成人脑组织切片中钾离子选择性电极的制备、检测及应用

该技术的总体目标是制造、校准和使用单极钾离子选择性微电极。使用这种电极可以定量评估成人脑切片中诱发的钾离子浓度动力学。这种方法可以帮助回答生理学中的关键问题，例如确定中枢神经系统中钾离子稳态的细胞和分子机制。

该技术的主要优点是，微电极传感器除了是一种简单明了的制造方法外，还代表了钾离子浓度测量的黄金标准。要制备用于硅烷化的硼硅酸盐玻璃毛细管，请将它们放入 50 毫升锥形管中。用一摩尔盐酸填充锥形管，并将玻璃毛细管在盐酸中孵育过夜，轻轻搅拌至少 6 小时。

然后，用 70% 乙醇短暂冲洗毛细血管，然后在 100 至 120 摄氏度下完全干燥 6 至 8 小时。将洗涤后的毛细管储存在装有无水硫酸钙干燥剂的容器中长达 4 周，然后再使用。在硅烷化之前，使用微电极拉出器将毛细管拉到细尖。

然后，使用可高压灭菌胶带将微电极放入玻璃容器中，以便电极从底部升高以防止尖端破损。接下来，使用氮置换法从其容器中取出大约 0.5 毫升的 5% DDS 硅烷化溶液。用氮气填充球囊，然后将注射器或管子和针头连接到球囊上。

然后，将针头插入 DDS 容器中，同时通过较长的针头将 DDS 吸入单独的注射器中。随后，将硅烷化溶液滴加到移液器的尖端并立即覆盖容器。将装有含硅烷化溶液的微电极的容器放入预热的实验室烘箱中，在 170 至 180 摄氏度下放置 10 至 12 小时，或在 200 至 220 摄氏度下放置 30 分钟。

孵育后，从烘箱中取出板。将板放在室温下的长凳上 10 到 15 分钟，让玻璃器皿冷却。从板中取出微电极，并将它们放入装满干燥剂的密封容器中。

硅烷化微电极保持无水分，在硅烷化后可使用长达一周。为了灌注电极，准备钾离子载体混合物的储备溶液，并在室温下将其保存在密封、不透明的容器中。接下来，制备 pH 值为 7.4 的 10 毫摩尔 HEPES 缓冲 300 毫摩尔氯化钠储备液。

将电极固定在夹子中。随后，使用钝器将电极尖端耙至约 10 至 20 微米宽，然后使用连接到注射器的 28 号 MicroFil 尖端，用 HEPES 缓冲氯化钠回填电极。观察盐水溶液是否已到达微电极尖端的末端，并确保微电极没有可能干扰电流流动的大气泡。

使用微量移液器，在微电极尖端附近滴一小滴钾离子载体。如果电极已正确硅烷化，液滴将被吸收到破损的尖端中。用钾离子载体将电极填充至约 1 毫米，并用纸巾去除多余的部分。

要校准微电极，请在开始实验前将所有校准和切片缓冲溶液与 95%氧气/5% 二氧化碳一起泡泡至少 20 分钟。开始以每分钟 3 毫升的速度用 4.5 毫摩尔含钾离子的 ACSF 灌注浴液。将钾离子选择性电极放入连接到机械手电极头上的电极支架中。

然后，将电极的尖端插入浴灌注液中。确保银/氯化银接地电极浸泡在相同的溶液中，并且流量稳定。逐步应用校准溶液，并记录电极尖端的微伏电位变化。

等待电极尖端的电位达到稳定值，然后再切换到下一个解决方案。然后，测量响应校准溶液施加到电极尖端的稳态电压变化。确认电极电压响应的斜率至少为 52 且钾浓度每变化 10 倍不超过 59 毫伏。

要准备海马切片，请从颅骨的尾部切开 2 到 3 厘米，沿中线切开头皮。在手动缩回头皮的同时，沿着颅骨两侧从枕骨大孔做两个一厘米的水平切口。然后，使用细剪刀，沿着从颅骨后部到鼻子的中线切开一个切口。

接下来，在中线附近插入细镊子，并将切开的头骨分成两部分缩回。从颅骨中取出小鼠大脑，用刀片去除分别位于大脑尾部和喙部的小脑、前额叶皮层和嗅球。然后，使用 Super Glue 将脑阻滞剂安装到振动切片机托盘上。

用冰冷的切割溶液填充振动切片机托盘。之后，在冠状平原上以 300 微米的厚度切割组织切片。通常可以收集 4 到 6 个冠状海马切片。

切开每个切片后，立即将切片转移到加热至 32 至 34 摄氏度的盛片烧杯中。将切片在此温度下保持 20 分钟，然后在记录前将带有切片的烧杯移至室温至少 20 至 30 分钟。要测量钾离子动力学，请使用巴斯德移液管轻轻地将脑切片放入浴中，然后用带有尼龙弦的铂琴轻轻将其固定到位。

确保双极刺激电极的尖端彼此大致平行，并与切片的平面齐平。在 5 到 7 秒的过程中，将电极缓慢插入大约 40 到 50 微米深的 CA3 放射层，以刺激 Schaffer 侧支。然后，小心地将钾离子选择性电极插入 CA1 放射层，在大约 3 到 4 秒内缓慢下降，深度约为 50 微米。

在对切片施加刺激之前，让电位在电极上稳定下来，这通常需要 5 到 10 分钟。如果切片表现出细胞外钾离子浓度的过度自发变化，请丢弃并用新的切片重复该过程。为了测量诱发的钾离子释放，通过刺激隔离器施加一系列电刺激，同时以数字方式记录反应。

以 10 赫兹的频率施加刺激，从 10 微安的刺激幅度开始，每个脉冲 1 毫秒。将刺激幅度增加 2 倍，直到检测到最大的钾反应幅度。如果未观察到响应，则以 100 微米的增量将钾离子选择性电极的位置移近刺激部位。

为了确认钾离子浓度变化是由电激活的 Shaffer 侧支的动作电位放电介导的，在 ACSF 中浸泡 0.5 微摩尔 TTX 10 分钟，然后重复刺激方案。不应观察到诱发反应。用回填的 HEPES 缓冲盐水溶液和钾离子载体灌注电极后，可以按照能斯特方程预测的方式，在 0.1 至 100 毫摩尔校准范围内测试电极对浴中钾离子浓度逐步变化的快速响应，以及对浴中钾离子变化的线性响应。

稳态电位可以根据浴钾离子浓度绘制成图，以确定线路的斜率，该斜率应约为 V 58.2 毫伏，钾离子浓度每变化 10 倍不小于 52 毫伏。进一步测试了钾选择性电极的响应性，观察到对钾增加 5.5 毫摩尔的响应，上升和衰减时间常数约为 85 毫秒。一旦刺激电极和钾离子选择性电极被放入组织中并且记录达到稳定的基线，就可以应用电流幅度增加的脉冲。

这种活性的波形表现为钾的快速增加和指数衰减率，这在 TTX 应用中被消除。一旦掌握，如果小心准确地执行，这项技术可以在大约三到四个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住保持电极尖端尽可能小，以实现准确的记录，但又要足够大以允许低噪声。