蛋白复合物的鉴定大肠杆菌
November 12th, 2012
亲和纯化标签蛋白结合质谱（APMS）是一个功能强大的蛋白质相互作用网络系统的映射方法和调查的生物过程的机理的基础。在这里，我们描述了一个优化的顺序肽亲和力（SPA）APMS程序开发的细菌大肠杆菌，可用于分离和表征到接近均匀性，甚至从每个细胞的拷贝数低的稳定的多蛋白复合物。
本实验的目的是鉴定大肠杆菌中蛋白质、蛋白质相互作用和天然 MultiPro 复合物的亚基组成。这是通过扩增序列特异性线性 PCR 产物、编码 SPA 标签和可选标记来实现的，它们在框架中被整合并表达为 ddy 3、3 0 背景中的羧基末端融合，使用细菌 Fage lambda 重组系统作为第二步，使用奶牛莫德林和 Anti-Flag 亲和珠进行双步纯化，以有效回收低丰度蛋白质复合物。接下来，用胰蛋白酶消化用奶牛莫德林、洗脱缓冲液或 CEB 提取的结合蛋白，并用质谱法处理以进行蛋白质鉴定。
获得的结果表明，核心 RNA 聚合酶的几个亚基，包括转录终止、抗决定因子与标记的 RNA 聚合酶亚基 D 蛋白有效共纯化，表明使用这种方法可以有效地发现新的相关组分。通常，刚接触这种方法的个体可能会遇到两种轮次亲和纯化的困难，其中绝对需要用适当的缓冲溶液仔细处理细胞裂解物，以确保从大规模培养物中成功成功回收低丰度和高丰度负荷复合物我实验室的两名技术人员将演示亲和纯化和质谱程序。该方案首先将特异性扩增序列靶向 DDY 三个 30 菌株，其中 Lambda 红色重组机制如书面方案中所述表达。
接下来，在 32 摄氏度的 2 毫升 Luria bati 或 LB 培养基中表达菌株的细菌 farge Lambda 重组系统，第二天以 180 RPM 振荡，将 1 毫升过夜培养物接种到 70 毫升新鲜 LB 培养基中500 毫升锥形瓶中。在 32 摄氏度下以 180 RPM 摇动培养接种物，直到 OD 600 达到约 0.8。将培养瓶置于 42 °C 的水浴中，以 180 RPM 的转速轻轻摇动 15 分钟，以诱导细胞。
诱导后，立即将培养瓶在冰水浆浴中摇晃孵育至少 30 分钟。按照书面程序中的说明收获和洗涤细胞后，Reese 将细胞沉淀悬浮在 700 微升冰、冷、无菌水中，从而通过电穿孔产生电感受态细胞。将 1 微升纯化的扩增子引入 40 微升电感受态细胞中。
细胞在同源重组和整合后进行电穿孔。根据对 Can Mycin 的抗性选择成功将 tag slash 盒重组到染色体中的转化体 选择多个转化器进行蛋白质印迹，以验证 SPA 标记融合蛋白的正确生成与抗 Flag M 两种抗体对 SPA 标签的标志表位具有选择性将 10 毫升过夜培养物转移到 990 毫升新鲜结核病中。在 4 升烧瓶中补充每毫升 25 微克的罐装霉素。
在 32 摄氏度下培养培养物，以 250 RPM 的转速持续摇动 5 到 6 小时，直到 OD 600 达到 2 到 3 之间。将 1 升大肠杆菌 SPA 标签培养物转移到清洁的离心瓶中，并在 4 摄氏度和 3， 993 倍 G 下旋转细胞 15 分钟。复苏后，按照书面方案中的说明暂停细胞。
将样品转移到置于冰上的无菌不锈钢杯中进行超声处理。将探针浸入样品中并超声处理 3 分钟。超声处理后，再放置 2 分钟以冷却超声处理裂解物离心后过热的样品。
小心地将 S 上清液从离心管转移到 50 毫升聚丙烯 falcon 管中。使用液氮冷冻样品，并将超声处理的冷冻细胞提取物在零下 80 摄氏度下储存最长六个月以备将来使用。要将试管置于冷水中开始对冷冻超声处理的细胞提取物进行亲和纯化，请将 TH 细胞提取物与 3 微升苯并（一种核酸酶）在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。
向该混合物中，添加非离子去污剂 Triton X 100 和 200 微升 Anti-Flag M 两种农业微珠悬浮液。旋转 3 小时后，在 4 摄氏度下旋转试管 3 小时，轻轻混合内容物，以 1， 700 倍 G 离心试管 6 分钟。离心后，小心地去除尽可能多的浆料，而不会干扰松散的快速颗粒。
将沉淀重新悬浮在剩余的 SNA 中，然后转移到聚丙烯制备柱中。拆下色谱柱底部的出口塞，让洗脱液在重力作用下排空。流。接下来，用 200 μL 的 1 次 FC 缓冲液洗涤色谱柱 5 次，然后按照书面方案中的说明用 TEV 进行 Cleve。
在柱的顶部和底部紧紧地进行快速切割。旋转过夜后，在 4 摄氏度下旋转过夜，轻轻混合色谱柱中的内容物。将顶盖和底部塞子取下到新色谱柱中，以排空洗脱液。
用 400 微升 1 x cal Modlin 结合缓冲液和 150 微升 Cal Modlin 结合珠悬浮液洗涤旧柱。在新鲜的 eend orph 管中以 50 μL 的四组分洗脱结合的蛋白质。使用一种 x cal Modlin 洗脱缓冲液。
将洗脱的馏分以等体积分配到两个干净的 eend orph 管中。然后使用高速真空吸尘器干燥两管的内容物。来自一根管的干燥洗脱液用于运行文中所述的银染凝胶，而另一根则储存在零下 80 摄氏度。
为了将来用于质谱分析，向干燥的样品中加入 50 微升消化缓冲液和 0.9 微升 100 毫摩尔三膦盐酸 将混合物在室温下孵育 45 分钟，用于还原步骤 接下来，加入 1 微升 500 毫摩尔 IDO 乙酰胺，并在黑暗中再孵育 40 分钟。允许样品烷基化 在第二轮孵育后，向混合物中加入 1 μg trips。将样品在 37 摄氏度下孵育 5 小时，或在孵育后在室温下过夜。
确保通过添加 1 微升乙酸来终止反应。然后按照文中的说明准备 Millipore 拉链吸头、移液器吸头，以将肽有效地结合到吸头管 pep。混合肽混合物 20 次，通过吸出和分配洗涤液洗掉它对尖端所做的多肽混合物。
重复此过程两次，以使肽混合物与尖端有效结合，尖端含有结合的肽。吸出 10 μL 润湿和 e 平衡溶液，并分配到干净的 eend orph 管中。重复此步骤两次。
在高速真空中干燥洗脱的样品后，样品可以立即通过质谱分析或在使用前储存在零下 80 摄氏度。该程序中使用的微型色谱柱填充有大约 10 厘米的 3 微米 lunar C 18 树脂，并与放置在 orbitrap 仪器对齐的 pro Zion 纳米电喷雾离子源连接。在肽分离过程中，使用 pro Zion 纳流二元 HPLC 泵提供约每分钟约 300 纳升的稳定尖端流速，以实现肽稀释，并根据样品复杂性建立有机缓冲液梯度。
对于该大肠杆菌 SPA 样品，流动相溶剂 A 具有 95% HPLC 梯度水和 5% 乙酰腈和 0.1% 甲酸，而溶剂 B 具有 5% HPLC 梯度水和 95% 乙酰腈和 0.1% 甲酸，使用数据库搜索算法（如 Seaquest）对照大肠杆菌蛋白序列数据库搜索谱图。使用概率算法（如 star quest）对结果进行统计过滤，以确保低错误发现率，SPA 标记的 RNA 聚合酶 sigma 因子和功能未知的牦牛 LA 蛋白与核心 RNA 聚合酶（包括 α β 和 β 主要亚基）以及 RNA 聚合酶回收因子共同纯化。与标记的 RNA 聚合酶 sigma 因子相反，yak L 还与必需的转录终止抗决定因子结合，表明在转录中具有特殊功能。
LCMS 还检测到其他几种较小的共纯化蛋白，这些蛋白在凝胶上不明显，包括 RNA 聚合酶 Omega 亚基和转录、终止和决定因子以及 USA 和 NUSD。相反，在标记硫机械动员的独立实验中，S-U-F-B-S-U-F-C 和 SUFD 相互共纯化，表明铁硫簇作为单个支架复合物共同参与。这个具有代表性的例子突出了这样一个事实，即先前经过充分研究的、高度注释的参与基本生物过程的细菌 MultiPro 复合物通常具有可以有效识别的新型相关成分。
使用这种方法，SUFB 蛋白的低拷贝数可能导致相对于从 SUFC 和 SUFD pull-down 实验中观察到的强强度信号强度较弱，以定义稳定的多单位蛋白质复合物的组成，通过考虑诱饵猎物的独特性，将共纯化分数分配给高置信度相互作用， 诱饵诱饵和猎物猎物关系。然后使用图形聚类过程，如 markoff 聚类算法。离散的蛋白质簇是从分区的概率 PPI 网络中识别出来的。
推定的相互作用网络可以使用 cyto scape 进行可视化。将蛋白质组学数据与基因组学方法推断的其他功能关联证据相结合，可用于研究先前注释的大肠杆菌蛋白的新机制作用。在这里，在大肠杆菌中定义了作为更广泛的功能邻域参与的蛋白质复合物和功能模块的子网。
主要分层集群 Graham 显示了功能孤儿的功能预测模式和现有注释，以及大肠杆菌的特征基因，黄色和蓝色分别代表现有和推断的功能，而阴影强度反映了置信度分数。与各种邻域相关的生物过程如右插图所示，显示了基于综合物理和功能交互网络相似性分数的代表性邻域的各个组成部分。观看本视频后，您应该对如何使用亲和纯化-质谱联用方法从大肠杆菌中分离出稳定的蛋白质复合物有了很好的了解。
原则上，该技术可用于表征膜蛋白复合物或来自任何其他物种的蛋白质复合物，以便尽可能地重组。
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概述
本研究提出了一种优化的序列肽亲和质谱（APMS）程序，用于分离和表征大肠杆菌中的蛋白质复合物。该方法允许识别蛋白质相互作用及天然MultiPro复合物的组成，即使来自低丰度蛋白质。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质组学
- 微生物学
背景
- 亲和纯化结合质谱分析对于绘制蛋白质相互作用图谱至关重要。
- 该研究聚焦于大肠杆菌。
- 低拷贝数蛋白可能难以分离。
- 序列肽亲和（SPA）标签增强了纯化效率。
研究目的
- 识别MultiPro复合物的蛋白质相互作用和亚基组成。
- 开发一种有效回收低丰度蛋白质复合物的方法。
- 展示双步骤纯化技术的有效性。
使用的方法
- 扩增序列特异性线性PCR产物。
- 将SPA标签和可选择标记整合到大肠杆菌中。
- 使用牛modlin和Anti-Flag亲和珠进行纯化。
- 胰蛋白酶消化后进行质谱分析以识别蛋白质。
主要结果
- 核心RNA聚合酶亚基与标记蛋白一起高效共纯化。
- 使用SPA方法发现了新的关联组件。
- 细胞裂解物的仔细处理对成功至关重要。
- 实验室技术员Olga Kagan和HBO Guo展示了该方法。
结论
- SPA APMS程序对于研究大肠杆菌中的蛋白质复合物是有效的。
- 该方法可以揭示生物过程中重要的相互作用和组成部分。
- 它为研究低丰度蛋白质的研究人员提供了一种可靠的方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction mapping in bacterial systems enables target validation and mechanistic de-risking for antimicrobial discovery. Sequential peptide affinity purification combined with mass spectrometry provides high-confidence interaction data that supports predictive confidence in pathway analysis. This approach facilitates portfolio triage by revealing novel components in well-studied complexes such as RNA polymerase and iron-sulfur cluster biosynthesis machinery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through systematic identification of stable protein complexes in E. coli.
- Operational Value: Supports biological de-risking by uncovering unexpected components in essential complexes like RNA polymerase.
- Scientific Value: Enhances target confidence by identifying co-purifying factors such as transcription termination anti-determination factors with functional implications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating reproducible interaction networks from chromosomally tagged strains.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG beads.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by producing quantitative mass spectrometry readouts with low nanogram detection limits.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance by linking E. coli complex architecture to orthologous gene products in pathogens with limited functional annotations.
- Operational Value: Ensures translational continuity by integrating PPI data with genetic and genomic-context predictions for pathway-level insights.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking of novel associations in conserved biological processes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing interaction data that informs mechanistic models and screening readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying stably co-purifying proteins such as SUFB, SUFC, and SUFD in iron-sulfur cluster biosynthesis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via mass spectrometry detection of low-abundance complexes after dual-step enrichment.
- Analytics: Enables comparative analysis through co-purification scoring and graph clustering (e.g., Markov clustering) to define high-confidence interactions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by revealing functional neighborhoods in E. coli that predict mechanistic roles in orthologous systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for genome-wide interaction mapping in recommengeering-capable bacterial strains.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in bacterial systems.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of affinity purification workflows across large-scale cultures.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antimicrobial programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated interaction networks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial recombineering, and affinity purification techniques.
- Dependent on instrumentation for sonication, centrifugation, and nanoLC-MS/MS systems with Orbitrap detection.
- Necessitates cross-team standardization of tag integration, lysis buffers, and purification conditions for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending the SPA-tag system to other bacterial species or pathogenic strains.
- Includes practical limitations such as the need for careful lysate processing to prevent loss of low-abundance complexes during multi-step purification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:47
Construction of Gene-specific SPA-tagging in E. Coli DY330 Strain
3:54
Culturing and Sonication
5:26
Affinity Purification
7:53
Proteolysis and Sample Preparation for Mass Spectrometry
9:38
Protein Identification by LTQ Orbitap Velos Mass Spectrometer
11:02
Results
14:27
Conclusion
