BioID 细胞环境中特异蛋白复合物的分离-蛋白质组学分析

该程序的总体目标是使用 split-BioID 探测特异性组装在一对相互作用的目标蛋白质周围的蛋白质复合物的组成，split-BioID 是一种蛋白质片段互补测定法，可在活细胞内诱导邻近依赖性蛋白质生物素化。这种方法可以帮助回答细胞生物学中的关键问题，例如蛋白质复合物如何动态重塑以调节不同的细胞功能。该技术的主要优点是，它允许在其天然细胞环境中轻松识别环境特异性蛋白质复合物，并且具有非常高的分辨率。

对于最终的质谱分析，以下步骤应在无角蛋白的条件下进行，并且所有材料和试剂应尽可能不含角蛋白。将两种目标蛋白质的 ORF 克隆到分裂的 BioID 质粒中后，进行瞬时转染，然后根据文本方案添加补充生物素的培养基，使用 PBS 洗涤细胞两次。向每个板中加入 1.5 毫升 PBS，使用刮刀收获细胞，然后将每种条件的细胞转移到单独的 15 毫升试管中，并在 1， 200 倍重力和 4 摄氏度下旋转试管 5 分钟。

去除上清液，在液氮中快速冷冻沉淀。然后将试管存放在零下 80 摄氏度，直到进一步加工。要制备细胞裂解物，请使用 1 毫升 RT 裂解缓冲液重悬沉淀物。

然后将细胞通过 25 号针头 10 到 20 次。接下来对样品进行超声处理。然后每 900 微升回收的超声裂解物添加 100 微升 20% Triton X-100，终浓度为 2%每毫升裂解物加入 2.3 毫升 50 毫摩尔 Tris，pH 7.4，将 NaCl 浓度调节至 150 毫摩尔，以便与链霉亲和素珠结合。

然后将调整后的裂解物分配到 1.5 毫升试管中，并在 16， 000 倍重力和 4 摄氏度下离心 10 分钟。将上清液转移到 15 毫升试管中，保留 50 至 100 微升作为输入材料。为了进行链霉亲和素下拉，对于每种情况，将 200 μL 链霉亲和素偶联磁珠悬浮液转移到 1.5 mL 试管中。

将试管放在磁力架上，等待大约一分钟，然后取出储存缓冲液。用 1 mL 平衡缓冲液轻轻混合洗涤珠子。然后将平衡的珠子均匀地分配到必要数量的试管中，并将它们放回磁力架上。

去除平衡缓冲液后，用等量的相应细胞裂解物重悬每组珠子。然后将样品在 4 摄氏度下在旋转轮上孵育过夜。第二天，将试管放在磁力架上。

等到珠子粘在试管的侧面，然后将上清液转移到标记为流通的 15 毫升试管中。用 200 μL 洗涤缓冲液 1，将微珠重悬于每管中，并将对应于一种条件的每组重悬珠子混合在 1.5 mL 试管中。使用 1 毫升洗涤缓冲液 1 在旋转轮上洗涤珠子两次，每次 8 分钟。

然后对洗涤缓冲液 2、3 和 4 各进行两次洗涤。为确保在最后一个洗涤步骤后完全去除洗涤缓冲液，在去除大部分上清液后，将样品离心。然后将它们放回磁力架上并取出剩余的缓冲液。

向磁珠中加入 30 μL 洗脱缓冲液，然后在 98 摄氏度下孵育样品 15 分钟，并立即将试管移至磁力架上。将洗脱的样品转移到新试管中，并将试管储存在零下 20 摄氏度直至进一步处理。对于每个起始样品，将等量的蛋白质与适当体积的 3X SDS 上样缓冲液混合，总体积为 28 μL，制备 PAGE 样品。

然后，将每种洗脱样品的 5 μL 与 2.5 μL 的 3X SDS 上样缓冲液混合，制备 PAGE 样品。将样品加载到 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上。然后根据文本方案进行电泳和蛋白质印迹。

要进行 SDS-PAGE 进行 MS 分析，向每个洗脱样品的 18.75 μL 中加入 6.25 μL 的 4X 样品缓冲液，并在 4% 至 20% 的预制 SDS 凝胶上运行样品，直到它们迁移到凝胶中 2 至 3 cm。在 15 厘米的培养皿中，用胶体考马斯亮蓝 G250 染色剂对凝胶进行染色。使用干净的手术刀切除每个样品的整个泳道，不包括链霉亲和素条带，并将切除的条带转移到 1.5 毫升试管中进行 MS 分析。

除了在 BioID、分裂 BioID 实验中鉴定的内源性生物素化蛋白外，Western blot 观察到的其他主要条带是自生物素化的融合蛋白，这表明两种测试蛋白，在本例中为 Ago2 和 TNRC6C 或 Ago2 和 Dicer 在细胞中相互作用。此外，蛋白质印迹的结果表明，将 NBirA*Ago2 融合蛋白与 CBirA*融合与 TNRC6C 或 Dicer 配对比 CBirA*Ago2 与其他两种蛋白的 NBirA*融合配对更有效。此外，激活是特异性的，因为没有任何 CBirA*融合可以将 NBirA*GFP 对照融合蛋白激活到可观的水平。

首次进行分离时，应通过 western blotting 分析纯化的所有步骤。如此处所示，与磁珠的结合应该是几乎定量的，并且在洗涤中几乎不会观察到泄漏。当洗脱的材料在蛋白质表达和诱导生物素化后在考马斯染色凝胶上运行时，观察到的最强条带在约 17 道尔顿处运行，对应于单体链霉亲和素。

通常切除上样孔中链霉亲和素条带上方的样品泳道面积，用于 MS 分析。在将该程序应用于两种给定的蛋白质时，测试融合蛋白的不同组合非常重要。事实上，我们经常观察到，整体生物素化效率在很大程度上取决于附着在 N 或 C 末端 BirA 片段上的蛋白质。

添加至少一个阴性对照分裂 BioID 实验同样重要。例如，在一对与目标蛋白对无关的相互作用蛋白上。按照此程序和质谱法，应应用计算分析以根据阴性对照实验对鉴定的肽进行评分。

例如，我们使用由德国慕尼黑的 Cox 和 Mann 实验室开发的 MaxQuant 和 Perseus 软件。