蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

本实验的目的是鉴定大肠杆菌中天然MultiPro复合物的蛋白质、蛋白质相互作用及其亚基组成。首先扩增编码SPA标签和可筛选标记物的序列特异性线性PCR产物，利用细菌噬菌体λ重组系统，将这些产物整合并在ddy 3, 3 0遗传背景下以羧基末端融合形式表达；随后，采用伴刀豆球蛋白A（cow modlin）和抗Flag亲和磁珠进行两步法双重纯化，以高效回收丰度较低的蛋白质复合物。接着，用伴刀豆球蛋白A洗脱并收集结合的蛋白质，使用CEB（elution buffer）洗脱液洗脱，随后用胰蛋白酶消化，并通过质谱分析进行蛋白质鉴定。

实验结果表明，核心RNA聚合酶的多个亚基，包括转录终止因子和抗决定因子，能够与带有标签的RNA聚合酶亚基D蛋白高效共纯化，表明利用该方法可有效鉴定新关联的组分。通常，初次接触该方法的研究人员可能在两轮亲和纯化步骤中遇到困难，其中必须使用适当的缓冲液小心处理细胞裂解物，以确保从大规模培养物中高效回收丰度较低和较高的结合复合物。亲和纯化与质谱分析操作流程将由本实验室的两名技术人员Olga Kagan和HBO guo进行示范。本实验方案首先针对DDY three 30菌株中的特定扩增序列进行操作，该菌株可表达Lambda red重组系统，具体操作如书面方案所述。

接下来，将表达噬菌体 Lambda 重组系统的细菌菌株在 32 摄氏度、180 RPM 振荡条件下，于 2 毫升 LB 培养基（Luria broth 或 LB 培养基）中过夜培养。次日，将 1 毫升过夜培养物接种至装有 70 毫升新鲜 LB 培养基的 500 毫升锥形瓶中。在 32 摄氏度、180 RPM 振荡条件下培养，直至 OD600 达到约 0.8。随后将锥形瓶置于 42 摄氏度水浴中，以 180 RPM 轻柔振荡孵育 15 分钟，以诱导细胞表达。

诱导后立即在冰水浴中振荡孵育烧瓶至少30分钟。按照书面实验步骤收获并清洗细胞后，用700微升冰冻的无菌水重悬细胞沉淀，从而制备可用于电穿孔的电转感受态细胞。将1微升纯化的扩增产物加入40微升电转感受态细胞中。

同源重组与整合后，对细胞进行电穿孔。根据对卡那霉素的抗性筛选成功将标签-盒式结构重组至染色体的转化子。选取多个转化子进行蛋白质印迹分析，利用抗-Flag M2抗体（特异性识别SPA标签中的Flag表位）验证SPA标签融合蛋白的正确表达。将10毫升过夜培养物转移至含25微克/毫升卡那霉素的990毫升新鲜TB培养基中，置于4升锥形瓶中培养。

在32摄氏度、250 RPM持续振荡条件下培养菌液5至6小时，直至OD600达到2至3。将一升大肠杆菌SPA标签菌液转移至洁净的离心瓶中，在4摄氏度、3,993 ×g条件下离心15分钟。随后按照书面实验方案所述重新悬浮细胞。

将样品转移至置于冰上的无菌不锈钢杯中进行超声处理。将探头浸入样品，超声处理三分钟。超声处理后，将样品在冰上静置冷却两分钟，以防止离心过程中因过热导致样品损伤。

小心地将离心管中的上清液 S 转移至一个 50 毫升的聚丙烯方管中。使用液氮冷冻样品，并将超声处理后的冷冻细胞提取物在 -80 °C 条件下保存，最长可保存六个月，以备后续使用。开始对冷冻的超声细胞提取物进行亲和纯化时，将管置于冷水中，然后在 4 °C 条件下孵育 TH 细胞提取物，并加入 3 微升核酸酶苯甲（benzonase），孵育 30 分钟。

向此混合物中加入非离子型去污剂 Triton X-100 和 200 微升 Anti-Flag M2 琼脂糖珠悬浮液。将试管在 4 摄氏度下旋转混合三小时。三小时旋转结束后，于 1,700 × g 离心六分钟。离心后，小心移除上清液，尽可能彻底，但不得扰动松散的沉淀颗粒。

将沉淀重悬于剩余的 SNA 中，然后转移至聚丙烯预装柱。移除柱子底部的出口塞，使洗脱液依靠重力自然流出。随后，用 200 微升 1 倍 FC 缓冲液洗涤柱子五次，并按照书面实验方案所述，继续用 TEV 进行切割。

在柱子的顶部和底部迅速进行切割并紧密连接。将柱子在4°C下旋转过夜，轻轻混匀柱内成分。通过移除顶部盖子和底部塞子，将洗脱液收集至新的柱子中。

用 400 微升 1× Cal Modlin 结合缓冲液和 150 微升 Cal Modlin 结合磁珠悬液洗涤旧的层析柱。使用 1× Cal Modlin 洗脱缓冲液，将结合的蛋白质在新的离心管中分四次洗脱，每次 50 微升。

将洗脱组分等体积分配至两支干净的微量离心管中。然后使用真空离心浓缩仪将两支管中的内容物干燥。其中一支管中的干燥洗脱物用于进行银染凝胶电泳（如文中所述），另一支则储存于负80摄氏度。

为后续在质谱分析中使用干燥样品，加入50 µL消化缓冲液和0.9 µL的100 mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐，于室温下孵育45分钟以完成还原步骤。接着，加入1 µL的500 mmol/L碘乙酰胺，在避光条件下再孵育40分钟，以实现样品烷基化。第二轮孵育结束后，向混合物中加入1 µg胰蛋白酶。将样品在37 °C孵育5小时，或在室温下孵育过夜。

务必加入一微升乙酸以终止反应。然后按照文中所述准备Millipore zip tip移液枪头，以实现多肽与枪头的有效结合。将多肽混合物反复吹吸20次，并通过反复吸液和排液清洗枪头上的多肽混合物。

重复此操作两次，以确保肽混合物充分结合至含有已结合肽的移液头。吸取10微升润洗与平衡溶液，加入干净的微量离心管中。重复该步骤两次。

将洗脱的样品在真空离心浓缩仪中干燥后，可立即进行质谱分析，或在使用前于负80摄氏度保存。本实验所用的微柱填充了约10厘米长的3微米Luna C18树脂，并与ProZion纳米电喷雾离子源连接，该离子源与Orbitrap仪器串联使用。采用ProZion纳米流量二元高效液相色谱泵，在肽段分离过程中提供约每分钟300纳升的稳定流速，以实现肽段稀释，并根据样品复杂程度设置有机缓冲液梯度。

对于该大肠杆菌 SPA 样品，流动相溶剂 A 含有 95% HPLC 梯度水和 5% 乙腈，另加 0.1% 甲酸；溶剂 B 含有 5% HPLC 梯度水和 95% 乙腈，另加 0.1% 甲酸。随后使用质谱搜索算法（如 Sequest）针对大肠杆菌蛋白质序列数据库对谱图进行数据库搜索。采用概率算法（如 StarQuest）对结果进行统计学筛选，以确保较低的假发现率。结果显示，SPA 标记的 RNA 聚合酶 σ 因子和一种功能未知的 yakL 蛋白均特异性地与核心 RNA 聚合酶（包括 α、β 和 β' 亚基）以及 RNA 聚合酶循环因子共同纯化。相比之下，标记的 RNA 聚合酶 σ 因子 yakL 还额外结合了一种必需的转录终止抗终止因子，提示其在转录过程中具有特殊功能。

通过LCMS还检测到若干其他较小的共纯化蛋白，这些蛋白在凝胶上并不明显，包括RNA聚合酶的Omega亚基以及转录终止和决定因子USA和NUSD。相反，在一项独立实验中，标记的硫动员系统S-U-F-B-S-U-F-C与SUFD相互共纯化，表明它们作为单一支架复合物共同参与铁硫簇的生物合成。这一代表性实例凸显了一个事实：那些先前已被深入研究且注释详尽的细菌多蛋白复合物，尽管参与了重要的生物学过程，但仍可能具有新的相关组分，而这些组分能够被高效地鉴定出来。

采用这种方法时，由于SUFB蛋白的拷贝数较低，其信号强度可能弱于SUFC和SUFD蛋白拉下实验中观察到的强信号。为了确定稳定多亚基蛋白复合物的组成，通过综合考虑诱饵-猎物、诱饵-诱饵以及猎物-猎物关系的独特性，为高置信度的相互作用分配了共纯化评分。随后，利用马尔可夫聚类算法等图聚类方法，从划分后的概率性蛋白质相互作用网络中识别出离散的蛋白质簇。

可以使用 Cytoscape 可视化推定的相互作用网络。将蛋白质组学数据与通过基因组学方法推断的额外功能关联证据相结合，可用于研究先前注释的大肠杆菌蛋白质的新机制作用。此处，已在大肠杆菌中定义了参与更广泛功能邻域的蛋白质复合物和功能模块的子网络。

主层次聚类图显示了大肠杆菌中功能孤儿基因和已知功能基因的功能预测模式及现有注释，其中黄色和蓝色分别代表已有的和推断出的功能，颜色深浅反映置信度评分。与各个邻域相关的生物过程在右侧标示，插图展示了基于整合的物理和功能相互作用网络相似性评分得出的一个代表性邻域的各个组分。观看本视频后，您应能充分理解如何利用亲和纯化结合质谱技术来分离酿酒酵母中的稳定蛋白质复合物。

原则上，该技术可用于表征膜蛋白复合物或来自其他任何物种的蛋白复合物，因其具有尽可能的重组能力。