Name: 成人脑组织切片中钾离子选择性电极的制备、检测及应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学习在成年海马脑片中制备、校准和应用钾离子选择性微电极技术，用于定量测量诱发性钾离子浓度动态变化。该方法为研究中枢神经系统钾离子稳态的细胞与分子机制提供了金标准测量手段。

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Khakh 实验室由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 MH104069 支持。Mody 实验室由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 NS030549 支持。J.C.O. 感谢美国国立卫生研究院 T32 神经微环路培训项目（NS058280）的支持。

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会批准。所有小鼠均饲养在12小时光照-黑暗循环环境中，自由获取食物和饮水。ad libitum。所有动物健康状况良好，无明显行为学改变，未参与过先前的实验研究，并在光照周期期间被处死。实验数据均来自成年小鼠（所有实验使用6-8周龄小鼠）。
1. K的制备+ 选择性微电极
<ol>
	<li>硼硅酸盐玻璃的硅烷化
	<ol>
		<li>从包装中取出足够数量的玻璃毛细管，放入50 mL锥形管中。用1 M HCl将锥形管加满，将电极在HCl中轻轻振荡清洗过夜，或至少6小时。</li>
		<li>用70%乙醇短暂冲洗毛细管，然后在100–120 °C下彻底干燥6–8小时。将清洗后的毛细管储存于装有无水硫酸钙干燥剂的容器中，最多可保存4周，以备后续使用。</li>
		<li>在进行硅烷化前，使用微电极拉制仪将毛细管拉制成细尖端。我们所用的微电极尖端直径约为2–5微米。处理清洗后的毛细管时务必佩戴手套，因为皮肤上的油脂会干扰硅烷化过程。</li>
		<li>将微电极放入玻璃容器中，使其尖端悬空，避免接触底部造成破损。使用可高压灭菌胶带或类似粘性胶带将微电极固定在容器上。</li>
		<li>使用氮气置换法从容器中取出约0.5 mL的5%二氯二甲基硅烷（DDS）硅烷化溶液（参见图2）。将气球充满氮气，并在气球上连接带有针头的注射器或导管。将针头插入DDS容器的同时，通过另一根较长的针头将DDS吸入另一个注射器中。</li>
		<li>将硅烷化溶液逐滴加至移液管尖端，立即盖好容器。将装有微电极和硅烷化溶液的容器放入预热至170–180 °C的实验室烘箱中，孵育10–12小时；或在200–220 °C下处理30分钟。</li>
		<li>孵育结束后，关闭烘箱，然后将容器从烘箱中取出。取出时需格外小心，因为容器极热。将容器置于室温实验台面上静置10–15分钟，使玻璃器皿冷却。</li>
		<li>用刀片或手术刀片切断胶带，将微电极从容器中取出，并放入装有干燥剂的密封容器中。经硅烷化处理的微电极若保持干燥，可在处理后一周内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电极的预处理
	<ol>
		<li>配制K+离子载体混合液储备液：5% w/v 缬氨霉素，93% v/v 1,2-二甲基-3-硝基苯，2% w/v 四(4-氯苯基)硼酸钾11。该溶液呈淡黄色。应保存于密封、避光的容器中，室温存放。若储存得当，该溶液可稳定保存数月。</li>
		<li>配制10 mM HEPES缓冲的300 mM NaCl溶液（pH 7.4）。将电极固定在夹具上，使用连接注射器的28G微填充尖端从后端填充缓冲NaCl溶液。观察确认盐溶液已到达微电极尖端。检查微电极内部无大气泡，以免影响电流流动。</li>
		<li>使用刀片或手术刀的钝边，将电极尖端折断至直径约10–20 µm。</li>
		<li>使用微量移液器，在微电极尖端附近施加一小滴（约0.1 µL）K+离子载体溶液。若电极硅烷化处理成功，液滴将被破裂的尖端吸收。用K+离子载体填充电极尖端1–2 mm，并用滤纸吸除多余液体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. K的校准+ 选择性微电极
<ol>
	<li>校准溶液的配制
	<ol>
		<li>通过用 KCl 替代 NaCl，在等渗人工脑脊液（ACSF）中配制不同浓度的 KCl 溶液。我们使用 0.1、1、4.5、10 和 100 mM K+ ACSF 溶液对电极进行校准。这些校准溶液的配方列于表 1中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">化学物质</td>
			<td>MW&#160;</td>
			<td rowspan="2">终浓度 mM</td>
			<td rowspan="2">0.1 mM [K+]</td>
			<td rowspan="2">1 mM [K+]</td>
			<td rowspan="2">4.5 mM [K+]</td>
			<td rowspan="2">10 mM [K+]</td>
			<td rowspan="2">100 mM [K+]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(g / mol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>变化</td>
			<td>1.51 g</td>
			<td>1.50 g</td>
			<td>1.44 g</td>
			<td>1.4 g</td>
			<td>0.345 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>1 M 储液</td>
			<td>变化</td>
			<td>20 µl</td>
			<td>200 µl</td>
			<td>900 µl</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 M 储液</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">400 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 M 储液</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 µl  </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>119.98</td>
			<td>1.2</td>
			<td colspan="5">0.29 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>84.01</td>
			<td>26</td>
			<td colspan="5">0.437 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-葡萄糖</td>
			<td>180.16</td>
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0.360 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td colspan="7">加水定容至 200 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 钾标准校准溶液
<ol start="2">
	<li>微电极校准
	<ol>
		<li>实验开始前，所有溶液均需用 95% O2/5% CO2 气体至少鼓泡 20 分钟。以每分钟 3 mL 的流速开始向浴槽灌注含 4.5 mM [K+] 的人工脑脊液（ACSF）。将 K+ 选择性电极插入固定在操纵器电极头端的电极夹持器中。该头端连接至适当的放大器。将电极尖端插入灌流液中。</li>
		<li>确保 Ag/AgCl 接地电极浸没于相同溶液中，且灌流稳定。逐步施加校准液，并记录电极尖端间的电位变化（单位：mV）。每次更换校准液前，需等待电极尖端电位达到稳定值。</li>
		<li>测量施加校准液后电极尖端响应的稳态电压变化。确认电极响应斜率每单位 [K+] 对数变化至少为 52 mV，且不超过 58 mV。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 急性海马脑片的制备
<ol>
	<li>切片溶液的制备
	<ol>
		<li>配制500 mL蔗糖切割液，成分为：194 mM 蔗糖、30 mM NaCl、4.5 mM KCl、10 mM D-葡萄糖、1 mM MgCl2、1.2 mM NaH2PO4 和 26 mM NaHCO3，渗透压为290–300 mOsm，用95% O2 和5% CO2 饱和。</li>
		<li>配制1–2升记录液（人工脑脊液，ACSF），成分为：124 mM NaCl、4.5 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM D-葡萄糖、2 mM CaCl2、1.2 mM NaH2PO4 和 26 mM NaHCO3；pH值为7.3–7.4（通气后），渗透压为290–300 mOsm，用95% O2 和5% CO2 饱和。将装有脑片孵育室的烧杯中加入记录液，并维持在32–34 °C。将振动切片机腔室中加入冰水混合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>急性脑片制备
	<ol>
		<li>将小鼠置于预先充有2–3 mL异氟烷的密闭容器中，进行深度麻醉。检查趾夹反射，若无反应，则根据动物实验方案要求，使用锋利的剪刀或断头器迅速断头处死。</li>
		<li>使用剪刀从颅骨尾侧开始，沿中线剪开头皮，形成2–3 cm的切口。手动牵拉头皮的同时，从枕骨大孔处沿颅骨两侧各做一条长约1 cm的横向切口。然后使用精细剪刀，沿颅骨中线从后部至鼻部剪开一条与颅骨长度相当的切口。</li>
		<li>将精细镊子插入中线附近，将切开的颅骨向两侧分开。取出小鼠脑组织，使用刀片切除位于脑尾侧和头侧的小脑和嗅球。这些结构可通过其与大脑皮层之间明显的裂隙进行识别。</li>
		<li>使用速干胶将脑组织块固定在振动切片机的载物盘上。向振动切片机的托盘中加入冰冻的切割液。</li>
		<li>在冠状面上切割厚度为300 µm的组织切片。通常可获得6个冠状位海马脑片。</li>
		<li>每切完一片后，立即将脑片转移至预热至32–34 °C的孵育烧杯中。在该温度下孵育20分钟后，将烧杯移出并置于室温下至少20–30分钟，再进行电生理记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 电刺激诱发的K+动态变化的测量
<ol>
	<li>切片制备的设置
	<ol>
		<li>使用巴斯德移液管轻轻将脑切片放入浴槽中，并用带有尼龙丝的铂金弓形固定器轻轻固定切片位置。</li>
		<li>确保双极刺激电极的尖端相互平行，并与切片平面齐平。在约6-7秒的时间内缓慢将电极插入CA3区辐射层，深度约为40-50 µm，以刺激Schaffer侧支。在冠状切面中，CA3区大致可识别为海马体主体部分中位于海马膝部颗粒细胞层外侧的区域，而辐射层则位于锥体细胞层的内侧和腹侧。</li>
		<li>通过在约3-4秒内缓慢降低电极，将K+-选择性电极小心插入CA1区辐射层，深度约为50 µm。在对切片施加刺激前，需等待电极电位稳定：通常需要5至10分钟。如果切片表现出细胞外K+的自发性变化，则应弃用该切片，并使用新的切片重复此过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量诱发的K+释放
	<ol>
		<li>通过手动按压刺激器上的触发装置施加电刺激串（8个脉冲），同时进行反应的数字记录。刺激参数为10 Hz频率、1 ms脉宽，起始刺激强度为10 µA。</li>
		<li>以2倍递增的方式逐步提高刺激强度，直至检测到最大K+反应幅度。若未观察到任何反应，可将K+电极位置向刺激位点方向每次移动100 µm，逐步调整。</li>
		<li>确定产生半最大反应的刺激强度。根据我们的经验，该值通常在40-160 µA之间，具体取决于切片质量、动物年龄以及刺激电极与K+-选择性电极之间的距离。</li>
		<li>在同一脑切片上，使用比产生半最大反应低一个递增步长的刺激强度（例如，若80 µA产生半最大反应，则使用40 µA），施加脉冲数逐步增加的刺激串。初始实验中，我们采用的刺激串脉冲数依次为1、2、4、8、16、32、64和128&#160;个脉冲。</li>
		<li>为确认K+信号是由电刺激Schaffer侧支引发的动作电位所介导的，可在人工脑脊液（ACSF）中加入0.5 µM河豚毒素（TTX）孵育10分钟，然后重复刺激方案。此时不应观察到任何诱发反应。</li>
		<li>完成切片实验后，通过将电极重新在标定溶液中校准，确认电极的响应性是否保持稳定，确保其响应值与初始校准值的偏差不超过10%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>McDonough, A. A., Youn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+homeostasis%3A+The+knowns%2C+the+unknowns%2C+and+the+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Bethesda+Md%22%5BJournal%5D)">Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits.</a> Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).</li>
<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+channels+of+excitable+membranes%22">Ion channels of excitable membranes</a>. , Sinauer. Sunderland, MA. 507(2001).</li>
<li>Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+inactivation+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+%28Kir4.1+subunit%29+in+mice%3A+Phenotypic+impact+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina.</a> J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).</li>
<li>Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroglial+potassium+cycle+during+neurotransmission%3A+role+of+Kir4.1+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels.</a> PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137(2015).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).</li>
<li>Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide+and+DNA+aptamer+based+sub-nanomolar+potassium+detecting+optical+nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor.</a> Nanotechnology. 28 (32), 325502(2017).</li>
<li>Bandara, H. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-Mediated+Synthesis+of+a+Near-Infrared+Fluorescent+K%2B+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor.</a> J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).</li>
<li>Depauw, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+selective+potassium+sensor+for+the+detection+of+potassium+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Weinh+Bergstr+Ger%22%5BJournal%5D)">A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues.</a> Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).</li>
<li>Machado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofouling-Resistant+Impedimetric+Sensor+for+Array+High-Resolution+Extracellular+Potassium+Monitoring+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain.</a> Biosensors. 6 (4), (2016).</li>
<li>Rose, M. C., Henkens, R. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304416574902049">Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+glial+membrane+potentials+during+sleep+and+paroxysmal+oscillations+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex.</a> J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+K-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">The functional significance of K-complexes.</a> Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).</li>
<li>MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+optical+signals+in+the+rat+optic+nerve%3A+role+for+K%28%2B%29+uptake+via+NKCC1+and+swelling+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes.</a> Glia. 37 (2), 114-123 (2002).</li>
<li>Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Kir4.1+channel+in+excess+potassium+clearance%3A+an+in+vivo+study+on+anesthetized+glial-conditional+Kir4.1+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice.</a> J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).</li>
<li>Hall, D. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp9603039">Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects.</a> J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+Concentric+Microelectrodes+for+Measurement+of+Extracellular+Ion+Signals+in+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.</a> J Vis Exp. (103), e53058(2015).</li>
<li>Larsen, B. R., MacAulay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1-mediated+spatial+buffering+of+K%28%2B%29%3A+Experimental+challenges+in+determination+of+its+temporal+and+quantitative+contribution+to+K%28%2B%29+clearance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+Austin+Tex%22%5BJournal%5D)">Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain.</a> Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法使我们能够评估成年小鼠急性海马脑片中，施加谢弗侧支电刺激后 K+ 的动态变化。我们制备 K+ 选择性微电极的方法与先前报道的方案12,13,14,15 相似。然而，该方法相较于其他电极构型具有优势，即制备 K+ 选择性微电极的过程快速且简便。经过适当校准后，这些电极可在电刺激期间稳定地测量脑片中的 K+ 动态变化，且此类反应可被 TTX 阻断。&#160;在这些实验中，采用 80–160 µA、10 Hz 的刺激参数；然而，针对特定实验及目标脑区，需对刺激条件进行优化。所列数值仅作为参考。
电极响应的斜率应为每对数单位[K+] 58.2 mV。该数值可根据Nernst方程和Nicolsky-Eisenman方...

脑内的钾离子浓度受到严格调控，其浓度波动会显著影响所有细胞的静息膜电位。鉴于其关键作用，生物学的一个重要目标是明确在机体不同器官中用于精确调控细胞外空间K+浓度的细胞与生物物理机制1,2。在这些研究中，一个重要的前提是能够准确测量K+浓度。尽管在健康和疾病状态下参与脑内钾离子稳态的多种组分已被识别3,4,5，但由于制备用于钾离子检测的离子选择性微电极技术具有较高的专业性，相关研究进展受到限制。微电极传感器是体外（in vitro）、脑片以及活体（in vivo）条件下测量K+浓度的金标准。
目前，利用光学传感器监测 K+ 的新方法正在研发中，但这些方法尚不能检测生物学相关的 K+ 浓度范围，或尚未在生物系统中得到充分验证，尽管初步结果显示出一定前景6,7,8。与光学传感器相比，微电极本质上仅能对离子进行点源测量，尽管使用电极阵列可提高空间分辨率9。本文重点介绍用于监测 K+ 动态变化的单通道微电极传感器。
在本研究中，我们报告了使用缬氨霉素类钾离子载体制造钾离子（K+）选择性微电极的详细逐步操作流程。该离子载体可实现对钾离子的高度选择性（K+ 对 Na+ 的选择性达 104 倍），允许 K+ 跨膜高效传输10。缬氨霉素是一种天然存在的多肽，可作为允许 K+ 透过的孔道，促进 K+ 沿其电化学梯度流动。我们还描述了如何校准这些电极、如何储存和使用它们，以及最终如何将其应用于测量成年小鼠急性海马脑片中 K+ 浓度的动态变化。结合使用缺乏特定离子通道的基因修饰小鼠（这些通道被认为可调控细胞外 K+ 的动态），此类电极将有助于揭示神经系统用于调控细胞外环境中 K+ 基线浓度的细胞机制。

<table><tbody><tr><td>振动切片机</td><td>DSK</td><td>Microslicer Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>小鼠：C57BL/6NTac 近交系小鼠</td><td>Taconic</td><td>Stock#B6</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>电极拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl 接地电极颗粒</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP10.3</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>定制微管 28G 尖端</td><td>World precision instruments</td><td>CMF28G</td><td></td></tr><tr><td>钨棒</td><td>A-M Systems</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>双极刺激电极</td><td>FHC</td><td>MX21XEW(T01)</td><td></td></tr><tr><td>刺激隔离器</td><td>World precision instruments</td><td>A365</td><td></td></tr><tr><td>Grass S88 刺激器</td><td>Grass Instruments Company</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃移液管</td><td>World precision instruments</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>A/D 转换板</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>信号放大器</td><td>Multiclamp 700A 或 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>前置放大器头级</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳计算机</td><td>Dell</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>缬氨霉素</td><td>Sigma</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二甲基-3-硝基苯</td><td>Sigma</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>四(4-氯苯基)硼酸钾</td><td>Sigma</td><td>60591-100mg</td><td></td></tr><tr><td>5% 二甲基二氯硅烷庚烷溶液</td><td>Sigma</td><td>85126-5ml</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>移液管显微操作器</td><td>Sutter</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

制备、检测和使用成年脑组织切片中的钾离子选择性微电极

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

钾离子对细胞静息膜电位具有显著贡献，因此细胞外 K+ 浓度是细胞兴奋性的关键调节因素。细胞外K⁺浓度的改变+ 通过改变介导动作电位起始和传导的电压门控离子通道在关闭态、开放态和失活态之间的平衡，影响静息膜电位和细胞兴奋性。因此，直接测量细胞外K⁺浓度具有重要意义+ 健康与疾病状态下的动力学。在此，我们描述了如何制备、校准和使用单极性K+选择性微电极。我们将它们应用于成年海马脑片，以测量电刺激诱发的K+ 浓度动态。合理使用此类电极是评估调控细胞外K⁺的细胞与生物物理机制所需工具包中的重要组成部分。+ 神经系统中的浓度。

为了选择性测量细胞外 K+，我们通过将洁净的硼硅酸盐玻璃移液管进行硅烷化处理，制备了带有疏水层的离子选择性微电极（图 1A）。该涂层可使含有缬氨霉素的 K+ 离子载体停留在电极尖端，并仅允许 K+ 通过电极尖端的微小开口进行通透（图 1B）。在用填充的生理盐水溶液和 K+ 离子载体对电极进行预处理后，可在生理盐水或人工脑脊液（ACSF）中，根据能斯特方程2的预测，检测电极对浴液中 K+ 浓度逐步变化的快速且线性响应（图 3A），以及在标定范围内对浴液 K+ 浓度变化的响应情况（图 3B）。可通过将稳态电位的变化值对浴液 K+ 浓度作图，以...

钾离子参与&#160;细胞静息膜电位和细胞外K+ 浓度是细胞兴奋性的关键调节因素。我们介绍了如何制备、校准和使用单极K⁺+选择性微电极。使用此类电极可测量电刺激诱发的K⁺+ 成年海马脑片中的浓度动态

钾离子对细胞静息膜电位具有显著影响，因此细胞外 K+ 浓度是一个关键的调节因子……

该技术的总体目标是制备、校准并使用单极性钾离子选择性微电极。利用此类电极可对成年动物脑片中诱发的钾离子浓度动态进行定量评估。该方法有助于回答生理学领域的关键问题，例如揭示中枢神经系统中钾离子稳态的细胞与分子机制。该技术的主要优势在于，除了是一种简便直接的制备方法外，微电极传感器还是测量钾离子浓度的金标准。为准备用于硅烷化的硼硅酸盐玻璃毛细管，将其放入一个50毫升的锥形管中。向锥形管中加入1摩尔盐酸，将玻璃毛细管置于盐酸中，在温和振荡条件下孵育至少六小时，最好过夜。随后，用70%乙醇短暂冲洗毛细管，然后在100至120摄氏度下完全干燥六到八小时。将清洗后的毛细管置于含有无水硫酸钙干燥剂的容器中，最多可保存四周以备后续使用。在进行硅烷化处理前，使用微电极拉制仪将毛细管拉制成细尖端。然后，使用可耐受高压灭菌的胶带将微电极固定在玻璃容器内，使电极悬空于底部之上，以防止尖端破损。接着，采用氮气置换法从原容器中取出约 0.5 毫升的 5% DDS 硅烷化溶液。将气球充满氮气，并在气球上连接带有针头的注射器或导管。然后，将针头插入DDS容器中，同时使用较长的针头将DDS抽入另一支注射器内。随后，将硅烷化溶液逐滴加至移液管的尖端，并立即盖上容器。将装有微电极和硅烷化溶液的容器置于预热的实验室烘箱中，在170至180摄氏度下孵育10至12小时，或在200至220摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，将培养板从烘箱中取出。将培养板置于室温下的实验台上静置10至15分钟，使玻璃器皿冷却。从培养板中取出微电极，并将其放入装有干燥剂的密封容器中。经过硅烷化处理的微电极若保持干燥，可在硅烷化后一周内使用。为活化电极，需配制钾离子载体混合液的储备液，并将其置于密闭不透光的容器中，室温保存。随后，配制 pH 7.4 的 10 毫摩尔 HEPES 缓冲液，其中含 300 毫摩尔氯化钠。将电极固定在夹具上。随后，使用钝头工具将电极尖端刮至大约 10 到 20 微米宽，然后使用连接在注射器上的 28 号 MicroFil 尖端，用 HEPES 缓冲的氯化钠溶液反向填充电极。观察生理盐水溶液是否已到达微电极尖端末端，并确保微电极内无较大气泡，以免干扰电流流动。使用微量移液器，在微电极尖端附近加入一小滴钾离子载体。如果电极已正确进行硅烷化处理，液滴将被吸入断裂的尖端内。用钾离子载体填充电极至约1毫米深度，并用滤纸吸去多余液体。为校准微电极，实验开始前至少20分钟，需用95%氧气/5%二氧化碳气体对所有校准液和脑片缓冲液进行通气。开始以每分钟3毫升的流速向浴槽中灌注含有4.5毫摩尔钾离子的ACSF溶液。将钾离子选择性电极插入固定在操纵器电极头级上的电极 holder 中。然后，将电极的尖端插入浴式灌流液中。确保银/氯化银接地电极也浸没在相同的溶液中，并保持液体流动稳定。逐步施加校准溶液，并记录电极尖端两侧以毫伏为单位的电位变化。在切换至下一种溶液之前，等待电极尖端的电位达到稳定值。随后，测量校准溶液作用于电极尖端时的稳态电压变化。确认电极电压响应的斜率每十倍钾离子浓度变化至少为52毫伏，且不超过59毫伏。为制备海马切片，从颅骨尾部开始沿中线切开皮肤，切口长度为2至3厘米。手动牵开皮肤后，从枕骨大孔处沿颅骨两侧各做一条长约1厘米的横向切口。然后，使用精细剪刀从颅骨后部沿中线向前剪至鼻部。接下来，将精细镊子插入中线附近，将切开的颅骨分为两部分并进行牵拉。从颅骨中取出小鼠脑组织，使用刀片切除位于脑后部和前部的分别对应的小脑、前额叶皮层和嗅球。然后，使用超级胶水将脑组织块固定在振动切片机的载物盘上。用冰冷的切割液填充振动切片机托盘。随后，在冠状面上将组织切成300微米厚的切片。通常可收集到4至6片冠状海马切片。每切完一个脑片后，立即将其转移至预热至32至34摄氏度的切片保存烧杯中。将脑片在此温度下孵育20分钟，随后将装有脑片的烧杯转移至室温环境中，继续孵育至少20至30分钟，然后再进行记录。为检测钾离子动态变化，使用巴斯德移液管轻轻将脑片放入浴槽中，并用带有尼龙丝的铂金网格稳定固定脑片位置。确保双极刺激电极的尖端彼此大致平行，并与脑片平面齐平。在5到7秒的时间内，缓慢将电极插入CA3区辐射层，深度约为40至50微米，以刺激Schaffer侧支。随后，在约3到4秒内缓慢下降，将钾离子选择性电极小心插入CA1区辐射层，深度约为50微米。在对脑片施加刺激之前，需等待电极间的电位稳定，通常需要5到10分钟。如果脑片表现出过度的细胞外钾离子浓度自发变化，则应弃用该脑片，并使用新的脑片重复实验。为测量诱发的钾离子释放，通过刺激隔离器施加电刺激串，同时对反应信号进行数字记录。以10赫兹频率、每脉冲1毫秒、起始刺激强度为10微安培的参数开始施加刺激。以2倍递增的方式逐步增加刺激强度，直至检测到最大钾离子反应幅度。若未观察到反应，则将钾离子选择性电极的位置向刺激位点方向每次移动100微米，逐步调整。为了证实钾离子浓度的变化是由电刺激激活的Schaffer侧支产生动作电位所介导的，可在灌流液中加入0.5微摩尔的河豚毒素（TTX）于ACSF中，持续灌流10分钟，然后重复刺激方案。此时应无法记录到诱发反应。在用回填的HEPES缓冲盐溶液和钾离子载体对电极进行预处理后，可检测电极对浴液中钾离子浓度阶梯式变化的快速响应能力，以及在0.1至100毫摩尔的校准范围内，钾离子浓度变化所引起的线性响应，该响应特性应符合能斯特方程的预测。可以通过绘制稳态电位与浴液中钾离子浓度的关系曲线来确定曲线的斜率，该斜率应约为58.2毫伏，且每增加十倍钾离子浓度时不应低于52毫伏。进一步测试了钾离子选择性电极的响应性，观察到当钾离子浓度增加5.5毫摩尔时，其上升和衰减的时间常数均约为85毫秒。当刺激电极和钾离子选择性电极已置入组织，并且记录信号达到稳定基线后，即可施加电流强度逐渐增加的脉冲刺激。该活动的波形表现为钾离子快速上升并伴随指数衰减，此现象在应用河豚毒素（TTX）后消失。一旦掌握该技术，若操作仔细准确，整个过程大约需要三到四小时。在进行该操作时，需注意保持电极尖端尽可能细小，以实现精确记录，同时又需足够大以降低噪声。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

成人脑组织切片中钾离子选择性电极的制备、检测及应用

本实验方案旨在建立并维持一种新皮层脑片的器官型培养体系，以便对锥体神经元进行电生理记录。...

从新皮层脑片培养标本进行全细胞记录

我们采用膜片钳技术来测量GABA激活的单通道电流（GABAA通道，GABAA受体）及其在神经元中产生的突触电流和紧张性电流。通道的激活可降低神经元在健康和疾病状态下的兴奋性1,2,3,4。...

大鼠脑切片中GABA激活的单通道电流和紧张性电流

首先通过电生理学方法对神经元进行表征，然后吸出记录电极内神经元的胞质，进行逆转录-PCR分析，以检测神经递质合成酶、离子通道和受体的mRNA表达情况。...

使用单细胞RT-PCR技术分析黑质神经元中电压门控钾通道mRNA的表达谱

该视频展示了对小鼠冠状海马脑片进行电刺激后诱发的钾离子浓度动态变化。将双极刺激电极插入海马CA3区的辐射层，同时将钾离子选择性电极置于CA1区的辐射层。电刺激引发动作电位，导致钾离子释放。最后，在存在抑制性分子的情况下，诱发的钾离子反应消失，证实了钾离子浓度的动态变化源于Schaffer侧支中的动作电位产生。...

冠状海马脑片中诱发电位钾离子浓度动态的测量

本视频演示了如何利用离子选择性微电极和电泳微电极测量并比较电信号，以表征脑切片中的细胞外间隙。该过程有助于确定细胞外间隙的体积分数及其迂曲程度。...

利用离子选择性微电极与离子电渗微电极表征脑切片中的细胞外空间

我们建立了一种脑切片模型，可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤所涉及的分子机制。 该技术可获得具有活性的成熟脑组织，在部分保留神经元回路、细胞间相互作用及突触后区室的同时，减少了实验所需的动物数量。...

脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法 体外 卒中模型

在急性脑切片中对突触连接的神经元进行膜片钳记录和同时的细胞内生物胞素填充，可实现其结构与功能特性的相关联分析。本方案的目的是描述从神经元微环路进行电生理记录及其后续形态学分析的关键技术步骤。...

利用成对膜片钳记录技术对急性脑切片中神经元微环路的电生理学与形态学特征进行表征

我们演示了两种用于测量脑组织中离子浓度的离子选择性微电极（双管型和同心型）的制备、校准及其特性。随后在小鼠海马脑片制备中应用这些电极，证明了兴奋性活动会同时改变细胞外钾离子和钠离子浓度。...

用于测量脑组织中细胞外离子信号的双管微电极与同心微电极

本方案演示了一种优化方法的实施...

使用优化方法制备急性脑切片 N甲基-D-葡糖胺保护回收法

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，能够迅速响应其环境变化并发生形态学改变。本方案描述了如何利用双光子显微镜研究小鼠急性脑切片中小胶质细胞突起向血清素或三磷酸腺苷（ATP）的趋化反应。...

双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

本文介绍了一种制备成人人类脑组织游离式脑片培养的实验方案。该方案是广泛使用的膜插件脑片培养法的一种改进，操作简便且成本较低，适用于开展旨在揭示与年龄相关脑疾病中神经退行性变机制的短期检测实验。...

成人脑组织短期游离式脑片培养

学习在成年海马脑片中制备、校准和应用钾离子选择性微电极技术，用于定量测量诱发性钾离子浓度动态变化。该方法为研究中枢神经系统钾离子稳态的细胞与分子机制提供了金标准测量手段。

制备、检测和使用成年脑组织切片中的钾离子选择性微电极

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