Name: 蛋白复合物的鉴定大肠杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: 学习利用顺序肽亲和质谱技术鉴定大肠杆菌中的蛋白质复合物及其相互作用。该方法通过双步纯化高效分离低丰度蛋白复合物，揭示多蛋白复合体的亚基组成与功能关联。

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本研究工作获得了加拿大创新基金会、基因组加拿大、安大略基因组研究所、安大略省创新部以及加拿大卫生研究院向 J.G. 和 A.E. 提供的资助。表达红色荧光的E. coli菌株DY330由唐纳德·L·库尔特（Donald L. Court，美国马里兰州弗雷德里克国家癌症研究所）惠赠。

1. 基因特异性SPA标签的构建 大肠杆菌 DY330菌株
<ol>
 <li>包含 SPA 标签 DNA 序列和卡那霉素抗性标记盒（Kan）的质粒 pJL148R) 用作聚合酶链式反应（PCR）扩增的模板7使用一条位于目标基因终止密码子上游、长45 nt的基因特异性正向引物，该引物与一段长27 bp（5'- AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'）的标签特异性正向引物同框连接；同时使用一条位于目标基因终止密码子下游、长45 nt的基因特异性反向引物，该引物与一段长27 bp（5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'）的标签特异性反向引物同框连接，用于扩增SPA标签和Kan抗性基因R 使用以下PCR循环条件，从pJL148中扩增片段：94 &deg;C，5 分钟；30 个循环：94 &deg;℃ 1分钟，55 &deg;℃ 1分钟，68 &deg;℃ 2 分 10 秒，随后 68 &deg;C，离心10分钟。这些扩增产物可作为外源引入的 &lambda;-Red同源重组系统（见下文）。</li>
 <li>使用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，以去除可能干扰电穿孔的盐分。随后将纯化的PCR产物靶向整合至DY330菌株中特定基因的3'端（即天然终止密码子的正上游区域）。 &lambda;- 表达Red重组系统10.</li>
 <li>DY330 &lambda;- 红色荧光表达菌株在 32°C 下于 2 ml Luria-Bertani (LB) 培养基中过夜培养 &deg;C，以180 rpm振荡培养。随后将1 ml过夜培养物接种至500 ml三角瓶中的70 ml新鲜LB培养基中。接种物在32 ℃下培养 &deg;C，于180 rpm振荡培养至OD600 达到约 0.8。</li>
 <li>将培养物转移至一个新的250 ml锥形瓶中，通过将锥形瓶置于42 °C水浴中孵育以诱导细胞表达 &deg;C，在180 rpm条件下轻轻振荡15分钟。诱导后立即将锥形瓶置于冰水浴中，振荡孵育至少30分钟。</li>
 <li>将冰冷的培养物立即转移至预冷的50 ml聚丙烯管中，在4℃下以3,993 × g离心6分钟 &deg;C. 将细胞沉淀重悬于50 ml冰预冷的无菌水中，于4℃、3,993 × g离心6 min &deg;C. 将细胞沉淀重悬于1 ml冷水中，转移至1.5 ml离心管中，在4℃下以最大转速离心20秒 &deg;C. 用预冷的冰水洗涤两到三次后，将细胞沉淀最终重悬于700 μL中 &mu;冰浴的无菌水，制备成感受态细胞。</li>
 <li>通过电穿孔，一种 &mu;将1微升纯化的扩增产物加入到40微升中 &mu;电穿孔感受态细胞的电穿孔在 Bio-Rad GenePulser II 仪器中进行，设置参数如下：2.5 kV，25 &mu;F，脉冲控制器设置为200 &Omega;同源重组与整合后，通过卡那霉素抗性筛选成功将标签/盒式元件重组到染色体中的转化子图1A). 挑选多个转化子进行蛋白质印迹检测，以验证正确构建（即 使用对 SPA 标签中的 FLAG 表位具有特异性的抗 FLAG M2 抗体检测 SPA 标签融合蛋白的阳性信号。</li>
 <li>经验证的羧基末端SPA标签融合菌株被大规模培养，以通过SPA纯化方案从收获的细胞中分离可溶性蛋白复合物。亲和标签纯化步骤的流程如图所示 图1B.</li>
</ol>
2. 培养与超声处理
<ol>
 <li>将100 μl SPA标签化的 E. coli 甘油菌种接种至含有50 μl浓度为25 μg/ml卡那霉素（Kan）的50 ml优质肉汤（TB）液体培养基中，置于250 ml三角瓶内，在32 °C条件下过夜培养。 
 注意：由于DY330菌株中温度诱导型λ Red基因盒受温度敏感型阻遏蛋白调控10，因此SPA标签化的E. coli菌株需在32 °C下培养。</li>
 <li>将10 ml过夜培养物转移至4升锥形瓶中的990 ml新鲜TB培养基中，该培养基添加有25 μg/ml卡那霉素（Kan）。在32 °C、250 rpm持续振荡条件下培养5至6小时，直至OD600达到约2至3。</li>
 <li>将1升的E. coli SPA标签化培养物转移至洁净的离心瓶中，在Beckman J6-HC离心机中于4 °C、3993 × g条件下离心15分钟，收集菌体。</li>
 <li>弃去离心瓶中的上清液，用25 ml超声破碎缓冲液重悬E. coli菌体沉淀。操作过程中始终将离心瓶置于冰上。</li>
 <li>将重悬后的菌体沉淀转移至50 ml聚丙烯Falcon管中，并使用液氮速冻。将冷冻细胞长期保存于-80 °C备用。</li>
 <li>超声处理前，将冷冻细胞置于冰上彻底解冻。将解冻后的样品转移至置于冰上的无菌不锈钢超声杯中。将超声探头浸入样品中，超声处理3分钟，随后静置冷却2分钟以防止样品过热。</li>
 <li>将超声破碎后的细胞裂解液转移至预冷的无菌离心管中，在Beckman离心机中使用JA-17转子于4 °C、35,267 × g（16,000 rpm）条件下离心15分钟，重复两次。 
 注意：若进行膜蛋白纯化，超声破碎后的细胞裂解液仅离心一次15分钟，因为膜蛋白可能存在于沉淀或上清液中，其分布尚不明确。为避免膜蛋白过度损失，我们采用高速离心15分钟后取上清液进行后续纯化（见下文步骤），并在纯化过程中加入1%去垢剂以溶解膜蛋白。</li>
 <li>小心地将离心管中的上清液转移至50 ml聚丙烯Falcon管中，并用液氮速冻。将超声处理后的冷冻细胞提取物保存于-80 °C，最长可保存6个月，以备后续使用。</li>
</ol>
3. 亲和纯化
<ol>
 <li>使用前，100 &mu;10体积AFC缓冲液（30 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1%去垢剂，以及0.1–0.5 mM TCEP［三（2-羧乙基）膦］）洗涤抗FLAG M2磁珠-盐酸]，但不包含去垢剂和还原剂TCEP（三(2-羧乙基)膦）。</li>
 <li>将装有冷冻超声破碎细胞提取物的离心管置于冷水中解冻。解冻后的细胞提取物与3 &mu;30 分钟内于 4℃ 加入苯并核酸酶 &deg;C. 向该混合物中加入非离子型去垢剂 Triton X-100（去垢剂的终浓度应为 0.1%）和 200 &mu;抗FLAG M2琼脂糖珠悬液 
 注意： 对于所有可溶性蛋白的纯化，使用 0.1% Triton X-100 以最大限度减少非特异性吸附；而对于膜蛋白的纯化，则使用不同的温和非离子型去污剂，例如 C12E8（八乙二醇十二醚）、DDM（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷） &beta;-二麦芽糖苷）和麦芽糖新戊二醇（MNG）可在1%的去垢剂浓度下使用以增强溶解性。由于不同去垢剂对膜蛋白的溶解效率各异，建议使用多种去垢剂分别进行独立的蛋白纯化实验。</li>
 <li>将内容在4℃下旋转混匀3小时 &deg;在LabQuake摇床中孵育。旋转3小时后，以1,700 × g离心6分钟。随后小心移除上清液，尽可能彻底，同时不扰动松散的珠粒沉淀。</li>
 <li>将沉淀重悬于剩余的上清液中，然后转移至一根0.8 x 4 cm的Bio-Rad聚丙烯预装柱中。确保移除柱子底部的出口塞，以便洗脱液依靠重力自然流出。用TEV切割缓冲液洗涤柱子5次。</li>
 <li>洗脱液弃去后，关闭柱子的下端出口。向同一柱子中加入约5至10倍柱体积的裂解缓冲液，进行切割反应。 &mu;l（50单位）TEV蛋白酶和400 &mu;将1X AFC缓冲液加入柱中，用盖子封闭柱子顶部。含有珠子的柱子于4℃轻轻旋转过夜 &deg;在 LabQuake 摇床中于 C 条件下过夜培养。</li>
 <li>取下柱子顶部的盖子和底部的出口塞，将TEV切割后收集的洗脱液转移至含有200的全新柱子中 &mu;将钙调蛋白-Sepharose珠悬浮液用10倍体积的钙调蛋白结合缓冲液洗涤。</li>
 <li>柱子的顶部和底部均需牢固固定，并在4℃下轻轻旋转混合柱内物质3小时。 &deg;使用LabQuake摇床。</li>
 <li>旋转3小时后，通过移除柱子的顶部盖子和底部塞子排出洗脱液。用200 μL洗脱缓冲液将柱子洗涤四次。 &mu;1X 钙调蛋白结合缓冲液，随后用 400 微升严格洗涤液洗涤一次 &mu;毫升钙调蛋白洗涤缓冲液</li>
 <li>结合的蛋白质以四份50 &mu;将洗脱液用1X钙调蛋白洗脱缓冲液转移至新的离心管中。将洗脱组分等体积分装至两个洁净的离心管中，随后使用真空浓缩仪干燥。</li>
 <li>一个离心管中的干燥洗脱液用于进行银染凝胶电泳，另一个则储存于-80℃ &deg;C，在使用质谱分析之前。</li>
</ol>
4. 银染
<ol>
 <li>进行银染时，向50 μl干燥的洗脱液中加入一半体积的3X SDS（十二烷基硫酸钠）上样缓冲液。将混合物煮沸5分钟后，上样至SDS聚丙烯酰胺凝胶中。</li>
 <li>电泳结束后，将凝胶小心放入固定液（50%甲醇和10%乙酸）中，在旋转摇床上轻柔振荡20分钟。随后用20%乙醇冲洗10分钟。</li>
 <li>将固定的凝胶用500 ml双蒸水彻底洗涤两次，每次10分钟，以确保背景均匀且低。</li>
 <li>然后将凝胶在500 ml硫代硫酸钠溶液中轻柔振荡1分钟，接着用蒸馏水洗涤两次，每次20秒。</li>
 <li>弃去水溶液，将凝胶在200 ml 0.1%硝酸银溶液中孵育30分钟。之后移除硝酸银溶液，并用蒸馏水洗涤20秒，以去除多余的硝酸银。</li>
 <li>最后将凝胶在75 ml显色液中手动轻柔振荡。当达到理想条带强度时，弃去显色液，并加入80 ml乙酸终止反应。为确保凝胶条带清晰可见，需在乙酸中孵育至少20分钟。</li>
</ol>
5. 蛋白质水解与质谱样品制备
<ol>
 <li>向干燥的样品中加入 50 &mu;消化缓冲液 0.9 升 &mu;100 mM TCEP-HCl（三(2-羧乙基)膦）溶液-盐酸），室温下孵育混合物45分钟 用于还原步骤。接下来，1 &mu;加入500 mM碘乙酰胺1 μl，避光孵育40分钟，以完成样品烷基化。</li>
 <li>第二次孵育后，加入1 &mu;将固定化胰蛋白酶加入混合物中，并在37℃孵育 &deg;C 反应5小时或室温过夜。通过加入1终止反应 &mu;乙酸的升数。</li>
 <li>用移液枪头吸取10 μL的溶液预润湿Millipore Zip-Tip吸头 &mu;润洗和平衡溶液的液体。将溶液排入废液。随后用移液器吸取10 &mu;加入1毫升洗涤液，并将溶液弃入废液。重复此步骤两次。</li>
 <li>为确保肽混合物高效结合至吸头，用移液器将肽混合物吹打混匀20次。通过吸取和 dispensing 洗涤液，将吸附在吸头上的肽混合物冲洗下来。重复此步骤两次，以实现肽混合物与吸头的高效结合。</li>
 <li>用含有结合肽的枪头吸取10 &mu;湿化与平衡溶液各取适量，加入洁净的微量离心管中。重复此步骤两次。将洗脱样品在真空浓缩仪中干燥后，可立即用于质谱分析，或于-80℃保存。 &deg;使用前置于 C。</li>
</ol>
6. 使用 LTQ Orbitrap Velos 质谱仪进行蛋白质鉴定
使用LTQ Orbitrap Velos杂合型串联质谱仪鉴定分离复合物的多肽组分。Orbitrap具有卓越的分辨能力（&gt;60,000 全宽半高（FWHM）和质量精度&lt;2 ppm），以最大限度减少在对照纯化中检测到的无关非特异性背景污染物的 MS/MS 采样，而高速 Velos 离子阱组件则可通过电子转移解离和碰撞诱导解离两种模式检测并碎裂低丰度肽段。对获得的 MS/MS 谱图进行高置信度匹配，并将其映射至参考序列 大肠杆菌 使用 SEQUEST 等数据库搜索算法对蛋白质序列进行检索，并通过 STATQUEST 等概率算法对每条匹配序列进行评估11总谱图数量、肽段序列唯一性以及在阴性对照中检测到的常见背景污染物即模拟）纯化被认为可实现较低的经验性假阳性发现率。进行以下步骤以鉴定蛋白质：
 
<ol>
 <li>微柱中填充约 10 cm 的 3 μm Luna-C18 树脂，并与 Proxeon 纳米电喷雾离子源连接，该离子源与 Orbitrap 仪器串联使用。</li>
 <li>使用 Proxeon 纳流二元 HPLC 泵，在肽段分离过程中提供稳定的喷嘴流速，约为 300 nl min-1。</li>
 <li>为实现肽段洗脱，根据样品复杂程度设置有机溶剂梯度。例如，对于 E. coli SPA 样品通常采用以下梯度：在 1 分钟内将溶剂 B 从 2% 升至 6%，在接下来的 38 分钟内升至 24%，再用 4 分钟升至 100%，保持 1 分钟，随后在 1 分钟内降至 2%，最后在 2% 条件下维持 15 分钟。流动相溶剂 A 含 95% HPLC 梯度水和 5% ACN，并添加 0.1% 甲酸；溶剂 B 含 5% HPLC 梯度水和 95% ACN，并添加 0.1% 甲酸。针尖流速设定为 300 nl min-1，持续 60 分钟。</li>
 <li>质谱仪以 60,000 分辨率进行一次完整全扫描的同时，对强度最高的前体离子进行 10 次并行的串联碎裂质谱扫描。启用动态排除、单一同位素质量选择以及实时数据依赖性采集等仪器功能。</li>
 <li>使用数据库搜索算法（如 SEQUEST）对谱图进行搜索，比对 E. coli 蛋白质序列数据库，并采用概率算法（如 STAQUEST11）进行统计学过滤，以确保较低的假阳性发现率。仅选择高置信度（99% 概率）的候选结果，而与理论肽段质量偏差超过 10 ppm 的匹配项则被排除。</li>
</ol>

<ol><li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096(2009).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Mak, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+functional+proteomics+approach+identifies+chromatin+remodeling+complexes+important+for+the+induction+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency.</a> Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).</li>
<li>Polanowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+immunoaffinity+purification+of+protein+complexes+from+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 36, 778-782 (2004).</li>
<li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%2C+a+generic+large+scale+proteomic+investigation+strategy+for+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals.</a> Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).</li>
<li>Vlasblom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenePro%3A+a+Cytoscape+plug-in+for+advanced+visualization+and+analysis+of+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks.</a> Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).</li>
<li>de Berardinis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

此处所述基于 SPA 的 APMS 方法的一个关键特点是，标记是在天然染色体环境中进行的，从而确保了正常的基因调控得以维持（i.e. 保留天然诱饵基因的启动子，因此表达水平不受干扰），并能够以接近内源性水平回收天然稳定结合的蛋白质复合物。通过在筛选标记中引入向外定向的启动子，还可避免操纵子极性问题。该 SPA 标记方法的效率足以将低丰度复合物的组分纯化至接近均一的程度，包括膜相关复合物，即使这些亚基在每个细菌细胞中的表达量仅有数个分子。总体而言，本方案可轻松扩展，用于在 E. coli 中大规模纯化大量标记的可溶性蛋白质，原则上也可适用于任何可通过重组工程实现标记的其他细菌物种，或具有天然高效转化能力的物种，例如近年来作为细菌遗传学新兴模式菌株的不动杆菌（Acinetobacter），该菌已被用于构建靶向基因敲除的菌株文库13。
大规模蛋白质组学方法存在一个主要问题，即会鉴定出大量非特异性的相互作用蛋白以及微量污染。尽管进行了两轮富集，我们常规的 SPA 纯化实验仍经常检测到常见的污染物，这些通常是高丰度的管家蛋白，例如核...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;一、抗生素&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Bioshop</td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Bioshop</td><td>#AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. 优质肉汤培养基&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>生物胰蛋白胨</td><td>Bioshop</td><td>#TRP 402</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Bioshop</td><td>#YEX 555</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Bioshop</td><td>#GLY 002</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;人类表型本体&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 302</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 303</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. 细菌菌株与质粒&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DY330</td><td></td><td>Yu &lt;em&gt;等人&lt;/em&gt;. (2000)&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>pJL148</td><td></td><td>Zeghouf &lt;em&gt;等人&lt;/em&gt;. (2004)&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. PCR与电泳试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>费马塔斯</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 X PCR缓冲液</td><td>费玛塔斯</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>费马塔斯</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>费马塔斯</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28355</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Bioshop</td><td>#TRS001</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Bioshop</td><td>#BOR001</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA（pH 8.0）</td><td>西格玛</td><td># E6768</td><td></td></tr><tr><td>DNA 标准分子量标记</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. 质粒提取与纯化试剂盒&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>质粒中量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>#12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. PCR与转化实验设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>BioRad</td><td>iCycler</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳</td><td>伯乐（BioRad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulser II</td><td></td></tr><tr><td>0.2 cm 电穿孔比色皿</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;C 水浴摇床</td><td></td><td>Innova 3100</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>TS-5.1-500</td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C Shaker</td><td>美国新不伦瑞克科学公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C 大型 Shaker</td><td>美国新不伦瑞克科学公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;C板培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;7. 电泳与蛋白质印迹&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>丙烯酰胺单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0125</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Bioshop</td><td># AMP001</td><td></td></tr><tr><td>正丁醇</td><td>西格玛</td><td># B7906</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bioshop</td><td>#TEM001</td><td></td></tr><tr><td>沃特曼1号滤纸</td><td>Fischer Scientific</td><td>#09-806A</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean 3 电泳槽</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>#165-3301</td><td></td></tr><tr><td>iBlot凝胶转印装置</td><td>Invitrogen</td><td>#IB1001</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Bio-Rad</td><td>#162-0115</td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗Flag M2抗体</td><td>西格玛</td><td>#F3165</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶</td><td>Amersham</td><td>#NA931V</td><td></td></tr><tr><td>预染蛋白质分子量标准</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0363</td><td></td></tr><tr><td>化学发光试剂</td><td>PIERCE</td><td>#1856136</td><td></td></tr><tr><td>放射自显影胶片</td><td>Clonex Corp</td><td>#CLEC810</td><td></td></tr><tr><td>快速转印印迹纸</td><td>西格玛</td><td>#P7796</td><td></td></tr><tr><td>C2 平台摇床</td><td>美国新不伦瑞克科学公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;8. 超声破碎设备与试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>#23395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>#SOD001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>罗氏</td><td>#800-363-5887</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM TCEP-HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>#20490</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;9. 亲和纯化试剂与设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>0.8 x 4 cm Bio-Rad 聚丙烯柱</td><td>Bio-Rad</td><td>#732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase核酸酶</td><td>Novagen</td><td>#70746</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 琼脂糖珠</td><td>Sigma</td><td>#A2220</td><td></td></tr><tr><td>钙调蛋白-Sepharose珠</td><td>GE Healthcare</td><td>#17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>TEV 蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>#12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>西格玛</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>#C2661</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>LabQuake 摇床</td><td>Thermolyne</td><td>#59558</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10. 银染试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Bioshop</td><td>#MET302</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Bioshop</td><td>t#ACE222</td><td></td></tr><tr><td>硫代硫酸钠</td><td>西格玛</td><td>#S-7143</td><td></td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>Fischer Scientific</td><td>#S181-100</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Bioshop</td><td>#FOR201</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Bioshop</td><td>#SOC512</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;11. 蛋白质鉴定的试剂与设备 &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶金，质谱级</td><td>普洛麦格</td><td># V5280</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH₄HCO₃&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>#AMC555</td><td></td></tr><tr><td>1 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Bioshop</td><td>#CCL302</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma</td><td>#A998-4</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>西格玛</td><td>#F0507</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级水</td><td>西格玛</td><td>#95304</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>西格玛</td><td>#16125</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Zip-Tip</td><td>默克密理博</td><td># ZTC18M960</td><td></td></tr><tr><td>约10厘米的3 &amp;mu;m Luna-C18 树脂</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proxeon nano HPLC 泵</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos 质谱仪</td><td></td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;12. 实验器材&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4升锥形瓶</td><td>VWR</td><td>#89000-372</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯圆底离心管</td><td>任何供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微型离心管</td><td>任何供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 锥形瓶</td><td>VWR</td><td>#29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 无菌培养管</td><td>Thermo Scientific</td><td>#366052</td><td></td></tr><tr><td>冷冻管</td><td>VWR</td><td>#479-3221</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C 冷冻柜</td><td>Fisher Scientific</td><td>#13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩系统</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;缓冲液与溶液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;1. 1 升超丰富肉汤（Terrific Broth，TB）培养基&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;11 g 生物胰蛋白胨&lt;br/&gt; 22 克酵母提取物&lt;br/&gt; 2% 甘油&lt;br/&gt; 50 ml 钾盐储备液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;2. 钾盐储备液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;1.5 M K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;人类表型本体&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 0.35 M KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;3. 超声缓冲液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;20 mM Tris-HCl (pH 7.9)&lt;br/&gt; 150 mM NaCl&lt;br/&gt; 0.2 mM EDTA&lt;br/&gt; 10% 甘油&lt;br/&gt; 使用前加入蛋白酶抑制剂（PI）和 0.1–0.5 mM TCEP&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;4. AFC 缓冲液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;30 mM Tris-HCl（pH 7.9）&lt;br/&gt; 150 mM NaCl&lt;br/&gt; 0.1% 去垢剂&lt;br/&gt; 使用前加入 PI 和 0.1–0.5 mM TCEP&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;5. TEV 裂解缓冲液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;30 mM Tris-HCl（pH 7.9）&lt;br/&gt; 150 mM NaCl&lt;br/&gt; 0.2 mM EDTA&lt;br/&gt; 0.1% 去垢剂&lt;br/&gt; 使用前加入 PI 和 0.1–0.5 mM TCEP&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;6. 钙调蛋白结合缓冲液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;30 mM Tris-HCl (pH 7.9)&lt;br/&gt; 150 mM NaCl&lt;br/&gt; 2 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 0.1% 去垢剂&lt;br/&gt; 使用前加入 PI 和 0.1–0.5 mM TCEP&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;7. 钙调蛋白洗涤缓冲液&lt;/p&gt; &lt;p 类=&quot;jove_content&quot;&gt;30 mM Tris-HCl pH 7.9&lt;br/&gt; 150 mM NaCl&lt;br/&gt; 2 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 0.1–0.5 mM TCEP&lt;/p&gt; &lt;p 类=&quot;jove_step&quot;&gt;8. 钙调蛋白洗脱缓冲液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;30 mM Tris-HCl (pH 7.9)&lt;br/&gt; 100 mM NaCl&lt;br/&gt; 10 mM EGTA&lt;br/&gt; 0.1–0.5 mM TCEP&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;9. 显影液（1 L）&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;37% 甲醛&lt;br/&gt; 30 g 碳酸钠&lt;br/&gt; 1000 ml 蒸馏水&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;10. 消化缓冲液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;50 mM NH₄HCO₃&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 1 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;11. 润洗与平衡溶液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;含0.1%甲酸的70%乙腈（ACN）&lt;/p&gt; &lt;p 类=&quot;JoVE 步骤&quot;&gt;12. 洗涤液&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;100% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 在 0.1% 甲酸中&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

由于大多数细胞过程由大分子组装体介导，系统性鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）以及多蛋白复合物的亚基组成，有助于揭示基因功能并加深对生物系统的理解1, 2。通过在接近生理条件下，基于染色体标记蛋白的亲和纯化联合质谱技术（APMS），大规模分离和表征内源性蛋白复合物，可高置信度地绘制出物理相互作用图谱。该方法已成功应用于进化上多样化的生物体，包括酵母、果蝇、线虫、哺乳动物细胞和细菌1-6。特别是，我们建立了一种C端连续肽段亲和（SPA）双标签系统，用于从培养的革兰氏阴性大肠杆菌（Escherichia coli）中亲和纯化天然蛋白复合物，所用宿主实验室菌株具有良好的遗传可操作性，适用于对原核生物基本生物学特征及保守过程进行全基因组水平的研究1, 2, 7。我们的SPA标签系统类似于最初为酵母开发的串联亲和纯化方法8, 9，包含一个钙调蛋白结合肽（CBP），其后接高度特异性的烟草蚀刻病毒（tobacco etch virus，TEV）蛋白酶切割位点以及三个FLAG表位重复序列（3X FLAG），从而实现两轮连续的亲和富集。在扩增标签盒后，编码SPA标签和可筛选标记的序列特异性线性PCR产物被整合并在DY330背景菌株中以C端融合形式同框表达，该菌株可被诱导瞬时表达高效的异源噬菌体λ重组系统10。随后使用钙调蛋白和抗FLAG亲和微珠进行两步纯化，能够高效且高选择性地从大规模培养物中回收即使丰度极低的蛋白复合物。再通过串联质谱技术，以高灵敏度（检测限达纳克级）鉴定稳定共纯化的蛋白质。
本文描述了我们通常用于系统性蛋白质标记、纯化及基于质谱分析大肠杆菌（E. coli）可溶性蛋白复合物的详细分步实验流程，该方法可放大规模，并有望适用于其他细菌物种，包括某些可进行重组工程操作的机会性病原体。所获得的物理相互作用常能揭示出有趣的意外组分和连接关系，提示新的作用机制。将蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据与其它分子关联数据（如遗传学（基因-基因）相互作用和基因组上下文（GC）预测）整合，有助于阐明生物通路中多蛋白复合物的全局分子组织结构。针对大肠杆菌（E. coli）构建的相互作用网络可用于深入了解目前功能注释尚不完善的其他微生物中同源基因产物的功能架构。

当在对数生长期培养物中以内源水平表达的标记诱饵蛋白经亲和纯化后，将样品在银染凝胶上电泳，以观察所分离的稳定复合物中的各个多肽组分。我们还取另一部分亲和纯化的蛋白样品进行无凝胶串联质谱分析（LCMS），以鉴定相应的多肽序列。本亲和纯化质谱（APMS）方法的有效性通过RNA聚合酶（RNAP）和SufBCD铁硫（Fe-S）蛋白复合物组分的代表性SDS-PAGE分析结果加以展示，这些复合物系从 E. coli （图 1C 和 D）. 两种均带有SPA标签的RNAP σ70 (RpoD) 和 YacL（一种功能未知的蛋白质）与核心 RNA 聚合酶（RNAP）特异性共纯化 例如α（RpoA）、β（RpoB）和β'（RpoC）亚基，以及RNA聚合酶循环因子（HepA）。与标记的RpoD不同，YacL还额外结合了一种重要的转录终止/抗终止因子（NusG），提示其在转录过程中具有特殊功能。我们还通过LCMS检测到若干其他较小的共纯化蛋白，这些蛋白在凝胶上不明显，包括RNA聚合酶ω亚基RpoZ，以及转录终止/抗终止因子NusA和NusD，分别与标记的RpoD或Yac...

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia coli）优化的连续肽段亲和纯化（SPA）APMS流程，该方法可用于分离和表征稳定的多蛋白复合物，即使起始时每个细胞中目标蛋白拷贝数很低，也能实现接近均一的纯化。

由于大多数细胞过程由大分子复合物介导，系统性鉴定蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）以及确定多蛋白复合物的亚基组成，可为基因功能提供见解，并加深对生物系统的理解1,2。可通过在接近生理条件下，对内源性蛋白复合物进行大规模分离与表征，以高置信度绘制出物理相互作用图谱，该方法基于染色体标记蛋白的亲和纯化结合质谱分析（APMS）。该策略已成功应用于进化上多样化的生物体，包括酵母、果蝇、线虫、哺乳动物细胞和细菌1-6。特别是，我们开发了一种C端连续肽亲和（SPA）双标签系统，用于从培养的革兰氏阴性大肠杆菌中亲和纯化天然蛋白复合物，所用宿主为遗传操作便利的实验室菌株，适用于对原核生物基本生物学及保守过程开展全基因组水平的研究1,2,7。我们的SPA标签系统类似于最初为酵母开发的串联亲和纯化方法8,9，包含一个钙调蛋白结合肽（CBP），其后接高度特异性的烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点以及三个拷贝的FLAG表位（3X FLAG），从而实现两轮连续的亲和富集。在盒式扩增后，编码SPA标签和可筛选标记物的序列特异性线性PCR产物被整合并在阅读框内表达为C端融合蛋白，宿主为DY330菌株，该菌株可被诱导瞬时表达高效的异源噬菌体λ重组系统10。随后使用钙调蛋白和抗FLAG亲和微珠进行两步纯化，能够从大规模培养物中高效且高选择性地回收即使丰度极低的蛋白复合物。再通过串联质谱分析，以高灵敏度（检测限达纳克水平）鉴定稳定共纯化的蛋白质。本文中，我们详细描述了常用于大肠杆菌可溶性蛋白复合物的系统性蛋白标记、纯化及基于质谱分析的逐步操作流程，该流程可放大，并有可能根据其他适用于重组工程的细菌物种（包括某些机会性病原菌）进行调整。所获得的物理相互作用常能揭示出意料之外的新组分和关联，提示新的机制联系。将PPI数据与其他分子关联数据（如遗传相互作用（基因-基因相互作用）和基因组上下文（GC）预测）整合，有助于阐明生物通路中多蛋白复合物的全局分子组织结构。所构建的大肠杆菌相互作用网络可用于理解目前功能注释尚不完善的其他微生物中同源基因产物的功能架构。

本实验的目的是鉴定大肠杆菌中天然MultiPro复合物的蛋白质、蛋白质相互作用及其亚基组成。首先扩增编码SPA标签和可筛选标记物的序列特异性线性PCR产物，利用细菌噬菌体λ重组系统，将这些产物整合并在ddy 3, 3 0遗传背景下以羧基末端融合形式表达；随后，采用伴刀豆球蛋白A（cow modlin）和抗Flag亲和磁珠进行两步法双重纯化，以高效回收丰度较低的蛋白质复合物。接着，用伴刀豆球蛋白A洗脱并收集结合的蛋白质，使用CEB（elution buffer）洗脱液洗脱，随后用胰蛋白酶消化，并通过质谱分析进行蛋白质鉴定。实验结果表明，核心RNA聚合酶的多个亚基，包括转录终止因子和抗决定因子，能够与带有标签的RNA聚合酶亚基D蛋白高效共纯化，表明利用该方法可有效鉴定新关联的组分。通常，初次接触该方法的研究人员可能在两轮亲和纯化步骤中遇到困难，其中必须使用适当的缓冲液小心处理细胞裂解物，以确保从大规模培养物中高效回收丰度较低和较高的结合复合物。亲和纯化与质谱分析操作流程将由本实验室的两名技术人员Olga Kagan和HBO guo进行示范。本实验方案首先针对DDY three 30菌株中的特定扩增序列进行操作，该菌株可表达Lambda red重组系统，具体操作如书面方案所述。接下来，将表达噬菌体 Lambda 重组系统的细菌菌株在 32 摄氏度、180 RPM 振荡条件下，于 2 毫升 LB 培养基（Luria broth 或 LB 培养基）中过夜培养。次日，将 1 毫升过夜培养物接种至装有 70 毫升新鲜 LB 培养基的 500 毫升锥形瓶中。在 32 摄氏度、180 RPM 振荡条件下培养，直至 OD600 达到约 0.8。随后将锥形瓶置于 42 摄氏度水浴中，以 180 RPM 轻柔振荡孵育 15 分钟，以诱导细胞表达。诱导后立即在冰水浴中振荡孵育烧瓶至少30分钟。按照书面实验步骤收获并清洗细胞后，用700微升冰冻的无菌水重悬细胞沉淀，从而制备可用于电穿孔的电转感受态细胞。将1微升纯化的扩增产物加入40微升电转感受态细胞中。同源重组与整合后，对细胞进行电穿孔。根据对卡那霉素的抗性筛选成功将标签-盒式结构重组至染色体的转化子。选取多个转化子进行蛋白质印迹分析，利用抗-Flag M2抗体（特异性识别SPA标签中的Flag表位）验证SPA标签融合蛋白的正确表达。将10毫升过夜培养物转移至含25微克/毫升卡那霉素的990毫升新鲜TB培养基中，置于4升锥形瓶中培养。在32摄氏度、250 RPM持续振荡条件下培养菌液5至6小时，直至OD600达到2至3。将一升大肠杆菌SPA标签菌液转移至洁净的离心瓶中，在4摄氏度、3,993 ×g条件下离心15分钟。随后按照书面实验方案所述重新悬浮细胞。将样品转移至置于冰上的无菌不锈钢杯中进行超声处理。将探头浸入样品，超声处理三分钟。超声处理后，将样品在冰上静置冷却两分钟，以防止离心过程中因过热导致样品损伤。小心地将离心管中的上清液 S 转移至一个 50 毫升的聚丙烯方管中。使用液氮冷冻样品，并将超声处理后的冷冻细胞提取物在 -80 °C 条件下保存，最长可保存六个月，以备后续使用。开始对冷冻的超声细胞提取物进行亲和纯化时，将管置于冷水中，然后在 4 °C 条件下孵育 TH 细胞提取物，并加入 3 微升核酸酶苯甲（benzonase），孵育 30 分钟。向此混合物中加入非离子型去污剂 Triton X-100 和 200 微升 Anti-Flag M2 琼脂糖珠悬浮液。将试管在 4 摄氏度下旋转混合三小时。三小时旋转结束后，于 1,700 × g 离心六分钟。离心后，小心移除上清液，尽可能彻底，但不得扰动松散的沉淀颗粒。将沉淀重悬于剩余的 SNA 中，然后转移至聚丙烯预装柱。移除柱子底部的出口塞，使洗脱液依靠重力自然流出。随后，用 200 微升 1 倍 FC 缓冲液洗涤柱子五次，并按照书面实验方案所述，继续用 TEV 进行切割。在柱子的顶部和底部迅速进行切割并紧密连接。将柱子在4°C下旋转过夜，轻轻混匀柱内成分。通过移除顶部盖子和底部塞子，将洗脱液收集至新的柱子中。用 400 微升 1× Cal Modlin 结合缓冲液和 150 微升 Cal Modlin 结合磁珠悬液洗涤旧的层析柱。使用 1× Cal Modlin 洗脱缓冲液，将结合的蛋白质在新的离心管中分四次洗脱，每次 50 微升。将洗脱组分等体积分配至两支干净的微量离心管中。然后使用真空离心浓缩仪将两支管中的内容物干燥。其中一支管中的干燥洗脱物用于进行银染凝胶电泳（如文中所述），另一支则储存于负80摄氏度。为后续在质谱分析中使用干燥样品，加入50 µL消化缓冲液和0.9 µL的100 mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐，于室温下孵育45分钟以完成还原步骤。接着，加入1 µL的500 mmol/L碘乙酰胺，在避光条件下再孵育40分钟，以实现样品烷基化。第二轮孵育结束后，向混合物中加入1 µg胰蛋白酶。将样品在37 °C孵育5小时，或在室温下孵育过夜。务必加入一微升乙酸以终止反应。然后按照文中所述准备Millipore zip tip移液枪头，以实现多肽与枪头的有效结合。将多肽混合物反复吹吸20次，并通过反复吸液和排液清洗枪头上的多肽混合物。重复此操作两次，以确保肽混合物充分结合至含有已结合肽的移液头。吸取10微升润洗与平衡溶液，加入干净的微量离心管中。重复该步骤两次。将洗脱的样品在真空离心浓缩仪中干燥后，可立即进行质谱分析，或在使用前于负80摄氏度保存。本实验所用的微柱填充了约10厘米长的3微米Luna C18树脂，并与ProZion纳米电喷雾离子源连接，该离子源与Orbitrap仪器串联使用。采用ProZion纳米流量二元高效液相色谱泵，在肽段分离过程中提供约每分钟300纳升的稳定流速，以实现肽段稀释，并根据样品复杂程度设置有机缓冲液梯度。对于该大肠杆菌 SPA 样品，流动相溶剂 A 含有 95% HPLC 梯度水和 5% 乙腈，另加 0.1% 甲酸；溶剂 B 含有 5% HPLC 梯度水和 95% 乙腈，另加 0.1% 甲酸。随后使用质谱搜索算法（如 Sequest）针对大肠杆菌蛋白质序列数据库对谱图进行数据库搜索。采用概率算法（如 StarQuest）对结果进行统计学筛选，以确保较低的假发现率。结果显示，SPA 标记的 RNA 聚合酶 σ 因子和一种功能未知的 yakL 蛋白均特异性地与核心 RNA 聚合酶（包括 α、β 和 β' 亚基）以及 RNA 聚合酶循环因子共同纯化。相比之下，标记的 RNA 聚合酶 σ 因子 yakL 还额外结合了一种必需的转录终止抗终止因子，提示其在转录过程中具有特殊功能。通过LCMS还检测到若干其他较小的共纯化蛋白，这些蛋白在凝胶上并不明显，包括RNA聚合酶的Omega亚基以及转录终止和决定因子USA和NUSD。相反，在一项独立实验中，标记的硫动员系统S-U-F-B-S-U-F-C与SUFD相互共纯化，表明它们作为单一支架复合物共同参与铁硫簇的生物合成。这一代表性实例凸显了一个事实：那些先前已被深入研究且注释详尽的细菌多蛋白复合物，尽管参与了重要的生物学过程，但仍可能具有新的相关组分，而这些组分能够被高效地鉴定出来。采用这种方法时，由于SUFB蛋白的拷贝数较低，其信号强度可能弱于SUFC和SUFD蛋白拉下实验中观察到的强信号。为了确定稳定多亚基蛋白复合物的组成，通过综合考虑诱饵-猎物、诱饵-诱饵以及猎物-猎物关系的独特性，为高置信度的相互作用分配了共纯化评分。随后，利用马尔可夫聚类算法等图聚类方法，从划分后的概率性蛋白质相互作用网络中识别出离散的蛋白质簇。可以使用 Cytoscape 可视化推定的相互作用网络。将蛋白质组学数据与通过基因组学方法推断的额外功能关联证据相结合，可用于研究先前注释的大肠杆菌蛋白质的新机制作用。此处，已在大肠杆菌中定义了参与更广泛功能邻域的蛋白质复合物和功能模块的子网络。主层次聚类图显示了大肠杆菌中功能孤儿基因和已知功能基因的功能预测模式及现有注释，其中黄色和蓝色分别代表已有的和推断出的功能，颜色深浅反映置信度评分。与各个邻域相关的生物过程在右侧标示，插图展示了基于整合的物理和功能相互作用网络相似性评分得出的一个代表性邻域的各个组分。观看本视频后，您应能充分理解如何利用亲和纯化结合质谱技术来分离酿酒酵母中的稳定蛋白质复合物。原则上，该技术可用于表征膜蛋白复合物或来自其他任何物种的蛋白复合物，因其具有尽可能的重组能力。

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串联亲和纯化是一种用于鉴定蛋白质结合伴侣的可靠方法。作为概念验证，该方法已应用于研究较为深入的翻译起始因子...

使用串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用伙伴

本视频展示了串联亲和纯化技术——一种用于从真核细胞中纯化蛋白质复合物以研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该复合物包含两种带有不同表位标签的蛋白质。通过依次使用两种对不同标签具有亲和力的树脂纯化该复合物后，若在洗脱液中同时检测到这两种蛋白质，则可证实二者之间存在相互作用。...

串联亲和纯化实验用于研究蛋白质-蛋白质相互作用

本文描述了在低温条件下通过固态研磨破碎哺乳动物细胞，从所得细胞粉末制备细胞提取物，并利用抗体偶联的微米级顺磁性珠进行亲和捕获以分离目标蛋白复合物的实验方案。...

从冷冻研磨的哺乳动物细胞中进行蛋白质复合物亲和捕获

本文介绍一种新颖、稳健且高效的串联亲和纯化（TAP）方法，用于从真核细胞中表达、分离和表征蛋白质复合物。该方案可用于对特定复合物进行生物化学表征，以及鉴定调控其功能的新型相互作用蛋白和翻译后修饰。...

从真核细胞中对蛋白质复合物进行串联亲和纯化

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。...

一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本文介绍一种利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）及自主开发的软件进行自上而下蛋白质组学分析，快速鉴定基因组测序的致病菌所产生蛋白质的实验方案。由于天冬氨酸效应，亚稳态蛋白质离子发生断裂，该特异性被用于蛋白质鉴定。...

抗菌免疫蛋白的鉴定 大肠杆菌 使用 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 和自上而下蛋白质组学分析

学习利用顺序肽亲和质谱技术鉴定大肠杆菌中的蛋白质复合物及其相互作用。该方法通过双步纯化高效分离低丰度蛋白复合物，揭示多蛋白复合体的亚基组成与功能关联。

蛋白质复合物的鉴定大肠杆菌使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

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蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

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