Name: BioID 细胞环境中特异蛋白复合物的分离-蛋白质组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学习使用split-BioID邻近标记技术分离活细胞中特异性组装的蛋白复合物，并通过质谱分析进行蛋白质组学鉴定。该方法可在天然细胞环境中高分辨率地识别情境依赖性蛋白相互作用。

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本工作由德国研究基金会（DFG）通过德国卓越计划（CellNetworks DFG-EXC 81）资助，并由合作研究中心 SFB638 提供部分经费支持。

注意：方法的概述见图1。
1. 克隆策略的规划
<ol>
	<li>选择两种假定存在相互作用的蛋白质进行测试。 
	注意：这两种蛋白质中的每一种都将与一个分裂型BioID片段融合：即NBirA*或CBirA*。作为阴性对照，将用NBirA*-GFP（NBirA*与绿色荧光蛋白融合）来测试CBirA*融合蛋白。作为额外对照，也可单独测试NBirA*融合蛋白，即不与对应的CBirA*融合蛋白共表达，或将其与融合了无关蛋白的CBirA*共表达。建议不要使用CBirA*-GFP作为阴性对照，因为已有研究表明，CBirA*-GFP与任何NBirA*融合蛋白组合时均会导致显著的背景信号9。该现象的原因可能是CBirA*-GFP的表达水平远高于我们迄今使用的其他任何CBirA*融合蛋白，从而可能导致其与NBirA*片段发生明显的重新结合。</li>
	<li>选定两种蛋白质后，查阅文献，确认是否已有研究成功地对这两种蛋白质进行了功能性标记（例如，作为GFP标记的融合蛋白）。
	<ol>
		<li>若存在此类研究，记录标记的位置（N端或C端），并采用相同取向将目标蛋白质与分裂型BioID片段进行标记。</li>
		<li>若无相关研究，则设计构建体，分别在目标蛋白质的N端和C端进行标记，并规划实验以检测融合蛋白的功能性（例如，在野生型蛋白缺失的细胞系中进行拯救实验）。 
		注意：当使用图2中描述的编码长柔性连接子的质粒配对两个融合蛋白时，融合蛋白的取向（BirA*片段位于目标蛋白的上游或下游）通常不影响结果。事实上，以FRB和FKBP作为模型蛋白的研究表明，四种可能的组合方式（两个片段均位于N端、均位于C端、一个在N端另一个在C端，以及相反组合）所产生的生物素化水平相当9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计引物以扩增两个目标蛋白的开放阅读框（ORF），用于克隆至分裂型BioID质粒中。注意确保其翻译阅读框与BirA*片段一致。若使用图2中描述的质粒，构建CBirA*融合体时使用PmeI和PacI限制性内切酶，构建NBirA*融合体时使用ClaI和MluI酶。 
	注意：图2所示质粒携带一个双向四环素响应元件，两侧为F3/FRT重组位点。这使得两个融合蛋白能够从同一质粒以相近水平实现调控共表达10，并可通过重组介导的盒式交换（RMCE）快速构建稳定细胞系。在这些质粒中，NBirA*带有myc标签，而CBirA*带有FLAG标签。当然，ORF也可克隆至带有组成型启动子的独立质粒上。 
	关键步骤：在测试两种相互作用蛋白时，建议比较以下两种组合：NBirA*与蛋白1融合并搭配CBirA*与蛋白2融合，以及NBirA*与蛋白2融合并搭配CBirA*与蛋白1融合。事实上，经常观察到其中一种组合的效果优于另一种。</li>
</ol>
2. 将目的基因的ORF克隆至分裂型BioID质粒中
注意：本示例中考虑了两种可在N端进行标记的蛋白质。将测试并比较四种条件，并与未转染的细胞进行对比（表1）。
<ol>
	<li>使用聚合酶链式反应（PCR）扩增待检测的两种蛋白的开放阅读框（ORF），并选用适当的引物。设计引物时，应引入ClaI和MluI限制性酶切位点用于NBirA*融合蛋白，引入PacI和PmeI位点用于CBirA*融合蛋白。 
	注意：PCR反应可使用任何商业化的DNA聚合酶，优先选择具有校对功能的酶。请遵循产品说明书中的标准操作流程，并根据引物的熔解温度及待扩增ORF的长度，按照制造商建议进行条件优化。</li>
	<li>亚克隆第一个ORF
	<ol>
		<li>用ClaI和MluI酶同时消化质粒（约2 μg）和PCR扩增得到的ORF1（将与NBirA*融合）。在1.5 mL离心管中，将每种酶各取1 μL，与适量DNA和反应缓冲液混合，总体积为20 μL，在37 °C下孵育1小时。</li>
		<li>将两种酶切产物在1%琼脂糖-TAE DNA凝胶上电泳。用洁净的手术刀切下对应于酶切后质粒和ORF1的条带，并转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>使用标准DNA提取试剂盒纯化两条DNA片段。</li>
		<li>使用标准连接试剂将酶切后的质粒与ORF1进行连接。
		<ol>
			<li>若使用材料表中指定的连接试剂盒，则在4.5 μL总体积中加入含插入片段摩尔数为质粒3至5倍的100 ng DNA。加入5 μL 2× T4连接酶缓冲液及0.5 μL T4 DNA连接酶（来自试剂盒）。在1.5 mL离心管中，室温（RT）孵育10分钟完成连接反应。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将连接产物转化至标准DH-5α E. coli 感受态细胞中（按Inoue方法制备11）。
		<ol>
			<li>在1.5 mL离心管中，将3 μL连接反应产物与50 μL感受态细胞混合，冰上孵育30分钟。随后将离心管转移至42 °C金属浴中热激30–45秒，再放回冰上孵育2分钟。加入250 μL预热至37 °C的LB（Lysogeny Broth）培养基，取100 μL菌液涂布于预热（37 °C）的含氨苄青霉素的LB琼脂平板上。37 °C过夜培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>次日，挑取4至6个单菌落，接种于含100 μg⋅mL-1氨苄青霉素的3 mL LB培养基中，置于15 mL离心管中，37 °C、180 rpm振荡培养过夜。</li>
		<li>使用标准质粒DNA小提试剂盒（MiniPrep）从所挑菌落中提取质粒DNA。</li>
		<li>使用Cassette 2反向引物（表2）进行Sanger测序，验证质粒构建的正确性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在确认获得含第一个ORF的正确质粒后，按照步骤2.2相同的操作流程，使用PmeI和PacI限制性内切酶将第二个ORF亚克隆至该质粒中。</li>
	<li>使用Cassette 1反向引物（表2）对最终获得的质粒进行测序验证。</li>
</ol>
3. 融合蛋白的检测
注意：以下说明适用于双诱导表达质粒（图2）和HeLa-11ht细胞，后者是一种稳定表达反向四环素调控转录激活因子rtTA-M2并含有RMCE位点的HeLa-CCL2亚克隆细胞系12。这些细胞的培养基为含10%无四环素胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。若使用其他细胞类型，需相应调整具体的接种条件和培养基。
<ol>
	<li>瞬时转染
	<ol>
		<li>以 1 x 10 的浓度接种细胞5 六孔板每孔加入2 mL细胞悬液，于转染前一天接种细胞，37 °C、5% CO₂条件下过夜培养2 在细胞培养孵育箱中。</li>
		<li>转染当天，吸去每孔中的培养基，更换为 2 mL 新鲜培养基。</li>
		<li>根据以下步骤准备四种转染反应 表1每个转染孔，在1.5 mL无菌离心管中加入6 µg聚乙烯亚胺和3 µg质粒DNA，用无血清DMEM培养基定容至500 µL。</li>
		<li>将每种转染混合物在室温下孵育至少5分钟，然后逐滴加入各孔中。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导与邻近标记
	<ol>
		<li>转染后的第二天，移除培养基，更换为添加了50 µM生物素以促进生物素化、以及200 ng⋅mL的多西环素的培养基−1 以诱导融合蛋白的表达。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育至少20小时。2.
		<ol>
			<li>配制生物素储备液：将生物素溶解于50 mg⋅mL⁻¹的溶液中-1 （对应于 ca. 200 mM）溶于2 M氢氧化铵中。待其完全溶解后，用500 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）稀释至50 mM，并用HCl调节pH至7.4。分装后将所得的1,000倍储存液于-20 °C保存。将多西环素溶解至10 mg⋅mL-1 在70%乙醇中保存，并置于-20 °C避光条件下存放在螺旋盖微量离心管中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解液制备
	<ol>
		<li>用1 mL冷的（4 °C）磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。</li>
		<li>向每个孔中加入 100 µL 裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM EDTA，0.5% NP-40，0.5 mM DTT 和蛋白酶抑制剂）。</li>
		<li>用细胞刮刀收集细胞，并转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>以 14,000 x g 离心样品 g 4 °C下离心10分钟以去除细胞碎片。</li>
		<li>将上清液转移至新的离心管中，置于冰上。</li>
		<li>使用Bradford法测定蛋白质含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和蛋白质印迹法
	<ol>
		<li>制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶。</li>
		<li>对于每份澄清的裂解液，用30 µL SDS上样缓冲液制备含30 µg（最低15 µg）蛋白的PAGE样品。随后将每份样品等量上样（20 µL/孔）至SDS-聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳。</li>
		<li>电泳后，使用任何标准方案将分离的蛋白质转移至低荧光PVDF印迹膜上。 
		注意：在分析蛋白质生物素化时，采用10分钟的转膜时间 &#34;高分子量&#34; 快速转印半干式蛋白质印迹装置的程序通常运行良好。</li>
		<li>转膜后，在室温下用含5%脱脂奶粉的PBS溶液封闭膜30分钟。</li>
		<li>将膜置于含2% BSA和0.1% Tween-20的PBS中，按1:15,000稀释荧光标记链霉亲和素，室温孵育30–60分钟。</li>
		<li>用含0.1% Tween-20的PBS洗涤膜3次，每次10分钟，然后再用PBS洗涤一次。</li>
		<li>在荧光扫描成像系统上扫描膜。 
		注意：此处展示了一张典型的蛋白质印迹图 图3上述步骤描述的是基于荧光的检测方法，但使用HRP偶联的链霉亲和素进行基于化学发光的检测同样有效。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于蛋白质组学研究的分裂 BioID 技术
关键注意事项：在进行最终的质谱分析时，所有以下步骤均需在无角蛋白条件下进行，所有材料和试剂应尽可能无角蛋白。
<ol>
	<li>瞬时转染
	<ol>
		<li>转染前一天，每种条件接种三到四个10 cm培养皿，细胞密度为8 × 10⁶个/皿。5 每孔加入10 mL细胞，于37 °C、5% CO₂条件下培养过夜2 在细胞培养孵育箱中。</li>
		<li>第二天，为每种转染条件配制转染主混合液：每种条件对应三块培养板，将36 µg聚乙烯亚胺和18 µg质粒DNA溶解于900 µL无血清DMEM中。将每种转染主混合液在室温下孵育至少5分钟。</li>
		<li>同时，将每皿中的培养基更换为新鲜培养基，然后逐滴加入300 µL转染混合物至每个培养皿中。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下将细胞孵育过夜2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导与邻近标记
	<ol>
		<li>转染后第二天，将细胞转移至15 cm培养皿中。每个培养皿操作如下：移除培养基，用7 mL PBS洗涤细胞，加入1.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在室温下孵育5分钟。加入3.5 mL生长培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至含有20 mL生长培养基的15 cm培养皿中，培养基中添加50 µM生物素以促进生物素化，以及200 ng⋅mL⁻¹多西环素−1 （终浓度）以诱导融合蛋白的表达。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞至少 20 小时2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞的收获与保存
	<ol>
		<li>用 PBS 清洗细胞两次，然后向每孔加入 1.5 mL PBS，用细胞刮刀收集细胞。</li>
		<li>将对应于一种条件的收获细胞转移至一个15 mL离心管中，并在1,200 x g条件下离心收集细胞 g，5 分钟，4 °C。</li>
		<li>移去上清液，将沉淀物在液氮中速冻，然后于 -80 °C 保存，直至进一步处理。 
		注意： alternatively，细胞也可通过胰蛋白酶消化法解离，用生长培养基收集后转移至15 mL离心管，用PBS洗涤三次，再进行冻存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解物的制备
	<ol>
		<li>将细胞沉淀重悬于1 mL裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，500 mM NaCl，0.4% SDS，5 mM EDTA，1 mM DTT，1×完全蛋白酶抑制剂）中，室温下进行。用25 G针头将细胞反复吹打10–20次（5至10个往复）。</li>
		<li>使用超声波处理装置对样品进行超声处理。 
		注意：使用文中指定的声波装置时 材料表，可使用以下程序：在低温（4 °C）水浴中进行四次高强度超声处理，每次30秒。也可使用其他超声设备，但参数可能需要相应调整。</li>
		<li>向收集的超声破碎裂解液中加入Triton X-100，使其终浓度达到2%（通常向900 μL超声破碎细胞裂解液中加入100 μL 20% Triton X-100），然后每1 mL裂解液中加入2.3 mL 50 mM Tris（pH = 7.4），将NaCl浓度调整至150 mM，再进行链霉亲和素偶联磁珠的结合。 
		重要提示： 较高的盐浓度通常会导致与磁珠的结合效率显著降低。</li>
		<li>将调整后的裂解液分装至1.5 mL离心管中（ca. 1.1 mL 分装至三支离心管中，于16,000 x g，10 分钟，4°C。</li>
		<li>转移上清液（ca将3.2 mL加入15 mL离心管中，并保留50–100 μL作为INPUT样品。</li>
		<li>使用Bradford法测定每个样品的浓度，并采用含有3至3.5 mg蛋白含量的等量样品进行链霉亲和素pull-down实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>链霉亲和素下拉 
	注意：下图展示了下拉实验步骤的概览 图4与Roux及其同事发表的原始方案几乎完全相同2首次进行下拉实验时，可留取流穿液及洗涤液1–4的样品用于Western blot分析，以确认实验操作是否成功图5).
	<ol>
		<li>每种条件下，将200 μL链霉亲和素偶联磁珠悬液转移至1.5 mL离心管中。将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠吸附至管壁一侧（ca1 分钟）并移除保存缓冲液。</li>
		<li>用平衡缓冲液（50 mM Tris pH 7–4，150 mM NaCl，0.05% Triton X-100 和 1 mM DTT）轻轻混悬珠子进行洗涤。</li>
		<li>将平衡后的磁珠等量分装至所需数量的离心管中（通常当起始蛋白含量为3–3.5 mg时，每种条件的裂解液可分装至两到四个1.5 mL离心管中），然后重新置于磁力架上。</li>
		<li>去除平衡缓冲液，将每组珠子与步骤4.4.7中对应的等量细胞裂解液重悬。在4 °C旋转摇床上孵育过夜。</li>
		<li>第二天，将1.5 mL离心管置于磁力架上，待磁珠吸附至管壁后，将上清液转移至标记为“流穿液”的15 mL离心管中。 
		注意：此后所有步骤均在室温下进行，除非另有说明。</li>
		<li>将各管中的磁珠用200 μL洗涤缓冲液1（含2% SDS的水溶液）重悬，并将对应于同一条件的各组重悬磁珠合并至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>在旋转轮上用 1 mL 洗涤缓冲液 1 洗涤珠子，每次 8 分钟，重复两次。</li>
		<li>用1 mL洗涤缓冲液2（50 mM HEPES pH 7.4、1 mM EDTA、500 mM NaCl、1% Triton X-100和0.1% Na-脱氧胆酸盐）在旋转轮上洗涤珠子，每次8分钟，共洗涤两次。</li>
		<li>用1 mL洗涤缓冲液3（10 mM Tris pH 8、250 mM LiCl、1 mM EDTA、0.5% NP-40和0.5%脱氧胆酸钠）在旋转轮上洗涤磁珠，每次8分钟，共洗涤两次。</li>
		<li>用1 mL洗涤缓冲液4（50 mM Tris pH 7.4，50 mM NaCl，0.1% NP-40）在旋转轮上洗涤磁珠，每次8分钟，共洗涤两次。</li>
		<li>为确保在最后一次洗涤步骤后完全去除洗涤缓冲液，先移除大部分上清液，然后离心样品。将样品放回磁力架上，待磁珠吸附至管壁后，再移除残留的缓冲液。</li>
		<li>向珠子中加入 30 μL 洗脱缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，2% SDS，5% β-巯基乙醇，2 mM Biotin）。在 98 °C 下孵育 15 分钟，然后立即置于磁力架上分离珠子。</li>
		<li>将洗脱的样品转移至新离心管中，于 -20 °C 保存，待进一步处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS-PAGE 和蛋白质印迹法 
	注意：在进行质谱分析之前，建议通过SDS-PAGE和Western blot检测生物素标记及拉下实验的成功与否。若未观察到生物素标记条带，可能的原因包括培养基中未添加多西环素（dox）或生物素，或其中一种储存液已失效。
	<ol>
		<li>为每个上样样品，取等量的蛋白样品与适量的3x SDS上样缓冲液混合，总体积为28 μL，制备PAGE上样样品。取每个洗脱样品5 µL与2.5 µL的3x SDS上样缓冲液混合，制备PAGE上样样品。</li>
		<li>将样品加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶中（上样量：输入样品每孔25 µL，洗脱样品每孔7 µL）。随后按照第3.4节所述进行电泳和蛋白质印迹分析。</li>
		<li>如果首次进行下拉实验，需为下拉过程的每一步（Input、流穿液、洗涤1–4、洗脱液）制备PAGE样品：取每步样品（Input、流穿液、洗涤1–4）各20 µL，与10 µL 3x SDS上样缓冲液混合；取洗脱液5 µL与2.5 µL 3x SDS上样缓冲液混合，随后按步骤4.6.4进行操作。图5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于质谱分析的SDS-PAGE 
	注意：为尽量减少角蛋白污染的可能性，可使用预制胶和商用上样缓冲液。
	<ol>
		<li>向每份18.75 μL的洗脱样品中加入6.25 μL 4x上样缓冲液，在4–20%预制SDS凝胶上电泳，使样品在凝胶中迁移2–3 cm。</li>
		<li>用胶体考马斯亮蓝G250染色液对凝胶进行染色13 在15 cm的培养皿中。</li>
		<li>使用洁净的手术刀切除每个样本的整条泳道，但需排除链霉亲和素条带（位于约 17 kDa 处， 图6），并将切下的条带转移至1.5 mL离心管中。</li>
		<li>将这些样本送至蛋白质组学平台进行进一步分析。 
		注意：典型的质谱结果可参见参考文献9（图3 和 图7，以及补充表格）。完整数据集可获取于PRIDE数据库（登录号PXD005005）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了如何将目的基因克隆至分裂型BioID质粒中，如何检测相互作用诱导的生物素标记，以及如何分离生物素标记的蛋白质用于质谱分析。本文所述方法基于瞬时转染。尽管融合蛋白的表达水平可通过培养基中添加的多西环素（dox）的量进行调节，但瞬时转染可能导致蛋白表达不均一，部分细胞中融合蛋白的表达量显著高于其内源对应蛋白。这可能导致相应的相互作用组发生畸变，并产生不能真实反映内源蛋白间相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。因此，在瞬时表达系统中验证分裂型BioID方法后，通常建议构建稳定细胞系。这些质粒兼容Flp介导的重组系统，并使两个目的基因均处于同一四环素响应元件的调控之下。在需要时，结合适用的哺乳动物细胞，可便捷地构建稳定的可诱导细胞系。例如，我们使用HeLa-EM2-11细胞系，该细胞系表达rtTA四环素激活型转录激活因子，并含有一个独特的可靶向基因组位点，可实现四环素介导的基因表达的严格调控12。利用该细胞系及Flp介导的重组技术，可在两到三周内获得仅含单拷贝转基因的稳定细胞系。此外，也可采用现有的基因组编辑技术，将BirA*片段插入目的基因的天然基因组位点中。
与任何依赖蛋白标记的实验一样，需要考虑所获得的融合蛋白是否具有功能。已有数据表明，当目标蛋白被标记（例如用GFP进行成像研究）并经过功能验证时，这些信息有助于决定BirA*片段应克隆至目标基因的上游还是下游。如果缺乏此类数据，则应在功能实验中测试N端或C端标记的蛋白。例如，可在内源蛋白已被敲除的细胞系中检测融合蛋白的活性，并与野生型情况相比较。如果目标蛋白能够耐受N端和C端标记，则应同时测试两种形式。事实上，在BioID实验中，融合蛋白的方向可能会影响标记效率22。此外，我们观察到，在将split-BioID应用于一对蛋白时，将其中哪一个蛋白连接至NBirA*或CBirA*片段也会影响标记效率9。在split-BioID质粒中，用于连接目标蛋白与BirA*片段的是一段16个氨基酸长度、富含甘氨酸/丝氨酸的接头序列，该序列源自另一种蛋白互补分析系统（PCA）23，并且在我们迄今测试的所有相互作用蛋白中均有效。然而，也应考虑到某些蛋白对可能在使用更短或更长接头时效果更佳。最后值得一提的是，Bollen研究组曾报道了另一种split-BioID策略24，其BirA*的切割位点位于E140/Q141，不同于我们的E256/G257。我们对这两种split-BioID策略进行了并行测试，结果发现本方案中描述的E256/G257切割位点在与两个相互作用蛋白连接时能产生更强的重新激活信号9。
该方法的一个普遍缺点是标记速度较慢。通常需要6至24小时的生物素孵育时间才能获得可检测的生物素化水平6，这限制了该技术在研究蛋白质复合物动态重塑过程中的应用。尽管该检测方法在一定程度上缓解了这一局限性，因为它仅在两种蛋白质相互作用时才被激活，但其标记速度仍然过慢，无法用于研究对高度动态过程的响应或分析短寿命蛋白质。已知工程化过氧化物酶APEX2可在1分钟内高效标记邻近蛋白质3。因此，基于APEX2的蛋白质互补分析（PCA）可能克服BioID衍生检测技术中标记速度慢的局限性。已有研究报道了一种分裂型APEX2检测方法的原理验证实验25。然而，尽管已成功实现了同源二聚化蛋白质的生物素化，但该检测方法是否也可用于标记并鉴定围绕一对相互作用蛋白组装的其他蛋白质，仍有待证实。最近，通过定向进化技术开发出TurboID和miniTurbo两种BirA*的高活性变体，可将标记时间显著缩短至10分钟26。将分裂型BioID技术适配于这些新变体，将进一步拓展该技术的应用范围。

由于大多数细胞功能是由动态组装成大分子复合物的蛋白质来执行的，因此鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）是生物医学研究中的一个重要任务。事实上，PPI 在疾病中常常发生失调，并可作为治疗干预的潜在靶点1。目前用于鉴定 PPI 最广泛使用的方法是亲和纯化（AP）技术，该方法在细胞裂解后，将目标蛋白特异性地在固相基质上进行纯化，随后通过质谱法（MS）鉴定与其结合的蛋白质。尽管 AP-MS 是一种强大的方法，但它通常难以有效分析溶解性差的蛋白复合物、极为短暂的相互作用，或依赖完整亚细胞结构的 PPI。此外，由于 PPI 网络具有动态特性，单个蛋白质往往参与多个不同的蛋白复合物，这使得数据的解读变得复杂。 
近年来开发了邻近标记技术（如 BioID2 或 APEX23,4），以解决 AP-MS 方法的一些局限性。在 BioID 中，酶 BirA*（对应于野生型 E. coli 酶的 G115R 变体）催化生成不稳定的生物素化 AMP（bio-AMP），后者可与伯胺发生反应。与将 bio-AMP 保留在活性中心的野生型酶不同，BirA* 会释放 bio-AMP，使其扩散至周围环境。因此，当 BirA* 与目标蛋白融合并在细胞中表达时，可在约 10 nm 的估计范围内对邻近蛋白进行生物素标记5。这些被标记的邻近蛋白随后通过链霉亲和素下拉法富集，并通过质谱（MS）进行鉴定。与 AP-MS 不同，BioID 需要表达融合蛋白，因此仅适用于那些功能不受标签影响的蛋白。此外，标记速度较慢，通常需要 6–24 小时2,6，这使得短寿命蛋白的检测具有挑战性。然而，与 AP-MS 相比，BioID-MS 具有若干关键优势：第一，它可在天然细胞环境中捕获相互作用；第二，在细胞裂解后分离的是被标记的蛋白而非完整的复合物；第三，链霉亲和素下拉法允许使用变性缓冲液和严格的洗涤条件。因此，该方法在检测瞬时或弱相互作用7，以及发生在特定且难以分离的亚细胞结构上的相互作用方面更为敏感8。
然而，大多数蛋白质通常都是较大复合物的一部分，这些复合物可根据细胞信号或所需执行的功能发生重塑。因此，单个蛋白质通常参与多个不同的复合物，对应于不同的功能单元，并涉及不同和/或重叠的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。上述两种方法均可提供特定蛋白质可能具有的所有关联的总体概况，但无法解析单个PPI的具体生物学背景。为了提高对后者的研究分辨率，我们设计了一种蛋白质片段互补实验（protein-fragment complementation assay, PCA），其中BirA*的两个无活性片段（包含催化结构域的NBirA*和可视为再激活结构域的CBirA*）在两个相互作用的蛋白质将其拉近时，能够重新组装成具有活性的酶9。由此建立的分裂BioID（split-BioID）实验可将依赖于邻近关系的生物素标记特异性地聚焦于围绕一对相互作用蛋白组装的蛋白群，从而实现对依赖于特定生物学背景的蛋白质复合物的鉴定。我们近期通过split-BioID成功解析了参与miRNA介导的基因沉默通路的两个 distinct 蛋白质复合物，展示了该方法卓越的分辨率9。
总之，通过一种单一且简单的检测方法，分裂型BioID能够在已知某个蛋白质复合物中存在另一个相互作用蛋白的前提下，发现并特异性地将蛋白质相互作用（PPI）分配到该蛋白质所参与的特定功能单元中。

<table><tbody><tr><td>冰醋酸</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td>用于配制TAE缓冲液</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>用于DNA分析和提取的TAE-琼脂糖凝胶</td></tr><tr><td>25%氨水溶液 NH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Bernd Kraft</td><td>6012</td><td>用于溶解生物素</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td>用于筛选转化细菌</td></tr><tr><td>Bioruptor plus 超声破碎仪</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>其他超声破碎设备也可使用</td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>需添加至培养基中以促进高效生物素化</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分</td><td>Carl Roth</td><td>8076</td><td>用于Western blot缓冲液，以及Bradford法测定蛋白时作为蛋白标准品</td></tr><tr><td>Bradford Ultra 试剂</td><td>Expedeon</td><td>BFU05L</td><td>其他蛋白定量方法或试剂盒亦可使用；该试剂相较于其他Bradford试剂对去垢剂耐受性更高</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>TPP</td><td>99002</td><td>其他型号亦可使用</td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197</td><td>用于将目的片段克隆至分裂型BioID质粒（NBirA*融合）的限制性内切酶</td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td>若使用其他细胞系，请使用相应的最佳生长培养基</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Sigma</td><td>PLN350</td><td>其他试剂盒亦可使用</td></tr><tr><td>强力霉素</td><td>Applichem</td><td>A2951</td><td>强力霉素对光敏感</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Applichem</td><td>A2948</td><td>配制1M储存液，-20 &amp;deg;C保存，使用时务必新鲜配制</td></tr><tr><td>DyLight 680标记的链霉亲和素</td><td>Thermo scientific</td><td>21848</td><td>与LiCor Western blot扫描仪配合使用</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>C1磁珠未包被BSA，适用于后续质谱分析（最终洗脱液中无BSA渗漏）</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A5097</td><td>配制500 mM储存液，溶解EDTA粉末时调节pH至8</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>32205</td><td>配制70%储存液，用于溶解浓度为10 mg·mL&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;的强力霉素</td></tr><tr><td>Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91302</td><td>其他试剂盒亦可使用</td></tr><tr><td>37%盐酸</td><td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td>用于调节生物素储存液的pH</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763</td><td>配制500 mM储存液，调节pH至7.4</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF膜，0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>该膜在与LiCor Western blot扫描仪联用时自发荧光背景极低</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Gr&amp;uuml;ssing GmbH</td><td>12083</td><td>配制5M储存液</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 成像系统</td><td>LI-COR</td><td>N/A</td><td>用于扫描经荧光标记抗体孵育的Western blot膜</td></tr><tr><td>线性聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td>其他转染试剂亦可使用</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Carl Roth</td><td>T145</td><td>用于封闭Western blot膜</td></tr><tr><td>MluI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3198</td><td>用于将目的片段克隆至分裂型BioID质粒（NBirA*融合）的限制性内切酶</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>配制10%（w/v）储存液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>配制5M储存液</td></tr><tr><td>NP-40（Nonidet P40替代物）</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td>配制20%（v/v）储存液</td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td>用于将目的片段克隆至分裂型BioID质粒（CBirA*融合）的限制性内切酶</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>806552</td><td>刮取细胞前用于洗涤细胞</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560</td><td>用于将目的片段克隆至分裂型BioID质粒（CBirA*融合）的限制性内切酶</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>加入裂解缓冲液中以防止蛋白质降解</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90003</td><td>分裂型BioID质粒，介导NBirA*-FKBP与CBirA*-FRB的共表达；FKBP和FRB可被另外两个ORF替换</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90004</td><td>分裂型BioID质粒，介导FKBP-NBirA*与CBirA*-FRB的共表达；FKBP和FRB可被另外两个ORF替换</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgene</td><td>90008</td><td>分裂型BioID质粒，介导NBirA*-FKBP与FRB-CBirA*的共表达；FKBP和FRB可被另外两个ORF替换</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90009</td><td>分裂型BioID质粒，介导FKBP-NBirA*与FRB-CBirA*的共表达；FKBP和FRB可被另外两个ORF替换</td></tr><tr><td>Q5 高保真PCR试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E0555S</td><td>用于扩增待测蛋白的ORF编码序列；其他耐热DNA聚合酶亦可使用</td></tr><tr><td>快速连接试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>用于将DNA片段连接至分裂型BioID质粒；其他DNA连接系统亦可使用</td></tr><tr><td>RunBlue 4-20% SDS预制胶</td><td>Expedeon</td><td>BCG42012</td><td>用于质谱分析样品的电泳</td></tr><tr><td>RunBlue LDS上样缓冲液</td><td>Expedeon</td><td>NXB31010</td><td>RunBlue预制胶的运行缓冲液</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>以20%储存液形式提供</td></tr><tr><td>无四环素血清</td><td>Biowest</td><td>S181T</td><td>我们使用无四环素血清以最小化融合蛋白的基础表达</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 转膜系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1704150</td><td>高速Western blot转膜系统，其他转膜系统亦可使用</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth</td><td>4855</td><td>配制1M储存液，调节至适当pH值（7.4和8）</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975</td><td>配制20%（v/v）储存液</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127</td><td>用于Western blot缓冲液；Tween 20会导致较高的背景荧光，因此在封闭步骤和最后洗涤步骤中应省略</td></tr></tbody></table>

分裂型bioid——在天然细胞环境中对特定情境下蛋白质复合物的蛋白质组学分析

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

为了补充现有的亲和纯化（AP）方法用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），研究人员引入了可在活细胞中实现邻近依赖性蛋白质标记的酶。其中一种酶为BirA*（用于BioID方法），可介导约10 nm范围内蛋白质的生物素化。因此，当该酶与目标蛋白融合并在细胞中表达时，能够在天然环境中对邻近的蛋白质进行标记。与依赖于完整蛋白复合物纯化的AP方法不同，BioID可在细胞内对曾经接近目标蛋白的蛋白质进行标记，无论在分离时这些蛋白是否仍与目标蛋白相互作用。由于其可对邻近蛋白进行生物素化标记，因此还可利用链霉亲和素对生物素的极高亲和力，高效地分离这些被标记的蛋白。尽管BioID在鉴定瞬时或弱相互作用方面优于AP，但AP和BioID结合质谱分析的方法均仅能提供某一特定蛋白可能参与的所有相互作用的总体概况，而无法揭示每个已鉴定PPI所处的具体生物学背景。事实上，大多数蛋白质通常参与多个不同的复合物，对应于不同的成熟阶段或功能单元。为克服这两种方法的共性局限，我们设计了一种基于BirA*酶的蛋白片段互补检测法。在该检测体系中，两个无活性的BirA*片段在分别与两个相互作用的蛋白融合后，当这两个蛋白发生相互作用而彼此靠近时，可重新组装形成有活性的酶。由此建立的分裂-BioID（split-BioID）检测法因而能够特异性地标记围绕在一对相互作用蛋白周围形成的蛋白群。只要这两个蛋白仅在特定背景下发生相互作用，split-BioID即可用于在天然细胞环境中分析特定情境依赖性的功能单元。本文中，我们提供了一套逐步操作的实验方案，用于测试并应用split-BioID于一对已知相互作用的蛋白质。

为了说明该方法的工作原理，将参与miRNA介导的基因沉默通路的Ago2、TNRC6C和Dicer蛋白的开放阅读框（ORFs）克隆至分裂型BioID质粒中。已知Ago2在miRNA诱导的沉默复合物（miRISC）中与TNRC6C相互作用，该复合物可抑制翻译并促进靶标mRNA的降解14。在miRISC组装之前，Ago2会与Dicer相互作用，Dicer是生成成熟miRNA的酶，二者可在某一复合物中结合，使Ago2装载miRNA15。因此，将分裂型BioID分别应用于Ago2/Dicer组合或Ago2/TNRC6C组合。对于每一对被检测的蛋白，利用分裂型BioID质粒将Ago2与NBirA*或CBirA*融合（图2），并将Dicer和TNRC6C分别与对应的BirA*互补片段融合。此外，每种蛋白还与CBirA*融合，并与NBirA*-GFP融合蛋白配对作为阴性对照。由此，每对被检测蛋白共进行四次重复实验（表1）。
为了检测分裂型BioID在待测蛋白对相互作用时是否被激活，我们遵循图1所示的实验方案。将质粒瞬时转染至一种适用于四环素系统（tet-system）的HeLa细胞系中。通过多西环素（dox）诱导融合蛋白的表达，并在培养基中添加过量生物素以启动生物素标记。在含dox和生物素的条件下孵育20小时后，裂解细胞，并使用偶联链霉亲和素通过Western blot检测生物素化蛋白。在哺乳动物细胞中，未转染样本中通常可检测到两个主要条带（图3，星号标记），这些条带对应于内源性生物素化蛋白（极可能是线粒体羧化酶）。这两个条带在所有样本中均存在，可作为理想的内参对照，因此无需再检测管家蛋白以确认各泳道上样量一致。在典型的BioID/分裂型BioID实验中，还可观察到额外的主要条带，即发生自生物素化的融合蛋白。即使未见其他生物素化蛋白，此阶段检测到融合蛋白的生物素化已足以表明两种待测蛋白在细胞内发生了相互作用。图3所示实验结果表明，将NBirA*-Ago2融合蛋白与分别连接CBirA*的TNRC6C或Dicer融合蛋白配对时，其激活效率高于反向组合（即CBirA*-Ago2与另两种蛋白的NBirA*融合蛋白配对）（图3，上层面板，比较第2-3泳道与第6-7泳道条带强度）。此外，该激活具有特异性，因为任一CBirA*融合蛋白均未能显著激活NBirA*-GFP对照融合蛋白（图3，比较第1、4-5泳道与对应未转染细胞的第8泳道）。由于本研究所用质粒中，NBirA*带有myc标签，CBirA*带有FLAG标签（图2），因此可通过针对这两种标签的抗体分别分析各融合蛋白的表达水平（图3，下层面板）。
当观察到相互作用诱导的生物素化时，可扩大实验规模，并按照方案第4段所述，使用链霉亲和素偶联的磁珠分离生物素化蛋白（图4）。首次进行分离时，可对纯化过程中的所有步骤进行蛋白质印迹分析（图5）。通常，蛋白与磁珠的结合应接近定量，洗涤过程中几乎不应有蛋白泄漏。在将样品送入质谱分析之前，建议先进行蛋白质印迹检测，以确认诱导的生物素化按预期发生，并验证融合蛋白是否表达。若融合蛋白未表达，可能是由于转染效率低或强力霉素（dox）诱导失败所致。若融合蛋白已表达但未观察到生物素化，应检查培养基中是否确实添加了足量生物素（50 μM），并确认生物素储备液仍具活性。当对洗脱样品进行考马斯亮蓝染色的蛋白凝胶分析时（图6），通常可见一条约17 kDa的最强条带，对应单体链霉亲和素。此外，也可能观察到内源性生物素化蛋白及融合蛋白对应的条带。我们通常切取样品泳道中链霉亲和素条带以上至加样孔的区域（图6），将切下的凝胶条带置于1.5 mL离心管中，送至质谱分析平台。或者，也可将结合在链霉亲和素磁珠上的蛋白直接进行胰蛋白酶消化，并将消化后的肽段从柱上洗脱。我们常规使用 MaxQuant 软件16（主要采用默认参数，并将赖氨酸生物素化设为可能的翻译后修饰，详见参考文献9中的方法及典型质谱结果）分析质谱原始数据，并使用 Perseus 套件17进行后续统计分析，两者均为免费软件。样品通常设置三个生物学重复。采用无标记定量方法，可识别出在对照条件下特异性富集的蛋白。为排除内源性生物素化蛋白以及被BirA*酶非特异性标记的蛋白，我们仅考虑在六组无关蛋白产生的六套对照数据集中显著富集的蛋白。此外，我们还仅保留那些在split-BioID对照实验中富集的蛋白，该对照实验中将NBirA*融合蛋白替换为NBirA*-GFP。已有其他数据分析策略被提出，特别是利用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）进行定量蛋白质组学分析18。此外，已有多种方法被用于直接分离生物素化肽段，例如使用对生物素亲和力减弱的链霉亲和素变体18、采用有机溶剂的特殊洗脱条件19，或使用特异性识别生物素的抗体20,21。尽管这些方法未必能发现更多蛋白，但鉴定出生物素化位点可增强对相互作用特异性的置信度，在研究相互作用拓扑结构时尤为有用。
<img alt="通过分裂BioID和质谱分析对复合物A进行蛋白质组学分析的蛋白质组学工作流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：分裂BioID实验流程概览。 蛋白质1可作为复合物A的一部分与蛋白质2相互作用，或作为复合物B的一部分与蛋白质3相互作用。为了特异性地探究复合物A的组成，可对蛋白质1和蛋白质2应用分裂BioID技术。质谱仪的照片采用知识共享署名-相同方式共享3.0未本地化许可协议，并从https://commons.wikimedia.org下载，文件名为ThermoScientificOrbitrapElite.JPG。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑质粒图谱：载体图中显示 NBirA、FKBP、CBirA、FRB 序列及限制性酶切位点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：分裂型 BioID 质粒的表达盒。 我们提供了四种质粒，可用于测试 NBirA* 与 CBirA* 融合蛋白的所有组合。这些质粒及其完整图谱可通过 Addgene.org 网站获取，对应编号已在图中标明。这些质粒含有四环素响应元件（7x tetO），需在与四环素表达系统兼容的细胞系中使用。此外，请注意所有质粒中，FKBP 和 FRB 的开放阅读框（ORF）分别与 NBirA* 和 CBirA* 片段融合。这两种蛋白仅在雷帕霉素存在时发生相互作用，因此这些质粒可用于快速检测在有或无该化学物质条件下系统的功能9。图中标明的限制性酶切位点均为唯一酶切位点。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="使用SDS-PAGE进行蛋白质相互作用分析；标记为Dicer、TNRC6C、Ago2的条带；链霉亲和素检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：split-BioID实验的典型Western印迹结果。 上图：使用荧光标记的链霉亲和素检测生物素化蛋白。下图：使用抗Myc和抗FLAG抗体检测融合蛋白。共测试了两对蛋白质：Ago2/TNRC6C和Ago2/Dicer。在第2和第3泳道中，Ago2与CBirA*片段融合；在第6和第7泳道中，Ago2与NBirA*片段融合。当任一三种蛋白与NBirA*-GFP组合时（第1、4–5泳道），均未观察到显著信号。星号标记的条带代表内源性生物素化蛋白，可作为上样量的内部对照。本图改编自Schopp et al.9的图5B，遵循Creative Commons Attribution 4.0 International许可协议。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生物素纯化示意图：细胞收获、裂解、磁珠结合、洗涤、SDS-PAGE 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：链霉亲和素下拉实验流程概览。 图示用于质谱分析的生物素化蛋白分离主要步骤。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="链霉亲和素偶联的蛋白质印迹分析、蛋白质纯化、电泳结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：链霉亲和素下拉实验的典型蛋白质印迹结果。 将各指定样品等体积上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶。经蛋白质印迹后，使用HRP偶联的链霉亲和素检测生物素标记的蛋白质。图中已标出对应于NBirA*-TNRC6C和CBirA*-Ago2的条带。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SDS-PAGE 凝胶电泳图；蛋白质分离；Split-BioID，NBirA*-TNRC6C，生物素-链霉亲和素。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：用于质谱分析的典型考马斯亮蓝染色蛋白质凝胶。 从链霉亲和素偶联磁珠洗脱的样品被加载至预制蛋白凝胶，并电泳至样品迁移约 2–3 cm。在约 17 kDa 处可见的主要条带为链霉亲和素。将该条带正上方区域切下，并送至质谱分析机构。图中已标示出对应于 NBirA*-TNRC6C 和 CBirA*-Ago2 的条带。<a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>转染样本</td>
			<td colspan="3">检测条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA*-protein1/CBirA*-protein2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA*-protein1/NBirA*-protein2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA*-GFP/CBirA*-protein1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA*-GFP/CBirA*-protein2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="3">未转染</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：对两种蛋白质应用分裂BioID时通常测试的条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>测序引物</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>载体1反向引物（CBirA*融合）</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>载体2反向引物（NBirA*融合）</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：分裂型BioID质粒的测序引物。

我们提供一种基于邻近标记技术BioID的蛋白片段互补实验——split-BioID的逐步操作方案。该方法在两个特定蛋白相互作用时被激活，可在天然细胞环境中实现对依赖于特定条件的蛋白复合物进行蛋白质组学分析。该方法操作简便、成本低廉，仅需常规实验室设备即可完成。

分裂型BioID——在天然细胞环境中对特定情境下蛋白质复合物的蛋白质组学分析

为了补充现有的亲和纯化（AP）方法以鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），已引入酶学手段……

本实验的总体目标是利用分裂型BioID（split-BioID）技术，研究在一对特定相互作用的目标蛋白周围组装形成的蛋白质复合物的组成。分裂型BioID是一种蛋白质片段互补检测方法，可在活细胞内诱导依赖于邻近关系的蛋白质生物素标记。该方法有助于回答细胞生物学中的关键问题，例如蛋白质复合物如何动态重塑以调控不同的细胞功能。该技术的主要优势在于，能够在天然细胞环境中以极高的分辨率，简便地鉴定出具有特定生物学背景的蛋白质复合物。进行最终的质谱分析时，以下步骤需在无角蛋白条件下操作，所有材料和试剂应尽可能无角蛋白。将两个目的蛋白的ORF克隆至分裂型BioID质粒中，按照文本方案进行瞬时转染并加入含生物素的培养基后，用PBS洗涤细胞两次。每孔加入1.5毫升PBS，用细胞刮刀收集细胞，然后将每种条件下的细胞分别转移至独立的15毫升离心管中，在4摄氏度、1,200 ×g 条件下离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀物在液氮中速冻。随后将试管置于负80摄氏度保存，直至进一步处理。制备细胞裂解液时，使用1毫升室温裂解缓冲液重悬沉淀物。然后用25号针头将细胞反复吹打10至20次。接着对样品进行超声处理。然后每900 µL收集的超声裂解液中加入100 µL 20% Triton X-100，使终浓度为2%。每毫升裂解液中加入2.3 mL 50 mmol/L Tris（pH 7.4），以调节NaCl浓度至150 mmol/L，用于与链霉亲和素磁珠结合。然后将调整后的裂解液分装至1.5毫升离心管中，在4°C条件下以16,000 × g离心10分钟。将上清液转移至15毫升离心管中，并保留50至100微升作为输入样品。进行链霉亲和素pull-down实验时，每种条件下将200微升链霉亲和素偶联磁珠悬浮液转移至1.5毫升离心管中。将离心管置于磁力架上，静置约一分钟，然后移除保存缓冲液。用一毫升平衡缓冲液轻轻混匀以洗涤磁珠。随后将平衡后的磁珠均匀分装至所需数量的离心管中，并重新放回磁力架上。除去平衡缓冲液后，将每组磁珠用等量的相应细胞裂解液重悬。然后在4°C条件下于旋转仪上孵育样品过夜。次日，将离心管置于磁力架上。等待磁珠吸附到管壁一侧后，将上清液转移至标记为“流穿液”的15毫升离心管中。用200微升洗涤缓冲液一重悬各管中的磁珠，并将对应同一条件的磁珠悬液合并至1.5毫升离心管中。用1毫升洗涤缓冲液一在旋转仪上洗涤磁珠两次，每次8分钟。然后分别用洗涤缓冲液二、三和四各洗涤两次。为确保最后一次洗涤后完全去除洗涤缓冲液，在移除大部分上清液后，将样品离心沉淀。随后将样品放回磁力架上，去除残留的缓冲液。向珠子中加入30 µL洗脱缓冲液，然后将样品在98 °C孵育15分钟，并立即将试管转移至磁力架上。将洗脱的样品转移至新的离心管中，并在-20 °C保存，直至后续处理。对于每个输入样品，通过将等量蛋白质与适当体积的3X SDS上样缓冲液混合，制备总体积为28 µL的PAGE样品。然后，将每个洗脱样品的5微升与2.5微升3X SDS上样缓冲液混合，制备PAGE样品。将样品上样至SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，随后按照文本方案进行电泳和蛋白质印迹分析。为进行质谱分析的SDS-PAGE，向每份18.75微升的洗脱样品中加入6.25微升4X上样缓冲液，并将样品上样至4%至20%预制SDS凝胶中，电泳至样品进入凝胶2至3厘米处。在15厘米的培养皿中，使用胶体考马斯亮蓝G250染色液对凝胶进行染色。使用洁净的手术刀切下每个样品的整条泳道（排除链霉亲和素条带），并将切下的条带转移至1.5毫升离心管中用于质谱分析。除了在 BioID 或 split-BioID 实验中鉴定出的内源性生物素化蛋白外，通过 Western 印迹检测到的其他主要条带是发生自生物素化的融合蛋白，这表明在此示例中，Ago2 与 TNRC6C 或 Ago2 与 Dicer 这两对被检测蛋白在细胞内发生了相互作用。此外，Western 印迹结果还表明，将 NBirA*Ago2 融合蛋白与 CBirA*TNRC6C 或 CBirA*Dicer 融合蛋白配对，比相反组合（即 CBirA*Ago2 与 NBirA*TNRC6C 或 NBirA*Dicer 配对）更为高效。此外，该激活具有特异性，因为任何 CBirA* 融合蛋白均无法将 NBirA*GFP 对照融合蛋白显著激活。 首次进行分离操作时，应通过蛋白质印迹法分析纯化的所有步骤。如图所示，目标蛋白与磁珠的结合应接近定量，且在洗涤步骤中几乎不应观察到穿透现象。在蛋白表达并诱导生物素化后，将洗脱产物上样至考马斯亮蓝染色凝胶进行电泳，所观察到的最强条带大小约为17千道尔顿，对应于单体链霉亲和素。通常将链霉亲和素条带至加样孔之间样品泳道的区域切下，用于质谱分析。在将该方法应用于两种特定蛋白质时，重要的是要测试不同组合的融合蛋白。我们经常观察到，整体生物素化效率在很大程度上取决于哪种蛋白质连接至N端或C端BirA片段。同样重要的是，在分裂型BioID实验中至少加入一个阴性对照。例如，使用一对与目标蛋白对无关的相互作用蛋白进行实验。在完成本实验步骤及质谱分析后，应通过计算分析将鉴定出的肽段与阴性对照实验进行比对评分。例如，我们使用由德国慕尼黑的 Cox 和 Mann 实验室开发的 MaxQuant 和 Perseus 软件。

split-bioid-proteomic-analysis-context-specific-protein-complexes

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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