Name: 导演蛋白质的演化突变和功能选择协议 E。大肠杆菌 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解定向蛋白质演化突变和功能选择方法，利用大肠杆菌突变菌株构建随机突变文库，通过梯度生长平板进行功能筛选，快速鉴定获得功能突变体，用于工业和生物医学领域开发新酶活性。

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本工作获得了针对MC的K08奖CA116429-04以及Conquer Cancer Now（CONCERN）基金会资助项目#8501的支持

<ol><li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+DNA+Gene+Seq%22%5BJournal%5D)">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase%2C+ribonuclease+H%2C+and+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li>
<li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ColE1+replication+control+circuitry%3A+sense+from+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li>
<li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li>
<li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile%28709%29+in+motif+A+functions+in+base+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li>
<li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li>
<li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li>
<li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27evolvability%27+of+promiscuous+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li>
<li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC%28Ts%29+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍了一种诱变方案，可在无需克隆或PCR的情况下生成大规模的随机突变文库。该方法基于编码目标序列的质粒进行易错复制。理论上，突变应主要局限于RNA/DNA转换位点下游紧邻的100-300 bp区域内，该区域长度与Pol I产生的前导链中间体大小一致2,10。我们发现，在本方案所述实验条件下，Pol I引发的突变在整个质粒中均有发生，尽管突变频率随着与质粒复制起点（ori）距离的增加而逐渐降低（图3）。这一结果表明，在ColE1质粒复制过程中，Pol I向Pol III的转换或“切换”比先前报道的更为渐进，至少在我们的实验条件下如此2，并且与早期研究提出的Pol I与Pol III之间存在功能冗余的观点一致11。
我们最初的方案描述了在液体培养物中进行的诱变（4）。该方案在距离RNA/DNA转换位点1000 bp以内（d&lt;1000）的区域产生0.41个突变/kb（见表1）。若将液体培养物在摇床中继续培养3天而不添加任何新鲜培养基，会导致过度饱和，使突变频率提高至0.70个突变/kb，但质粒得率极低（不足第1天的1%；数据未显示）（表1）。本文提出一种简化方案，即直接将目标质粒转化产物涂布于37 °C的固体琼脂平板上（图1）。该方法可获得最高的每轮诱变突变频率（d&lt;1000范围内为0.92个突变/kb），并显著提高了迭代效率。将培养条件改为固体培养基也影响了突变谱（表2）。直接涂板诱变减少了液体培养中观察到的互补碱基替换之间的显著不对称性（比较C→T与G→A，以及A→G与T→C）。另一方面，直接涂板导致插入缺失（indel）比例上升（从不足0.5%增至4%），同时使A→G突变数量减少至原来的1/3，从而导致G/C位点突变比例过高（占74%）。总体而言，我们认为，与液体诱变相比，本文所提出的直接涂板方案在操作简便性和效率上的显著优势，超过了其在突变谱均衡性方面的轻微不足。
在目标质粒中，本方法产生的突变不仅局限于目标序列。然而，新生物化学活性的进化应依赖于目标基因内部的突变，因为这代表了一种定性而非定量的变化。因此，将本研究的质粒诱变技术与梯度平板上的突变体筛选相结合，可充分利用本系统的优势（构建大规模文库及具备筛选条件），以实现新生物化学特性的进化。随机诱变的其他应用，例如优化已有的酶活性或对基因的特定区域进行随机化，确实在随机诱变后需要克隆步骤。在这种情况下，将文库构建于质粒中，而非PCR扩增产物中，可通过便于扩增和限制性酶切，提高克隆效率。
总之，我们展示了一种用于构建特定目标基因随机突变文库的简单方案，该方案以操作简便和所产生文库的多样性为显著优势。我们说明了该方法如何与功能性筛选相结合，以高效地进化出新的生化功能。此外，我们通过体内（in vivo）生成的文库可轻松进行克隆，从而实现位点特异性突变或对已有功能的优化。

<table><tbody><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Cellgro</td><td>46100R6</td><td>终浓度 0.1mg/ml</td></tr><tr><td>四环素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP7640</td><td>终浓度 0.05mg/ml</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Genlantis</td><td>M120100</td><td>终浓度 0.03mg/ml</td></tr><tr><td>LB 琼脂（Miller）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤（Miller）</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>软琼脂</td><td>Difco Laboratories</td><td>214580</td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>吖啶橙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A38401-1</td><td></td></tr><tr><td>消泡剂 B 乳液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Acros Organics</td><td>332030025</td><td></td></tr><tr><td>100x100x15mm 方皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td></td></tr><tr><td>100mm 圆皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712A</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片 25x75x1mm</td><td>Gold Seal</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2mm 间隙电转杯</td><td>Molecular BioProducts</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Zippy 质粒小提试剂盒</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4020</td><td></td></tr></tbody></table>

在 e. coli 中进行蛋白质定向进化的诱变与功能筛选方案

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

高效产生遗传多样性是一种极为宝贵的分子工具，可用于标记DNA合成、创建独特的分子标签，或在实验室中实现蛋白质的定向进化。本文介绍一种可针对特定目标序列构建大规模（>1011）突变体文库的实验方案。该方法基于携带目标序列的ColE1质粒在DNA聚合酶I低保真突变体（LF-Pol I）作用下的复制过程。将目标质粒转化至一种突变菌株的E. coli中，并在固体培养基上培养，可获得每千碱基（kb）0.2至1个突变的频率，具体数值取决于目标基因在质粒上的位置。通过重复此诱变过程，可进一步提高突变频率。与其他诱变方法相比，本方案的优势在于操作简便，无需进行克隆或PCR扩增。因此，该方法特别适用于对质粒或其他Pol I模板进行突变标记，或用于探索原始目标序列中不存在的新功能的广阔序列空间。若需实现PCR或基于随机寡核苷酸方法所具备的精确区域控制，可通过后续克隆文库中的特定片段来达成。本文同时提供了构建随机突变体文库以及在E. coli中建立基于药物筛选的方法，以鉴定具有新生物化学活性的突变体。

本文演示了一种针对特定目标序列构建随机突变文库的简单方案。我们展示了该方法如何在大肠杆菌（Escherichia coli）体内进行，并可与功能性筛选相结合，以进化出新的酶活性。

在 E. coli 中进行蛋白质定向进化的诱变与功能筛选方案

高效产生遗传多样性是一种宝贵的分子工具，可用于标记DNA合成、创建独特的分子……

本实验的总体目标是为特定的目标 DNA 序列构建一个随机突变体文库，并通过半定量功能筛选快速鉴定和表征突变体。首先将含有目标序列且具备一个复制起点的质粒转化至突变菌株中。在平板上接种细胞并过夜培养后，收集细胞并分离目标质粒，从而获得突变体文库；随后将该突变体文库转化至报告菌株中，以在实验第二阶段对突变进行表征。构建梯度生长平板，并将报告菌株的细菌培养物接种至另一个含有软琼脂的培养皿中。该实验流程的最后一步是将这些细菌培养物印迹转移到梯度平板上。最终可获得结果，通过细菌在药物浓度梯度上的生长差异，显示特定目标序列的表型特征变化。本视频介绍了一种在大肠杆菌（E. coli）中进行蛋白质定向进化的方法。该过程模拟了自然界中随机营养库的进化过程，即首先生成随机的营养库，然后通过选择来限制其多样性。因此，该方法能够提升我们为工业或医学目的创造新型生化活性的能力。此实验流程包含两个部分：随机突变文库的构建，以及通过功能筛选获得具有功能增益的突变体。演示本实验操作的将是本实验室的技术员 Jennifer Allen。在开始本方案之前，使用表达DNA聚合酶I低保真突变体（低保真Pole I）的感受态JS 200细胞，这些细胞按照书面方案中所述方法预先制备。这些细胞含有Pole I的温度敏感等位基因，因此在37摄氏度时，低保真Pole I的活性占主导地位。构建一种含有大肠杆菌（coli）复制起点的靶质粒，目标序列克隆于复制起点附近。低保真Pole I启动大肠杆菌质粒的复制，从而引入突变以启动诱变过程。在2毫米间隙中混合40微升电转感受态细胞与30至250纳克的目标质粒DNA。在1800伏电压下对电转杯中的混合物进行电穿孔脉冲。检查时间常数（TC），以确保每个样本的电转条件一致。理想情况下，TC 应为 5 到 6 毫秒。将细胞与 DNA 混合物在 1 毫升 LB 液体培养基中于 37°C、250 RPM 振荡条件下恢复培养 40 分钟。取一个 100 毫米的 LV 农杆菌培养皿，预先在 37°C 下温育，并含有适当的抗生素以同时筛选两种质粒，将恢复后的细胞以适当的稀释度涂布，以获得接近成片生长的浓度，即菌落数量明显但不可计数的状态，如本示例所示。经过过夜培养后，用LB肉汤收集培养皿中的细菌菌落。从收集的细胞中提取质粒DNA，所得质粒DNA构成随机突变文库。通过使用一种能够线性化目标质粒和载体的限制性内切酶，对质粒文库进行限制性消化。取一份质粒样品，对分离得到的质粒DNA进行分析型琼脂糖凝胶电泳，以确认其质量和数量。在确认质粒正确无误后，用一种能够线性化载体质粒但不切割目标质粒的限制性内切酶，对1微克文库质粒进行消化。限制性消化完成后，使用DNA纯化试剂盒对文库进行纯化。最后将纯化后的文库转化至报告菌株中，以表征突变。开始梯度制备时，在方形培养皿底部的一侧边缘均匀标记10条线。将培养皿放置在倾斜位置，使底部标记的边缘升高 7 毫米。将 25 毫升与适当浓度筛选剂充分混合的温热 LB 琼脂倒入倾斜培养皿中。此为梯度的底层。确保LB琼脂覆盖培养皿，使培养皿抬高的一端标记区域含有约1毫米厚的LB琼脂，而较低的一端约有8毫米厚。用KU盖子盖上培养皿以利于通风，并让琼脂凝固10至15分钟。待LB琼脂底层凝固后，将培养皿移至水平台面。接下来，倒入 25 毫升不含筛选剂的温热 LB 琼脂，覆盖第一层琼脂表面，确保完全覆盖底层。用培养皿盖 KU 盖住平板以保持通风，然后静置 10 至 15 分钟，使琼脂凝固，以便进行细菌的印迹转移。首先，获取报告菌株的细菌培养物，并将其稀释至细胞密度相同，600 纳米处的光密度小于 1.0。接下来，将2毫升预热至42摄氏度的液体软琼脂转移至100毫米圆形培养皿底部，用移液器吸取40微升细菌培养物加入软琼脂中，然后通过轻轻摇动培养皿使其混合均匀。用该软琼脂混合物涂布玻璃显微镜载玻片的长边。然后将涂有混合物的载玻片边缘与梯度培养皿底部的标记线对齐。将载玻片轻轻接触琼脂表面。轻微触碰即可将一条软琼脂转移至梯度表面。随后将载玻片放置一旁，以备清洁后重复使用。重复此过程。每个梯度平板上均应包含剩余样品及实验对照。若同时运行多个梯度平板，则将梯度平板倒置于37°C下孵育过夜；不同报告菌株的孵育时间和温度可能有所不同，但通常在37°C下孵育过夜足以实现可见生长。最后，按照书面实验方案所述对细胞生长情况进行成像与分析。图中显示的是分别转化了未突变的 P-G-F-U-V 或 PG FPUV 突变文库的报告菌株的图像，这些菌株经过了四轮诱变。暗色或微弱荧光的菌落表明质粒中含有使 GFP 失活的突变。该图显示了目标质粒中性序列在每100个碱基对间隔内的突变频率。请注意，突变发生在整个质粒序列中，但在复制起点附近频率最高。此处展示了突变体在药物浓度梯度下的生长情况。向梯度上方生长的距离表明不同突变体之间存在差异性的药物抗性特征。在此示例中，利用药物筛选梯度二对人源氧化去甲基化酶 ABH2 的质粒文库进行筛选，以鉴定对甲基甲烷磺酸酯具有更高抗性的突变体。图中展示了经过两轮和四轮诱变流程的文库，并与亲本野生型及空载体进行了比较。白线表示分离单个突变菌落的阈值。为进一步进行表型分析，展示了先前通过低保真P1诱变及astri和m筛选鉴定出的β-内酰胺酶突变体R164H和E104K R164H G267R，在每毫升0.4微克和每毫升4微克的头孢噻肟梯度平板上。对头孢噻肟的保护作用提示具有扩展谱β-内酰胺酶活性。需要注意的是，野生型β-内酰胺酶酶与表达空载体的细胞相比并未提供任何保护作用。因此，这些突变体代表了新生物化学活性的适应或进化。本文中，我们展示了一种强大的诱变与功能筛选相结合的方法，可用于产生新的生物化学活性。可以通过药物筛选或遗传互补获得功能性筛选，这利用了我们产生大量遗传多样性的能力。为了优化已有的蛋白质活性或进行位点特异性致病性改造，可能需要将致病性限制在特定序列上。这些操作均可通过克隆技术轻松实现。此外，可以将诱变与功能筛选分离，以获得特征性攻击模式或突变特征。

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导演蛋白质的演化突变和功能选择协议 E。大肠杆菌</em

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