微电极阵列技术在完整仔猪脑麻醉诱导神经毒性研究中的应用
2018年5月12日
本研究探讨了用酶基微电极阵列技术监测仔猪体内的活体神经递质活性的新方法.假设谷氨酸失调有助于麻醉神经毒性的机制。在此, 我们提出了一种适应多边环境技术的协议, 研究麻醉诱发神经毒性的机制。
该实验程序的总体目标是利用基于酶的微电极阵列技术的新应用来测量新生仔猪的神经递质。在这个例子中，检查体内谷氨酸活性以研究麻醉诱导的神经毒性。该技术的主要优点是它可以在麻醉诱导的神经毒性的临床相关动物模型中以出色的空间和时间分辨率测量体内神经递质活性。
虽然这种方法可以深入了解麻醉诱导的神经毒性机制，但它也可以应用于其他病理状态，例如小儿脑外伤、癫痫和中风。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为使用仔猪模型需要实施经验和实践。此外，使用微电极阵列需要专门的技能。
这种方法的视觉演示至关重要，因为手术和微电极放置步骤由于其微妙的性质而难以学习。在这个实验中，在仔猪的大脑生长高峰期使用仔猪，当它们 3 到 5 天大时。让他们在实验前至少 24 小时适应。
训练有素的工作人员必须照顾仔猪。应该随意为他们提供营养、毯子和一些刺激玩具。麻醉前至少三小时，从笼子中取出代乳品，以确保仔猪的胃是空的。
遵循 ARRIVE 指南以消除任何潜在的基于性别的混杂因素。之后，在配备儿科呼吸机和适当监测设备的麻醉工作站上，对仔猪进行插管和机械通气。然后，在 1 MAC 进行七氟烷麻醉 3.5 小时。
现在，用脚趾捏确认麻醉深度足够，然后将仔猪固定在具有足够衬垫的仔猪特异性立体定位框架上。将上颌骨的牙齿放在齿条上。接下来，固定并拧紧两个插入式耳杆，使仔猪以中线为中心。
将耳杆插入足够牢固，以听到鼓膜弹出。开始罗库溴铵负荷剂量和输注，以防止仔猪固定在框架中时移动。仔猪保持温暖并监测其生命体征至关重要。
使用加热灯和/或毯子来保持正常的体温。确保加热灯不要靠得太近以至于它会燃烧。如果需要仔猪存活，请采取额外的准备工作以保持手术区域无菌。
现在，继续植入微电极阵列。首先，沿着颅骨做一个 4 到 6 厘米的中线切口，小心避免用手术刀划伤颅骨。切开后，使用轻柔的回缩和钝性解剖将头皮从颅骨上抬高。
接下来，用纱布垫轻轻擦洗颅骨，去除任何结缔组织并露出缝合线。然后确定开颅手术的预期位置。如果感兴趣区域仍然被遮挡，则进一步反映头皮。
现在，使用手术钻头创建一个约 0.25 平方厘米的开颅手术窗，覆盖在感兴趣的结构上。小心不要伤害硬脑膜或底层大脑。根据需要，使用精细的手术工具切除覆盖在脑组织的硬脑膜上。
请格外小心，以免损伤大脑。该实验利用先前描述的基于酶的微电极阵列，该阵列预先涂有谷氨酸氧化酶，并电镀有 mPD。微电极阵列有一个 40 毫米的刚性轴，为仔猪定制。
将金属臂固定到微纵器上，然后将微电极阵列尽可能垂直放置在前囟上。然后，小心地将阵列尽可能低，不要接触颅骨表面，注意前囟的坐标。现在使用仔猪脑图谱来确定感兴趣结构的确切立体定位坐标，然后相应地重新定位微电极。
接下来，将伪参比电极放在头皮下，确保与动物接触。现在慢慢地将微电极阵列降低到大脑中，直到接近适当的深度。对于最后两毫米的行程，使用液压微型驱动器将阵列轻轻降低到感兴趣的结构中，同时将组织创伤降至最低。
放置微电极阵列后，等待 30 分钟，让电极达到基线。然后，测量约 3 小时。如果仔猪要在实验中存活，请在收集数据后关闭切口。
如前所述，在七氟烷麻醉下对 3 至 4 日龄仔猪的海马进行实时体内谷氨酸测量。录制会话超过 3 小时。安培法测量值以 4 赫兹记录，并使用基于校准参数的线性回归转换为浓度。
对于每个时间点，在减去平均的前哨信号之前，对来自两个谷氨酸敏感位点的信号进行平均，以产生校正后的谷氨酸信号。平均基础谷氨酸浓度约为 4.6 微摩尔，并且在麻醉剂暴露过程中保持相对稳定。通过分析信号中与前哨信号无关且信噪比大于 3 的峰来识别瞬时谷氨酸能活性。
在实验期间共检测到 116 个瞬态峰。通常观察到所得瞬态峰值的振幅在 1 μ mole 范围内。为了量化每个瞬变的持续时间，得到了每个最大峰值衰减 80% 所需的时间，发现大约是 4 到 5.5 秒。
一旦掌握，如果有条不紊和仔细地执行，这项技术可以在四个小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住尽量减少任何可能混淆实验数据的意外组织损伤。按照此程序，可以执行其他方法，例如测量其他电化学分析物，以回答其他问题。
概述
本研究探讨了酶基微电极阵列（MEA）技术在监测新生猪体内神经递质活动中的应用，特别关注谷氨酸失调作为麻醉神经毒性的一个贡献因素。它旨在使用临床相关的动物模型来阐明麻醉诱导的神经毒性背后的机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 麻醉学
背景
- 检查谷氨酸活动在麻醉诱导的神经毒性中的作用。
- 由于它们的发育相关性，使用猪作为模型。
- 需要改进的技术以测量体内神经递质动态。
研究目的
- 开发一种方法来监测麻醉过程中的谷氨酸水平。
- 提供在麻醉背景下神经毒性机制的见解。
- 促进对相关病理中神经递质动态的理解。
使用的方法
- 采用酶基微电极阵列进行实时监测。
- 使用三到五天大的新生猪，在七氟烷麻醉下进行。
- 关键的手术步骤包括开颅和微电极植入。
- 术后三小时内进行测量。
主要结果
- 测量的基础谷氨酸浓度约为4.6微摩尔。
- 实验期间识别了116个谷氨酸瞬时峰值。
- 瞬时峰值的幅度通常在1微摩尔范围内。
结论
- 该研究展示了MEA技术在体内神经递质测量中的实用性。
- 研究结果增进了对麻醉诱导神经毒性的理解。
- 对于研究其他条件（如儿童脑创伤和癫痫）的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables real-time monitoring of glutamate dynamics in a clinically relevant neonatal piglet model, offering a mechanistic approach to de-risk anesthetic neurotoxicity hypotheses. By providing quantitative, high-resolution neurotransmitter data, it supports target validation and predictive confidence in early discovery programs. The method addresses a critical gap in understanding developmental neurotoxicity mechanisms relevant to pediatric drug safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glutamate dysregulation as a mechanistic hypothesis in anesthesia-induced neurotoxicity.
- Operational Value: Provides real-time, spatially resolved neurotransmitter measurements to functionally validate target engagement.
- Predictive Value: Supports biomarker-like readouts for pathway modulation and mechanistic de-risking in CNS-active compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative glutamate concentration data with 4 Hz temporal resolution for assay standardization.
- Operational Value: Establishes a reproducible platform for monitoring neurotransmitter flux in intact brain tissue.
- Scalability: Enables longitudinal monitoring over extended anesthetic exposures to capture transient signaling events.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Uses neonatal piglets as a disease-relevant system with developmental similarity to the human brain.
- Mechanistic Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo pathophysiology through direct neurotransmitter monitoring.
- Risk Mitigation: Identifies transient glutamatergic peaks as potential biomarkers for neurotoxic insult severity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation by delivering functional neurotransmitter readouts that inform lead optimization and safety profiling.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses about anesthetic-induced glutamate dysregulation through direct in vivo measurement.
- Screening: Delivers assay-ready neurotransmitter data with defined signal-to-noise thresholds for peak detection.
- Analytics: Provides concentration-time profiles and transient peak quantification (amplitude, duration) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by validating glutamate dynamics in a developmentally relevant species.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other neuropathologies such as epilepsy, stroke, and trauma via analyte-specific enzyme coating.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neurotoxicity pathways through direct neurotransmitter monitoring.
- Operational Value: Standardizes neurotransmitter measurement with exceptional spatial and temporal resolution.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target pathway modulation in vivo.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS compounds based on neurochemical safety signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal piglet care, stereotaxic surgery, and microelectrode handling.
- Dependent on specialized instrumentation including hydraulic micro-drives and enzyme-based microelectrode arrays.
- Necessitates aseptic surgical technique and physiological monitoring for animal welfare and data integrity.
- Adaptation to other brain regions or analytes requires atlas-guided repositioning and enzyme-specific electrode calibration.
- Limited by the technical skill barrier in microelectrode implantation and signal stabilization periods.
