical activities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns laboratory evolution with disease-relevant selection pressures, such as drug resistance.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling phenotypic selection of functional variants.
- De-risks advancement decisions by providing functional evidence of protein activity shifts.
Pipeline & Workflow Integration
This mutagenesis and selection protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling iterative cycles of diversity generation and functional screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by generating diverse protein variants and selecting for functional outcomes.
- Screening: Provides assay-ready mutant libraries and quantitative growth readouts for comparative analysis.
- Analytics: Enables measurement of mutation frequency and phenotypic shifts across selection gradients.
- Translational Research: Connects laboratory evolution to preclinical models by selecting variants with enhanced or novel activities.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, cloning-free workflow adaptable to multiple protein targets and selection pressures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers scalable, reproducible, and standardized mutant library generation and selection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling functional selection at scale.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of protein engineering projects across therapeutic areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial transformation, and phenotypic selection assays.
- Needs access to electroporation equipment, gradient plate preparation, and analytical infrastructure for mutation analysis.
- Demands cross-team standardization of selection conditions and readout criteria.
- Adaptable to various protein targets and selection agents with minimal protocol modification.
- Mutation distribution may be biased toward plasmid regions near the origin of replication, requiring consideration in experimental design.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:38
Creation of a Mutant Library: Mutagenesis
3:23
Creation of a Mutant Library: Readout
4:03
Mutant Identification and Characterization: Construction of Gradient
5:06
Mutant Identification and Characterization: Stamp Transfer of Bacteria
6:27
Mutagenesis and Functional Selection Protocols: Representative Results
8:14
Conclusion
