Name: 微电极阵列技术在完整仔猪脑麻醉诱导神经毒性研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 了解酶基微电极阵列技术用于监测麻醉诱导神经毒性中的谷氨酸动态变化。该方法在完整仔猪模型中实现高时空分辨率的实时神经递质检测，为研究麻醉神经毒性机制提供重要工具。

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作者谨此感谢肯塔基大学微电极技术中心（CenMeT）以及俄亥俄州立大学实验动物资源中心（ULAR）所做出的贡献。

仔猪（Sus scrofa）由经俄亥俄州立大学（OSU）机构动物护理和使用委员会（IACUC）预先批准的本地农场提供。在获得方案批准后，动物实验将严格遵循IACUC政策进行。
1. 仔猪及仔猪操作
<ol>
	<li>按照ARRIVE指南，系统性且随机地使用雄性和雌性仔猪，以消除任何潜在的性别相关混杂因素19. 
	注意：由于仔猪大脑生长最迅速的时期在其出生后的3-5天内，因此实验仅使用3-5日龄的仔猪。</li>
	<li>确保仔猪在实验开始前至少24小时到达动物房，以适应环境。 
	注意：由经过培训的兽医人员提供常规动物护理。仔猪饲养在独立控温且持续监测的笼具中，并饲喂营养全面的代乳品。 随意摄取 以防止低血糖。仔猪也不提供代乳（禁食），在麻醉前至少3小时提供毛毯和玩具以确保正常水平的刺激。如果条件允许，将多只仔猪饲养在同一笼内以促进社交。</li>
</ol>
2. 用于仔猪模型AIN研究的MEA的开发与定制
注意：该技术使用基于酶的微电极阵列（MEA），其表面预先包被了酶，并电镀了间苯二胺二盐酸盐（mPD）。电极经过定制设计，带有40 mm的刚性轴，专为在仔猪中使用而制造（图1）。
<ol>
	<li>为避免重复，请参见先前所述的MEA制备与校准的详细描述15（图2）。</li>
</ol>
3. 猪仔的麻醉及定制立体定位仪的使用
<ol>
	<li>使用配备合适呼吸机和监测设备的麻醉工作站对动物进行麻醉，并在整个实验过程中持续监测脉搏血氧饱和度、无创血压、心电图和体温等生理参数，具体方法如前所述19. 对仔猪进行插管和通气，并以1个最低肺泡有效浓度（MAC）（约2.5%-3%）的七氟烷麻醉维持3.5小时。确保实验过程中有经过培训的实验室工作人员在场。&#160;手术区域的毛发在皮肤准备前使用电推剪去除。 
	注意：所使用的麻醉剂浓度和作用时间可使实验模拟外科手术过程中实际麻醉暴露的持续时间。此外，七氟烷是儿科人群中使用最广泛的全身麻醉药，因此围绕其安全性的研究具有极其重要的意义。</li>
	<li>在将动物置入立体定位仪之前，先给予罗库溴铵负荷剂量2.5 mg/kg，并以1.5 mg/kg/h持续输注，以防止动物在固定于立体定位仪期间发生移动。
	<ol>
		<li>在通过夹趾法确认麻醉深度足够后，将仔猪置于专用于仔猪的立体定位仪中。</li>
		<li>在立体定位仪框架内提供足够的衬垫，将仔猪放置在强制空气加热垫上，并添加额外衬垫（例如，流化定位垫）以预防压疮。</li>
		<li>将上颌的牙齿置于齿条上方（图3). 
		注意：齿条应调节至适当高度，以牢固固定颅骨。</li>
		<li>将穿刺式耳杆固定并旋紧于耳内，注意确保仔猪处于正中位置。将侧向固定装置的尖端置于耳道内，并稳固插入耳杆，直至听到 &#34;流行&#34; 与鼓膜穿刺相关的声音。将耳杆牢固地固定在颅骨上，并确保两侧插入深度相等，以防止实验过程中颅骨移动（图4，图A). 
		注意：在整个操作过程中，维持仔猪体温正常至关重要，需将其保持在约 37.8–38.6 °C，并持续监测体温。这可以通过以下方式实现 通过 一条毯子和/或一盏加热灯。务必将加热灯放置在适当距离，以避免灼伤动物皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>沿颅骨中线做一个4-6厘米的切口，操作时需小心避免手术刀划伤颅骨。切开后，轻柔牵拉并采用钝性分离法将头皮从颅骨上剥离。用纱布轻轻擦拭颅骨，去除任何结缔组织，暴露缝线。图4，图B). 
	注意：在非存活实验期间无需保持无菌状态；但在存活实验期间必须维持无菌条件。</li>
	<li>如有必要，进一步牵开头皮以暴露目标区域，并确定开颅的位置图5，图A）。使用外科钻头制作一个直径约0.25 cm的颅骨开窗2 （大小可根据实验目的调整）时需小心操作，避免损伤硬脑膜或其下方的脑组织图5，图B）。使用精细手术剪剪除覆盖在脑组织上的硬脑膜（图5，图C).</li>
	<li>尽可能将电极垂直置于前囟上方，方法是将头架的金属臂固定在幼猪立体定位仪的微操纵器上。将电极尽可能下放，但不接触颅骨表面。记录前囟的坐标图6，图A).
	<ol>
		<li>根据前囟（bregma）确定目标结构的前后、内外以及深度坐标。使用适用于该物种和年龄的立体定位图谱确定立体定位坐标。本实验中，应使用专为幼猪设计的立体定位图谱。20.</li>
		<li>重新放置电极，使其处于适当的位置，前后方向和内侧-外侧方向均准确到位，确保微电极和装置均垂直于表面。将伪参考电极置于头皮下方，确保与动物体接触良好。图6，图B).</li>
		<li>缓慢而轻柔地使用立体定位仪将电极插入脑内适当深度。在最后2 mm阶段，使用液压微驱动装置将电极进一步推进至精确位置（图6，图C). 
		注意：电极位置应覆盖颅骨开窗区域。电极植入深度需根据目标脑区结构而调整。在非存活实验中，数据采集完成后无需缝合切口。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 七氟烷麻醉下细胞外谷氨酸的测量
<ol>
	<li>在整个操作过程中，确保仔猪持续接受生理监测。&#160;仔猪通过面罩吸入麻醉，为操作做好准备。&#160;</li>
	<li>植入MEA后，等待30分钟，使电极达到基线状态，以确保后续3小时内的测量结果准确（图7）。</li>
	<li>术后镇痛于手术部位皮下注射0.25%布比卡因（1 mL/kg）。此外，根据需要每72小时皮下给予一次缓释丁丙诺啡。</li>
</ol>
5. 灌注与处死
<ol>
	<li>按照先前所述方法进行灌注和脑组织采集操作21。&#160;对于非存活手术，动物在实验结束后仍处于全身麻醉状态下立即实施安乐死。</li>
	<li>对固定的仔猪脑组织进行大体冠状切片，并采用光学显微镜观察电极轨迹，方法如前所述22，以验证MEA的放置位置，确保其准确位于目标区域。</li>
</ol>

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<li>Rice, M. E., Cragg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+spillover+after+quantal+release%3A+rethinking+dopamine+transmission+in+the+nigrostriatal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway.</a> Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).</li>
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<li>Cavus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+metabolites+in+the+cortex+and+hippocampus+of+epileptic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients.</a> Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).</li>
</ol>

Greg Gerhardt 是 Quanteon LLC 的主要所有人。Jorge Quintero 和 Jason Burmeister 曾担任 Quanteon LLC 的顾问。

从实验开始起，必须维持仔猪的生理稳态，具体方法参见本实验室先前发表的文献21最低限度的监测应包括脉搏血氧仪、心电图、二氧化碳监测、无创血压和体温。需要经过培训的研究人员，以应对生理干扰（例如，低/高体温、缺氧、低血压、心律失常）可得到适当纠正。
诱导前 体外 MEA校准用于在已知条件下建立MEA的功能性和选择性。MEA的校准与包被对于该技术的有效应用至关重要。校准过程中可能出现多种潜在误差，而校准过程本身能够识别这些问题以及不恰当的包被操作，后者会导致对干扰物产生错误响应。目前已整理出一份更为详尽的表格，列出了MEA响应中可能出现的各类误差，以及相应的常见成因和建议解决方案，可作为常见故障排查的实用工具。表1需要注意的是，在进行校准和铺板之前，应检查玻璃参比电极是否存在气泡或白色变色现象，因为这两种情况都会对MEA的功能和记录准确性产生不利影响。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>症状</td>
			<td>原因</td>
			<td>纠正措施</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">无信号</td>
			<td>电极未连接</td>
			<td>正确将电极连接至前置放大器，前置放大器连接至FAST安培系统。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST安培系统无电源</td>
			<td>打开FAST系统背面的电源开关</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">信号噪声</td>
			<td rowspan="2">电极被血液污染</td>
			<td>插入电极期间持续冲洗脑表面</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>立即用去离子水（dH2O）冲洗电极</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酶涂层松动</td>
			<td>清洁并重新涂覆电极</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>参比电极未插入或未涂覆</td>
			<td>涂覆参比电极并将其置于头皮下方更深处</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>电极检测到脑表面移动</td>
			<td>通常发生在浅层结构中。如可能，每次插入更深1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">动物移动</td>
			<td>动物固定不充分</td>
			<td>将动物向后移动，以更好地将耳杆固定在颅骨上。如有必要，抬高躯干以实现更好的身体对齐。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>动物麻醉不足</td>
			<td>验证麻醉设备的完整性。将麻醉剂滴定至有效剂量，并给予肌肉注射罗库溴铵（5 mg/kg）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">电极定位不准确</td>
			<td>电极未正确对齐</td>
			<td>在保持与前置放大器正确连接的同时重新调整电极位置。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">立体定位坐标不准确</td>
			<td>确保所参考的仔猪脑图谱未使用其他参考点或对齐平面。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>注意不要因划刻颅骨而遮挡缝线标记。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：猪仔中使用MEA的故障排除指南。 可能的原因及纠正措施，以协助优化和故障排除。
幼猪的立体定位图谱可用于确定相对于前囟等已知点的目标区域的立体定位坐标18。应正确固定耳杆，以确保颅骨水平并完全固定。进行头皮正中切口时应小心操作，避免划伤颅骨，因为这可能影响缝线的可视化。颅骨开窗应足够大，以容纳微电极阵列（MEA）。
本方案存在多项技术挑战，需要配备齐全的手术室，以及在手术和麻醉操作方面经验丰富的研究人员或团队。此外，该模型还存在经费方面的限制，因为仔猪模型的成本高于啮齿类动物模型；然而，其费用显著低于非人灵长类动物模型，后者可能高达数千美元。MEA 技术的应用也面临自身挑战，例如电极的涂覆和镀膜需手动操作，要求研究人员或助手具备熟练技能，以确保足够的选择性和可靠的功能。微电极本身由陶瓷材料制成，较为脆弱，若未谨慎操作，极易损坏。微电极易受其他电子设备的干扰，导致记录中出现噪声，也易受手术部位血液的影响，可能堵塞记录位点。专用设备的需求进一步增加了负担，例如需要定制立体定位手术架，以在植入过程中固定仔猪颅骨。立体定位架、谷氨酸氧化酶以及电极本身均价格昂贵。此外，近十年内尚无仔猪立体定位图谱可用，这构成了技术上的局限性，需要研究人员具备特定专业知识，才能准确定位仔猪脑内深部结构。若能开发新的立体定位图谱，例如采用磁共振成像技术，将极大提升该技术在仔猪模型中的应用能力。
仔猪是研究麻醉诱导神经毒性的临床相关模型，这主要归因于该物种与人类新生儿之间存在的诸多相似之处，两者具有类似的大脑结构和发育过程。与小鼠或大鼠等更常用的动物模型不同，仔猪的中枢神经系统与人类更为相似，从而提高了实验结果的可转化性。此外，与非人灵长类动物模型相比，仔猪模型成本更低，操作也更为简便。该模型旨在研究麻醉剂诱导发育性神经毒性的机制，评估其对神经系统损伤的贡献，并克服混杂因素所导致损伤的分析难题。例如，缺氧会对大脑产生广泛影响，可能被误判为麻醉药物引起的损伤。为确保实验结果的可靠性，仔猪模型采用与人类医学相同的外科手术和麻醉条件。
基于陶瓷的MEA技术消除了与当前微透析技术相关的多个缺点。与安培法（如MEA）相比，微透析在时间和空间分辨率上均较为有限，而MEA能够在多个显微区域以高达10 Hz的频率连续记录谷氨酸事件23。这种快速采样率避免了局部神经递质扩散带来的干扰因素，而这类干扰是微透析等慢速采样方法固有的问题24。此外，MEA相较于微透析探针具有更小的侵入性；微透析探针在插入过程中可能引起显著的胶质增生，并可能改变插入部位的神经递质活性22。
既往研究采用多种哺乳动物模型、测量技术及脑区，所测得的基础谷氨酸水平与本技术获得的结果相当。这表明，当微电极阵列（MEA）技术应用于仔猪模型时，可提供有效的记录 体内 谷氨酸浓度（表2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>作者（年份）</td>
			<td>记录技术</td>
			<td>动物模型</td>
			<td>年龄</td>
			<td>脑区</td>
			<td>平均基础谷氨酸浓度（µM）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hascup et al. (2008)23</td>
			<td>MEA（基于酶）</td>
			<td>啮齿类动物</td>
			<td>20 - 24 周&#160;</td>
			<td>前额叶皮层、纹状体&#160;</td>
			<td>3.3 ± 1.0; 5.0 ± 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hascup et al. (2010)25</td>
			<td>MEA（基于酶）</td>
			<td>啮齿类动物</td>
			<td>3 - 6 个月</td>
			<td>海马体&#160;</td>
			<td>4.7 - 10.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rutherford et al. (2007)9</td>
			<td>MEA（基于酶）</td>
			<td>啮齿类动物</td>
			<td>&#160;3 - 6&#160;个月&#160;</td>
			<td>前额叶皮层、纹状体</td>
			<td>44.9 ± 4.7; 7.3 ± 0.9&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miele et al. (1996)26</td>
			<td>微透析（基于酶）</td>
			<td>啮齿类动物</td>
			<td>-</td>
			<td>纹状体&#160;</td>
			<td>3.6&#160; ± 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day et al. (2006)27</td>
			<td>MEA（基于酶）</td>
			<td>啮齿类动物</td>
			<td>3 - 6 个月</td>
			<td>额叶皮层、纹状体&#160;</td>
			<td>1.6 ± 0.3 ;1.4 ± 0.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quintero et al. (2007)28</td>
			<td>MEA（基于酶）</td>
			<td>非人灵长类动物</td>
			<td>5.3 - 5.5 年&#160;</td>
			<td>前运动皮层、运动皮层</td>
			<td>3.8 ± 1.7; 3.7 ± 0.9&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stephens et al.&#160; (2010)29</td>
			<td>MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)]&#160;</td>
			<td>非人灵长类动物</td>
			<td>&#160;11 - 21 年&#160;</td>
			<td>壳核</td>
			<td>8.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodama et al. (2002)30</td>
			<td>微透析（基于酶）</td>
			<td>非人灵长类动物</td>
			<td>-</td>
			<td>前额叶皮层&#160;</td>
			<td>1.29 - 2.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvan et al. (2003)31</td>
			<td>微透析（基于酶）</td>
			<td>非人灵长类动物</td>
			<td>幼年&#160;</td>
			<td>纹状体</td>
			<td>28.74 ± 2.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>During and Spencer (1993)32</td>
			<td>微透析（基于酶）</td>
			<td>人类</td>
			<td>18 - 35 年&#160;</td>
			<td>海马体&#160;</td>
			<td>20.3 ± 6.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinstrup et al. (2000)33</td>
			<td>微透析（基于酶）</td>
			<td>人类</td>
			<td>-</td>
			<td>额叶皮层</td>
			<td>16 ± 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavus et al. (2005)34</td>
			<td>微透析（基于酶）</td>
			<td>人类</td>
			<td>15 - 52 年</td>
			<td>新皮层</td>
			<td>2.6 ± 0.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 不同动物模型间基础细胞外谷氨酸水平的比较。 一项针对使用微透析或微电极技术测定健康清醒及麻醉动物细胞外谷氨酸正常水平的研究的精选综述。
利用MEA技术监测仔猪模型中in vivo的谷氨酸浓度，可为评估麻醉后仔猪神经功能预后提供依据。目前已有计划开展存活实验，以进一步了解麻醉对人类新生儿神经认知健康产生的长期影响。存活实验将允许在麻醉暴露后较长时间内进行行为学测试，并持续监测谷氨酸水平的变化。此外，儿童在接受外科手术等可能引起生理应激的条件下接受麻醉也是常见情况。未来针对手术对神经损伤及神经毒性增加影响的研究，将有助于更准确地模拟儿童常见的临床场景。采用其他动物模型同样可行，且可通过慢性植入方式对这些不同模型进行研究，从而追踪与神经毒性相关的行为变化。MEA技术本身具有高度灵活性，因此未来研究不仅限于谷氨酸水平的分析（例如，GABA、胆碱、赖氨酸等等也可被检测）。

每年，美国有数百万儿童因侵入性和非侵入性手术接受麻醉1。多年来，麻醉提供者一直向家长保证麻醉药物的安全性，即使在婴幼儿和新生儿中也是如此。然而，1999年研究发现，生命早期短暂阻断谷氨酸受体的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）亚型可导致大鼠出现广泛的神经元凋亡2。最近，美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration, 2017）发布了一项药品安全通告，要求在麻醉药物标签中增加警示，提示全身麻醉药可能对3岁以下儿童发育中的大脑产生潜在不良影响。然而，目前仍需进一步阐明其可能的作用机制及潜在的神经保护措施。
谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）等神经递质的正常活动对于正常的神经发育至关重要。尽管目前参与麻醉诱导的神经毒性（AIN）的大多数通路仍不明确，但神经递质系统极有可能参与其中，因为已知麻醉药物可通过调节这些通路来诱导意识丧失。特别是，当兴奋性神经递质谷氨酸的活性失调时，可导致兴奋性毒性。该神经递质通常参与神经发生、神经可塑性、突触和神经生长，以及其他多种至关重要的脑功能。然而，在手术、缺氧以及能量供应减少等应激条件下，谷氨酸受体的持续激活可能导致兴奋性毒性及神经元凋亡3。研究表明，谷氨酸与NMDA受体结合可引起Na+和Cl−内流，随后的去极化被认为会引发Ca2+通道开放并释放细胞内Ca2+储存4。这种功能障碍可能引发一系列代谢紊乱，最终导致神经元增殖减少、炎症增加，并引起神经元死亡。尽管存在这些假说，AIN的确切机制仍不清楚5。由于谷氨酸在凋亡中的作用，其功能失调代表了一条新的通路，可能有助于解释先前报道的神经元凋亡现象，而神经元凋亡正是AIN的一个特征。
神经元过程研究面临的主要障碍之一是其高度复杂性，尤其是在神经元发育的背景下。生命最初几个月是损伤最易感的时期，在此期间，神经元发育的许多关键步骤（如生理性凋亡（神经元修剪）、突触发生、胶质发生和髓鞘化）相继发生。6鉴于神经元通讯的复杂性，以及在不干扰中枢神经系统正常功能的前提下研究这些过程的困难，人们已开发出旨在实现这一目标的新技术 体内 神经元通讯重要组分的检测与定量
本研究采用酶联微电极阵列（MEA）技术，作为一种新颖的方法，在具有临床相关性的仔猪模型中研究急性肝性脑病（AIN）的机制。该技术可用于研究复杂的体内电化学脑过程，包括谷氨酸调节异常。MEA整合了4通道铂记录位点（2个对谷氨酸敏感的位点和2个哨点位点），可实现自我参照，从而提高检测准确性。此外，每个电极均涂覆有排斥层，可阻止其他干扰分子被检测，从而赋予电极选择性7。同时，MEA的低剖面设计与早期技术相比可显著减少组织损伤。这一特性还使MEA具有更高的空间分辨率，有助于对脑内微观区域进行研究。例如，可针对性地研究海马体的特定区域（齿状回、CA1、CA2）8。有关MEA功能的具体细节此前已有描述9。
与MEA电化学技术相比，微透析技术在待测溶液与组成相似的溶液之间放置了一层膜，从而能够检测细胞外液的变化10。尽管微透析是神经化学研究中的常用方法，并长期用于神经递质的检测，但其存在时间分辨率低、谷氨酸变化检测延迟以及引起显著组织损伤等缺点11。
通过使用适当的氧化酶，MEA 可间接检测谷氨酸、乙酰胆碱和胆碱等神经递质，这些氧化酶可产生如 H2O2 或 O212,13 等电活性报告分子。
MEA 技术已广泛应用于大鼠和非人灵长类动物，用于研究除 AIN 以外其他病理生理过程中的神经毒性7,14。在这些病理生理过程中的某些方面，MEA 技术已被用于研究阿尔茨海默病、癫痫、创伤性脑损伤以及药物化合物对突触通讯的影响8,15,16,17。尽管 MEA 已被用于研究大鼠和非人灵长类动物中的这些病理状态，但人类与仔猪大脑之间高度相似的发育特征，使得将 MEA 技术应用于仔猪成为研究 AIN 机制的一种极为适宜的技术18。

<table><tbody><tr><td>Advance Liqui-Wean 猪用代乳粉</td><td>PBS Animal Health</td><td>292-13</td><td></td></tr><tr><td>仔猪麻醉面罩锥形接口</td><td>VetEquip</td><td>921428</td><td></td></tr><tr><td>Integra SL 麻醉工作站</td><td>DRE Veterinary</td><td>2350</td><td>选择该麻醉工作站是为了最大程度模拟儿科患者在手术室中所经历的临床监护环境。只要麻醉机能够提供充分的生理监测和干预能力，任何型号均可使用。</td></tr><tr><td>七氟烷</td><td>Ultane</td><td>0074-4456-04</td><td></td></tr><tr><td>罗库溴铵注射液</td><td>Hospira</td><td>0409-9558-05</td><td></td></tr><tr><td>Medfusion 4000 IV 输液泵&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 1530 重型科研用立体定位仪</td><td>Kopf</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>Model 1541 仔猪适配器</td><td>Kopf</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>红外聚光灯</td><td>Amazon</td><td>B000HHQ94C</td><td></td></tr><tr><td>Bair Hugger 躯干保温毯</td><td>3M</td><td>540</td><td></td></tr><tr><td>Bair Hugger 保温系统主机</td><td>3M</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>无菌酒精消毒垫</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>碳钢背肋外科刀片</td><td>Bard-Parker</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Havel's</td><td>HAN-G4</td><td></td></tr><tr><td>外科剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>504615</td><td></td></tr><tr><td>蚊式止血钳</td><td>Sklar Surgical Instruments</td><td>17-1225</td><td></td></tr><tr><td>纱布垫</td><td>Fisherbrand</td><td>22-246-069</td><td></td></tr><tr><td>Adson 组织镊</td><td>Teleflex</td><td>181223</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 111 雕刻切割头</td><td>Amazon</td><td>Dremel 111</td><td></td></tr><tr><td>微电极阵列</td><td>肯塔基大学微电极技术中心</td><td></td><td>S2 4通道 MEA；定制</td></tr><tr><td>前置放大器</td><td>Quanteon</td><td></td><td>2pA/mV</td></tr><tr><td>导线，银质，PFA涂层，裸径.008&quot;，总径.0110&quot;</td><td>A-M Systems</td><td>786500</td><td></td></tr><tr><td>精细微操作器</td><td>Narishige Scientific Instrument Lab</td><td>MO-8</td><td></td></tr></tbody></table>

利用微电极阵列技术研究麻醉诱导的新生仔猪脑神经毒性的方法改良

Adaptation of Microelectrode Array Technology for the Study of Anesthesia-induced Neurotoxicity in the Intact Piglet Brain

每年，数百万儿童因各种手术需要接受麻醉。然而，动物和人类的研究均对儿童麻醉的安全性提出了质疑，提示麻醉药物可能对发育中的大脑具有神经毒性。迄今为止，尚无研究成功阐明麻醉导致神经毒性的具体机制。动物研究可用来探索此类机制，而新生仔猪因其大脑发育与人类大脑具有显著的相似性，是研究这些效应的理想模型。
本方案采用基于酶的微电极阵列（MEA）技术，作为一种研究麻醉诱导神经毒性（AIN）机制的新方法。MEA可实现对神经活动的实时监测 体内 神经递质活性，并具有优异的时间和空间分辨率。人们假设麻醉性神经毒性部分由谷氨酸调节失调引起，而微电极阵列（MEA）提供了一种检测谷氨酸的方法。在仔猪模型中首次应用MEA技术，为研究麻醉诱导的神经毒性（AIN）提供了独特的机会。

本项基于酶法陶瓷MEA技术在仔猪模型中的概念验证研究，可为深入了解急性脑病（AIN）相关的谷氨酸动态变化提供独特视角。该研究进一步证明，基于酶法的MEA技术可成功应用于仔猪模型，以高灵敏度以及高空间和时间分辨率检测神经递质活动的生理变化及与麻醉相关的变化。在实验过程中，我们采用临床相关的方法和标准维持了生理稳态，所有仔猪均未出现生理紊乱的迹象。
所获得的数据表明，微电极阵列（MEAs）能够对大脑皮层及皮层下结构中的神经递质进行精确且具有空间分辨能力的检测。使用立体定位仪可清晰识别参考表面结构（前囟），从而在不同个体仔猪大小和解剖结构存在差异的情况下，仍能准确定位目标区域。颅骨缝线的清晰可视化有助于实现微米级精度的微电极阵列区域定位。图4）。以最小创伤进入大脑皮层表面，几乎无出血，确保任何 体内 谷氨酸动态变化并非由非预期的系统性或局部损伤所致（图5）。然后将定制的刚性MEA垂直对准仔猪的额状面（图6）。在插入之前若未能正确对齐MEA，可能会影响目标区域的空间记录准确性，尤其是对于皮层下区域。
实时 体内 在3-4日龄仔猪的海马中进行了谷氨酸浓度测定（n 在2.5–3%七氟烷麻醉（约1 MAC）下进行安培法测量，记录频率为4 Hz，并根据校准参数通过线性回归转换为浓度图8，图A）。对于每个时间点，先对两个谷氨酸敏感位点的信号取平均值，再减去平均的哨点信号，以获得校正后的谷氨酸信号。这些连续测量数据通过应用移动平均法进行平滑处理，以更清晰地显示随时间变化的整体趋势（图8，图B). 平均基础谷氨酸浓度计算为 4.61 ± 0.02 µM 在麻醉暴露过程中保持相对稳定。通过分析与哨兵信号（R）不相关的信号峰值，在一只动物中检测到短暂的谷氨酸能活动。2 &lt; 0.5），且信噪比超过3（图9，图A）。在3.5小时内共检测到116个瞬时峰（图10，图A）。通常观察到所产生瞬态峰的幅度处于 1 µM 范围（图10，图B）。为了量化每个瞬态过程的持续时间，需记录时间（t80）以获得每个最大峰值衰减80%所需的时间（图9，图B）。平均 t80 在3.5小时记录期间，所有谷氨酸瞬变的持续时间为4.68 ± 0.82 s（图10，图C这些数据表明，可以在麻醉幼猪大脑的皮层下区域准确测量持续性和短暂性的神经递质活动。
<img alt="神经记录探针示意图；包含柔性、刚性轴以及用于电生理学记录的记录位点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：SG-2微电极阵列类型的视觉对比。 SG-2阵列包含两个谷氨酸敏感位点和两个谷氨酸不敏感的哨点位点（每个位点尺寸为150 µm × 20 µm）。(A) 左侧显示的是柔性轴微电极阵列。刚性轴微电极阵列为专为仔猪实验定制设计，可在大型动物中实现更深层的植入。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MEA 制备循环示意图：包被、固化、电镀、用于酶分析的校准。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：微电极阵列制备与校准流程概览。 整个 MEA 的制备与校准过程大约持续一周。包被的酶、排阻层以及校准所用分析物均针对目标神经递质而定。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="动物实验中用于医学研究的仔猪手术操作，展示实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：仔猪在立体定位仪中的放置方式。 将仔猪的嘴部置于门齿后方的咬合杆上。将可插入式耳棒插入耳道，以固定颅骨后部。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="手术过程中标记的小猪颅缝；用于解剖学研究和培训的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：小猪在立体定位仪中进行开颅手术的放置方式。（A）小猪头部被牢固固定在定制的立体定位框架内，以确保微电极阵列（MEA）位置的一致性。可见耳杆穿透部位等距放置。（B）沿头皮正中线做前后方向切口。避免对颅骨进行划痕处理，以便清晰观察冠状缝和矢状缝，并优化前囟点（bregma）的可视化效果。图中显示了比例尺，用于指示切口的相对大小以及开颅窗的位置。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="动物模型系列中手术骨缺损再生过程，显示伤口愈合各阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：为进入海马体而进行的开颅手术。（A）进一步牵开头皮，以暴露根据立体定位坐标确定的MEA插入位置的大致区域。圈出的区域已标记（黑点），用于指导开颅位置。（B）开颅窗（0.25 cm2），移除颅骨瓣以暴露下方的硬脑膜。（C）小心去除脑膜，以暴露浅层大脑皮层，同时避免组织损伤。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="颅神经研究的手术操作示意图，显示电极放置位置及所用设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：MEA的定位及插入海马体。 (A) 将MEA置于前囟，以确定海马的相对立体定位坐标。B) 通过立体定位将MEA置于脑表面，以确定海马插入深度。银制伪参考电极牢固地放置于头皮下（箭头所示）。CMEA 插入至适当深度以获取实时数据， 体内 海马体中细胞外谷氨酸的测量 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="谷氨酸浓度衰减图；对数刻度；神经科学数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：MEA 在 30 分钟基线期的行为表现。 初始的快速上升对应于使用显微操作器将MEA下降至海马体的过程。当MEA到达适当深度后（虚线处），基线期即开始。细胞外谷氨酸浓度在30分钟内会逐渐下降，不应将其解读为生理状态下的读数。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="谷氨酸浓度随时间变化图；实验数据分析；μM 水平；A 和 B 比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 8"> 
图 8：在七氟烷麻醉下新生猪海马区细胞外谷氨酸的实时测量。 （A）一只在七氟烷麻醉下的新生猪海马区谷氨酸浓度的移动平均值（使用 10 个数据点）。在短暂的 30 分钟基线期后，以 4 Hz 的频率持续测量 3 小时。（B）每 15 分钟使用 100 个数据点的移动平均法对谷氨酸测量值进行平滑处理，以更清晰地显示变化趋势。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="谷氨酸浓度随时间变化的图表，显示数据变异性及峰值分析，实验图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9：在异氟烷麻醉下新生猪海马中瞬时谷氨酸活性的识别。（A）实时谷氨酸信号轨迹中显示的瞬时谷氨酸峰值（红色）。当信噪比超过3且其信号与哨点信号无相关性（R2 &lt; 0.5）时，认为峰值具有显著性。（B）在图9，面板A中识别出的一个代表性瞬时峰值。虚线表示峰值衰减80%所需的总持续时间。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="谷氨酸分析图；3.5小时内的峰、振幅和平均时间数据；柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57391/57391fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图10"> 
图10：七氟烷麻醉下新生猪海马中谷氨酸瞬时信号的表征。（A）每15分钟时间段内出现的多个瞬时谷氨酸峰。当信噪比超过3且其信号与哨兵信号不相关（R2 &lt; 0.5）时，认为峰具有显著性。（B）瞬时谷氨酸峰的振幅。误差条表示均值的标准误。（C）瞬时谷氨酸峰的平均T80 。误差条表示均值的标准误。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57391/57391fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究探讨了基于酶的微电极阵列（MEA）技术在监测中的创新应用 体内 仔猪神经递质活性. 假设谷氨酸调节异常参与了麻醉药神经毒性的机制。本文介绍了一种利用微电极阵列（MEA）技术研究麻醉诱导神经毒性机制的实验方案。

每年，数以百万计的儿童因各种手术接受麻醉。然而，动物和人类研究均对……提出了质疑

本实验方案的总体目标是利用基于酶的微电极阵列技术的一种新应用，来检测新生仔猪中的神经递质。在本示例中，通过检测体内谷氨酸活性来研究麻醉诱导的神经毒性。该技术的主要优势在于，可在与麻醉诱导神经毒性相关的临床动物模型中，以极高的空间和时间分辨率测量体内的神经递质活性。尽管该方法可为麻醉诱导的神经毒性机制提供见解，但也适用于其他病理状态，如小儿脑损伤、癫痫和中风。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为仔猪模型的应用需要一定的经验与实践。此外，微电极阵列的使用也需要具备专门的技术能力。该方法的可视化演示至关重要，因为手术和微电极放置步骤较为精细，学习难度较高。本实验应使用处于大脑生长高峰期的仔猪，即出生后3至5天的仔猪。实验前应让其适应环境至少24小时。必须由经过培训的工作人员照顾仔猪。应让其自由摄取营养物质，并提供毯子和一些玩具以给予刺激。在麻醉前至少三小时，将代乳品从笼中移除，以确保仔猪胃部排空。遵循ARRIVE指南以消除任何潜在的性别相关混杂因素。随后，在配备有小儿呼吸机和适当监测设备的麻醉工作站对仔猪进行气管插管并实施机械通气。然后，以1 MAC的七氟烷进行3.5小时的麻醉维持。现在，通过夹捏脚趾确认麻醉深度足够，然后将仔猪固定在带有充足垫料的仔猪专用立体定位仪上。将上颌牙齿置于门齿杆上方。接着，固定并拧紧两个穿刺式耳杆，使仔猪身体中线居中。将耳杆插入至足够牢固，以听到鼓膜弹出的声音。开始给予罗库溴铵负荷剂量并持续输注，以防止仔猪在固定于框架中时产生移动。必须确保仔猪保持温暖，并持续监测其生命体征。使用加热灯和/或毛毯维持正常体温。确保加热灯距离适当，避免灼伤。若需保证仔猪存活，应采取额外措施以保持手术区域无菌。现在，开始植入微电极阵列。首先，沿颅骨中线做一个4至6厘米的切口，操作时需小心，避免使用手术刀划伤颅骨。切口完成后，轻柔牵拉并进行钝性分离，将头皮从颅骨上剥离。接着，用纱布轻轻擦拭颅骨以去除任何结缔组织，并暴露缝线。然后确定开颅的位置。如果感兴趣区域仍被遮挡，可进一步牵开头皮。现在，使用外科钻头在目标结构上方制作一个约 0.25 平方厘米的颅骨开窗。注意避免损伤硬脑膜或其下方的脑组织。根据需要，使用精细的外科工具切除覆盖在脑组织上的硬脑膜。务必格外小心，避免损伤脑组织。本实验采用一种先前已描述的基于酶的微电极阵列，该阵列预先包被了谷氨酸氧化酶，并电镀了间苯二胺（mPD）。微电极阵列具有40毫米长的刚性轴，专为仔猪实验定制。将金属臂固定到显微操作器上，然后尽可能垂直地将微电极阵列置于前囟上方。接着，小心地将阵列缓慢下降至接近颅骨表面但不接触的位置，记录前囟的坐标。随后，利用仔猪脑图谱确定目标结构的精确立体定位坐标，并据此重新调整微电极的位置。接下来，将伪参考电极置于头皮下方，确保与动物体接触。然后缓慢将微电极阵列插入脑内，至接近目标深度。在最后两毫米的进给过程中，使用液压微驱动装置轻柔地将阵列降至目标脑区结构，以最大限度减少组织损伤。微电极阵列定位后，等待30分钟，使电极达到基线水平。随后进行约三小时的测量。如果仔猪需在实验后存活，在采集数据后关闭切口。按照所述方法，在异氟烷麻醉下对三至四日龄幼猪的海马区进行了实时活体谷氨酸浓度测量。记录时间超过三小时。安培法测量数据以每秒4赫兹的频率采集，并根据校准参数通过线性回归转换为浓度值。在每个时间点，先将两个谷氨酸敏感位点的信号取平均值，再减去平均的哨点信号，以获得校正后的谷氨酸信号。基础谷氨酸浓度平均约为 4.6 微摩尔，并在麻醉暴露过程中保持相对稳定。通过分析与哨点信号无相关性且信噪比大于 3 的信号峰，识别出短暂的谷氨酸能活动。在实验期间共检测到116个瞬时峰。观察到的瞬时峰幅度通常在1微摩尔范围内。为了量化每个瞬时峰的持续时间，测定了每个峰值衰减80%所需的时间，结果约为4至5.5秒。一旦掌握，该技术若系统而谨慎地操作，可在四小时内完成。在实施该过程时，重要的是要始终注意尽量减少任何可能干扰实验数据的非预期组织损伤。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法，例如检测其他电化学分析物，以回答更多科学问题。

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