Name: 用优化的n-甲基 d-葡乙胺保护恢复法制备急性脑切片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 了解优化的N-甲基-D-葡乙胺保护恢复法制备急性脑切片技术，用于神经科学电生理学研究。该方法可提高神经元存活率，适用于不同年龄动物及人脑组织，为膜片钳记录提供高质量样本。

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本工作由艾伦脑科学研究所资助。作者谨此感谢艾伦研究所的创始人保罗·G·艾伦（Paul G. Allen）和乔迪·艾伦（Jody Allen）的远见卓识、鼓励与支持。我们还要感谢艾伦研究所的技术支持人员在动物护理、饲养和基因分型方面所做的工作。

涉及转基因小鼠的操作已获得艾伦脑科学研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本实验使用了雄性和雌性C57BL/6小鼠（体重范围为10-30 g）。部分代表性结果描述了从活体人脑切片中收集的数据。新皮质组织样本是在进行肿瘤切除的神经外科手术期间获得的。为了接触到病变组织，有必要切除覆盖其上的新皮质组织。在所有情况下，均按照瑞典医疗中心机构审查委员会批准的方案，获得了患者同意将其神经外科手术组织用于科研的知情同意。
1. 培养基与试剂的准备（表1）
注意：溶液应使用不含痕量金属及其他杂质的纯化水配制。建议在实验当天新鲜配制溶液，但若需要，未使用的溶液可在 4 °C 保存最多 1 周。上述每种配方配制 1 L 可满足 1–2 次切片操作的需求。所有 aCSF 溶液在使用前必须用碳氧混合气（95% O2/5% CO2）饱和，以确保稳定的 pH 缓冲能力和充分的氧合。所有溶液的 pH 应调节至 7.3–7.4，渗透压应测定并调节至 300–310 mOsmol/kg。
<ol>
	<li>配制NMDG-HEPES人工脑脊液（aCSF，单位：mM）：92 NMDG、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、2 硫脲、5 Na-抗坏血酸、3 Na-丙酮酸、0.5 CaCl2·2H2O 和 10 MgSO4·7H2O。用17 mL ± 0.5 mL的5 M盐酸将pH值滴定至7.3–7.4。 
	注意：理想情况下，应在加入二价阳离子之前完成该滴定步骤，以避免沉淀；然而，若发生沉淀，在将pH调整至生理范围后可逆转沉淀现象。</li>
	<li>配制HEPES保存用人工脑脊液（aCSF，单位：mM）：92 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、25 葡萄糖、2 硫脲、5 Na-抗坏血酸、3 Na-丙酮酸、2 CaCl2·2H2O 和 2 MgSO4·7H2O。滴加数滴浓10 N NaOH，将pH值调至7.3–7.4。</li>
	<li>配制记录用人工脑脊液（aCSF，单位：mM）：124 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、24 NaHCO3、12.5 葡萄糖、5 HEPES、2 CaCl2·2H2O 和 2 MgSO4·7H2O。滴加数滴浓10 N NaOH，将pH值调至7.3–7.4。</li>
	<li>配制Na+加标溶液（2 M）：将580 mg NaCl溶解于5 mL新配制的NMDG-HEPES aCSF中。该体积足够一次脑片制备使用。</li>
	<li>配制用于组织包埋的2%琼脂糖。将2 g 1B型琼脂糖（见材料表）溶于100 mL 1× PBS中，微波加热至刚好沸腾。轻轻摇动混匀，然后倒入无菌的10 cm培养皿中，静置使其凝固。将琼脂糖平板置于密封塑料袋中，4 °C保存备用。</li>
	<li>配制注射用麻醉剂工作液。将2.5 g 2,2,2-三溴乙醇与5 mL 2-甲基-2-丁醇混合，然后逐渐溶于200 mL PBS（pH 7.0–7.3）中。使用前用0.22 µm滤器过滤，并避光保存于4 °C。 
	注意：关于麻醉剂工作液的有效期及废弃处理程序，请参照相关动物使用委员会的指南与规定。</li>
</ol>
2. 切片工作站的设置
<ol>
	<li>使用组织切片机和外科器械设置切片工作站（参见材料表）。为校准切片机，使用快干胶将氧化锆陶瓷切割刀片固定在刀臂上，然后插入样本架，并将刀片前缘与样本架边缘对齐，留出微小间隙，以确保刀片不会刮擦金属表面。 
	注意：若刀片边缘未发生物理损伤，可在数周甚至数月内重复使用而无需更换。市面上有多种型号的组织切片机，许多型号在经过优化校准后均可提供优异性能。理想的仪器应具有最小的Z轴偏转，可通过直接测量调节或经验观察实现。</li>
	<li>准备一个250 mL烧杯，加入200 mL NMDG-HEPES aCSF溶液，并置于冰上预冷，同时通过浸入培养液中的气体扩散石持续通入碳合气（carbogen），时间不少于&#62;10分钟。 
	注意：该溶液将用于心脏灌注以及切片过程中填充切片机储液槽。</li>
	<li>设置初始脑片恢复室，加入150 mL NMDG-HEPES aCSF（保持持续碳合气通入），并将恢复室置于恒温水浴中，温度维持在32–34 °C。 
	注意：建议采用Edwards和Konnerth（1992）52设计的切片恢复室。此类恢复室可使用常见实验器材自制（250 mL烧杯、尼龙网筛、50 mL锥形管、35 mm塑料培养皿）。需特别注意确保切片网筛不附着气泡，尤其是碳合气扩散石持续产生的气泡，这些气泡可能导致脑片上浮并受损。网筛应浸没于液面下约1 cm处。</li>
	<li>准备脑片保存室；建议使用具有多个独立孔井的大容量储液装置（参见材料表）。向储液槽中加入450 mL HEPES aCSF，并在持续通入碳合气条件下升温至室温，待用。 
	注意：脑片将在电生理记录前从初始恢复室转移至此保存室进行长期储存。必须始终确保切片网筛无气泡附着。</li>
	<li>准备用于组织包埋的熔融琼脂糖。使用50 mL锥形管的开口端作为模具，从预先制备的琼脂糖平板中切取一块2%琼脂糖。将锥形管盖松松盖上，微波加热10–30秒，直至琼脂糖完全熔化，避免过热。</li>
	<li>将熔融琼脂糖倒入1.5 mL离心管中。使用设定为42 °C并剧烈振荡的恒温混匀仪保持琼脂糖处于熔融状态。需小心操作，防止琼脂糖提前凝固。</li>
	<li>将切片机的辅助冷却块置于冰上进行预冷。</li>
</ol>
3.&#160;经心灌注
注意：在处理成年动物时，经心脏灌注是一项重要步骤，可通过向脑部灌注低钠（Na+）、低钙/高镁（Ca2+/Mg2+）人工脑脊液（aCSF）实现脑组织的快速冷却并减缓代谢。经心脏灌注还可清除脑血管中的红细胞，从而减少自发荧光，避免对转基因品系中荧光标记细胞群体的观察与定位造成干扰。不建议省略经心脏灌注步骤。
<ol>
	<li>通过腹腔注射麻醉工作液（250 mg/kg：每10 g体重注射0.2 mL的1.25%麻醉工作液，参见材料表）对小鼠进行深度麻醉。约2–3分钟后，通过检测脚趾夹捏反射判断麻醉深度是否足够。如有必要，追加一定量的麻醉工作液，并在2–3分钟后再次检测脚趾夹捏反射。</li>
	<li>从预冷的250 mL烧杯（最佳温度为2–4 °C，避免使用冰沙状或冻结的溶液）中吸取25 mL充有碳合气体的NMDG-HEPES aCSF，装入30 mL注射器。安装一支25 5/8规格的针头。</li>
	<li>将小鼠仰卧固定，用针固定前肢和后肢以保持稳定。使用装有硬化硅胶的15 cm玻璃培养皿作为基底效果良好。</li>
	<li>使用手术刀在膈肌水平处做侧向切口，打开胸腔。使用精细剪刀剪开两侧肋骨，注意避免损伤心脏和肺组织。</li>
	<li>将肋骨中央部分向后固定，暴露心脏。将30 mL注射器的针头插入左心室，同时用精细剪刀剪开右心房，以使血液从心脏流出。</li>
	<li>用手施加持续压力推动注射器活塞，以约10 mL/min的速度用预冷的NMDG-HEPES aCSF灌注动物。 
	注意：若灌注成功，肝脏颜色将由深红色变为浅黄色，有时在操作接近结束时可观察到清亮液体从鼻孔流出。</li>
</ol>
4.&#160;脑组织解剖与切片
<ol>
	<li>将动物断头。使用解剖刀切开头部皮肤，暴露颅骨帽。</li>
	<li>使用精细的超剪剪除颅骨帽上方的皮肤，并在颅骨后腹侧基部两侧做小的侧向切口。从颅骨后背侧开始，沿背侧中线向前端方向进行额外的浅层切割，注意不要损伤下方的大脑组织。在嗅球水平处，垂直于中线做最终的“T”形切口。 
	注意：必须小心操作，确保不损伤目标脑区。尤其应注意，任何时候均不得对大脑本身施加任何压迫性力量。</li>
	<li>使用圆头镊子从颅骨前端中线处开始夹住颅骨，向后外侧方向剥离。两侧重复此操作，以打开并移除颅骨背侧半部，暴露大脑。轻轻将完整的大脑舀入盛有预冷NMDG-HEPES aCSF的烧杯中。让大脑均匀冷却约1分钟。</li>
	<li>使用大刮铲将大脑从烧杯中取出，置于铺有滤纸的培养皿上。根据所需的切片角度和目标脑区，修剪并修整脑组织。操作应迅速，以避免在处理过程中长时间缺氧。 
	注意：可采用多种切片角度。具体的修块方法和切片角度取决于所研究的特定脑区、细胞类型及神经环路。</li>
	<li>使用粘合胶将脑组织块固定在样品托上。将样品托的内芯部分回缩，使脑组织块完全收入其中。将熔化的琼脂糖直接倒入样品托中，直至完全覆盖脑组织块。将预冷的辅助冷却块夹紧在样品托周围约10秒，直至琼脂糖完全凝固。</li>
	<li>将样品托插入切片机的插槽中，并确认其位置对齐。用250 mL烧杯中剩余的预冷且充氧的NMDG-HEPES aCSF填充储液槽，并将气泡石放入储液槽中，持续供氧直至切片完成。</li>
	<li>调节微米计，开始推进包埋在琼脂糖中的脑组织样本。启动切片机，并根据经验将推进速度和振荡频率调节至理想水平。 
	注意：两个参数均应设置在较低范围内。为获得最佳效果，刀臂单次行程应耗时约20秒，振荡应产生非常平滑且轻柔的嗡鸣声，不应出现明显的嗡嗡声。</li>
	<li>以300 µm（或其他设定厚度）为增量持续推进并切片，直至目标脑区被完全切完；整个切片过程总时长应少于15分钟。</li>
</ol>
5. 优化的NMDG保护性恢复步骤
<ol>
	<li>初始NMDG恢复步骤（关键步骤）：切片完成后，使用截断的塑料巴斯德移液管收集所有切片，并将其转移至已预热（34 °C）的初始恢复室中，该恢复室内含有150 mL NMDG-HEPES aCSF溶液。尽快连续转移所有切片，并在所有切片完全转移至恢复室后立即启动计时器。</li>
	<li>参考表2，根据小鼠年龄确定最佳的Na+梯度添加方案。 
	注意：该程序是一种实现Na+在脑片培养室中受控速率重新引入的实用方法，已针对特定脑片培养室的几何结构、储液体积和类型进行优化（见材料表）。</li>
	<li>按照指定时间加入指定体积的Na+添加溶液，执行分步Na+梯度添加程序。将Na+添加溶液直接加入初始恢复室的鼓泡管中，以促进快速混合。</li>
	<li>将所有切片转移至室温维持的HEPES aCSF长期保存室中。在开始膜片钳记录实验前，让切片在HEPES保存室中继续恢复1小时。</li>
</ol>
6. 膜片钳记录
注意：以下基本操作步骤仅提供一些实际考虑因素，并非旨在作为膜片钳记录的详细方案，详细的方案可参见其他文献53,54。本应用需要配备膜片钳电生理系统。该系统通常包括一台配备红外微分干涉差（IR-DIC）光学装置和荧光照明系统的直立显微镜、膜片钳放大器和数据采集系统、电动显微操作器和显微镜载物台、隔振台、法拉第笼，以及溶液加热和灌流系统。样本记录室和载物台应设计为适用于浸没式脑片记录。对于多神经元膜片钳记录，需要配备多个放大器、探头级装置和高质量显微操作器的系统。此外，为获得最佳效果，强烈推荐系统配备900 nm红外带通滤光片及匹配的光学组件，以确保能够清晰观察位于脑片深度&#62;50 µm处的细胞。正确调节科勒照明对于清晰成像也至关重要。
<ol>
	<li>配制细胞内电极液（单位：mM）：130 K-葡萄糖酸盐，4 KCl，10 HEPES，0.3 EGTA，10 磷酸肌酸钠2，4 MgATP，0.3 Na2-GTP 和 13.4 生物胞素。用 1 M KOH 调节 pH 至 7.35，并根据需要使用蔗糖将渗透压调节至 285–290 mOsmol/kg。</li>
	<li>使用厚壁硼硅酸盐玻璃毛细管制备膜片钳电极；理想的膜片钳电极应具有相对较短且粗短的锥形，浸入浴液中时电极尖端电阻约为 3–6 MΩ。</li>
	<li>确保银电极丝经过适当的氯化处理，以保证记录的稳定性。通常可通过将银丝末端3-4 mm浸入液体漂白剂中约30分钟，或直至银丝表面变黑来实现。</li>
	<li>使用蠕动泵以3–4 mL/min的流速建立灌流系统。将通入碳氧气体的记录用人工脑脊液（aCSF）循环通过记录室，注意调节进液与出液流速一致，以防止溢出。</li>
	<li>将单个脑切片转移至浸没式记录室中，并使用带有尼龙横线的U形切片固定锚将其固定。先用4倍空气物镜识别目标脑区，然后切换至更高倍率的物镜例如，高数值孔径40X或60X水浸物镜）。</li>
	<li>通过红外微分干涉差显微镜（IR-DIC）观察神经元胞体膜的形态，以判断目标细胞是否适合进行膜片钳记录。选择外观健康的细胞作为记录目标。 
	注意：健康的神经元通常具有以下特征：胞体既不收缩也不肿胀，膜边缘对比度柔和，膜表面光滑。此外，大多数健康细胞位于 &#62;切片深度为30 µm，因为浅层神经元的树突过程可能已受损。应避免选择表面皱缩、细胞核明显可见或呈“煎蛋样”，以及膜边缘过暗或对比度过高的神经元。</li>
	<li>用约5 µL细胞内液反向填充记录电极，并将其安装到电极夹持器上。将电极移至脑片上方的记录浴槽中，施加轻微正压以清除尖端可能存在的堵塞物。将电极偏移电压调零，并使用膜测试功能监测尖端电阻。</li>
	<li>将移液管尖端移至目标神经元胞体表面并与其接触，由于轻微的正压，细胞膜表面应形成一个小凹陷。</li>
	<li>一旦观察到膜出现凹陷，立即撤去正压并施加轻柔的负压，以促进封接形成。当移液管电阻增大至 &#62;100 MΩ时，开启钳制指令，将其调至与目标细胞类型预期静息膜电位相匹配的水平（-70 mV 是一个合适的起始点）。</li>
	<li>当尖端电阻达到≥1 gigaohm时，通过短暂施加强烈吸力以破裂膜片电极下方的细胞膜，尝试进入细胞；必要时可使用“zap”功能以促进破膜。 
	注意：皮层神经元的电压钳实验建议采用 -70 mV 的保持电位。健康的神经元在整个实验过程中漏电流不应超过 -100 pA，但该值在一定程度上取决于细胞类型。若神经元的静息膜电位去极化程度超过 -50 mV，或接入电阻变化超过 20%，则应将其排除在分析之外。</li>
	<li>获得稳定的全细胞膜片钳记录后，通过重复步骤6.6–6.10，对其他目标神经元进行记录。操作时需注意避免机械干扰，以防丢失首次记录。
	<ol>
		<li>在距离首个神经元100 µm范围内选择额外的神经元，以确保有合理的概率找到突触连接的神经元。 
		注意：在某些情况下，预先识别多个候选神经元，并在建立首个膜片钳记录之前，将所有移液管预先加载并定位到各个目标细胞附近，可能会有所帮助。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Na+ 内参标准物提升吉欧姆封接形成效率与膜片钳记录成功率 
NMDG保护性复苏法的初始版本是专门为成年和衰老动物设计的2,5一些早期采用者还尝试将该方法应用于幼年动物脑切片即，小鼠 &#60;30天）。然而，有研究指出，尽管在此年龄段使用NMDG保护性复苏方法可实现通过视觉确认的优异神经元保存效果，但吉欧姆密封（gigaohm seal）的形成常出现停滞，导致膜片钳记录尝试失败。一种假设认为，与成年脑片相比，NMDG阳离子更容易滞留在幼年脑片中，从而阻碍密封形成；然而，当幼年脑片完全浸没于NMDG aCSF时，仍可顺利形成吉欧姆密封（数据未显示），这表明NMDG aCSF 本身 不会阻碍吉欧姆封接的形成。
在初始脑片恢复步骤结束时，溶液中 Na+ 从低浓度快速转变为高浓度，会导致神经元膜损伤并干扰封接形成过程。这一点是显而易见的，因为 Na+ 浓度从低到高、温度从冷到暖，以及 Ca2+ 与 Mg2+ 比值的显著升高，共同引发自发性突触活动的强烈反弹。脑片制备过程中的这种抑制性反弹阶段，可能类似于缺血损伤后发生的再灌注损伤。因此，为了进一步减轻初始恢复阶段的神经元膜损伤，现已引入一种逐步 Na+ 递增方案，即在 NMDG 保护性恢复孵育腔中，Na+ 浓度通过精确的时间控制被缓慢且可重复地逐步升高。与原始的保护性恢复方案类似，将 Na+ 浓度升高在时间上与温度及 Ca2+/Mg2+ 比值的升高相分离具有优势。此外，Na+ 递增方案在早期时间点引起细胞外 Na+ 浓度的小幅递增，而在后期时间点实现大幅升高，从而使脑组织有更充分的机会适应逐渐升高的 Na+ 水平。该方案可替代由灌流泵或重力滴注系统控制的逐步溶液交换方法，后者会导致 Na+ 水平持续上升，且需同时监控流入与流出，以避免切片腔溢出。值得注意的是，在此 Na+ 递增方案中，切片腔内溶液的渗透压在数分钟内逐步升高，随后切片被重新置于正常渗透压溶液中，但这一过程并未对切片健康状态或膜片钳记录的成功率产生不利影响。既往已有研究在中脑切片制备中使用高渗透压切割液，以更好地保护多巴胺能神经元用于膜片钳记录57,58，这表明在某些情况下，这种短暂的高渗状态可能具有积极作用。
通过采用优化的实验流程，结合NMDG保护性复苏法与逐步Na+ spike-in 步骤使得该脑片技术的应用范围扩展至涵盖幼年到成年成熟期的动物。此更新后的方案现可适用于广泛年龄段的动物，仅需使用一种最优的 NMDG aCSF 配方和操作流程。如有必要，可调整 Na+ spike-in 操作可根据动物年龄采用逐渐延长延迟时间或减缓时间进程的方式，以提高老年动物脑切片的存活率，我们已提供了按动物年龄推荐的 spike-in 时间方案的基本指南（见 表2）。尽管我们已提供了一个适用于多种应用的基本框架，但仍可探索一些额外的高级步骤，以进一步提高成年和衰老动物脑切片的存活率和存续时间。例如，谷胱甘肽恢复策略在这一方面尤为有效，具体实施方法可参见其他文献报道。2,6.
提高具有挑战性实验的通量 
通过膜片钳记录分析突触连接性是一项要求极高的应用，需要对神经元的结构和功能均实现良好保存，才能获得较高的实验成功率。随着需同时记录的神经元数量呈线性增加，技术难度呈超线性上升。该实验存在多种失败模式，其中最常见的失败原因之一是无法在目标细胞中的一个或多个细胞上形成足够稳定的吉欧姆密封。当需要同时记录三个或更多神经元时，这一问题会显著减缓实验进展。与采用优化的NMDG保护性复苏方法可加快吉欧姆密封形成时间的研究结果一致，无论是成年转基因小鼠脑切片还是成年癫痫患者神经外科脑切片，其多神经元膜片钳记录实验的成功率和通量均得到显著提升。这种效率的提高几乎可以肯定归因于该方案下吉欧姆密封形成更快速、更可靠，同时脑切片中神经元的保存状态也得到改善。尽管本方案明确聚焦于膜片钳记录应用的优势，但对于其他脑切片活性至关重要的高难度实验应用，预计也将获得类似的改进效果。

急性脑切片制备是神经科学中一种重要的实验模型系统。近半个世纪以来，该平台使得对多种解剖脑区和动物物种的活体脑组织进行动态功能研究成为可能。无论研究目的为生物化学、功能成像、形态学还是电生理学，确保切片组织的最佳完整性和存活能力都至关重要。正因如此，目前最受青睐的仍是具有高度韧性的幼年啮齿类动物脑切片制备（即，对小鼠而言，出生后30天以内）。从成年及衰老动物中获得足够健康的脑切片一直是一项巨大挑战，对大多数研究者而言构成了严重限制，阻碍了对成熟大脑功能结构的深入研究。这一点在膜片钳记录技术中尤为突出，该技术要求细胞形态和功能的高度保存，是表征已鉴定单个神经元内在特性和突触特性的不可或缺手段。在过去数十年中，绝大多数膜片钳电生理学者依赖一种“保护性切割”方法，即使用蔗糖替代的低Na+人工脑脊液（aCSF1）来制备健康脑切片，适用于幼年动物，而在较小程度上也用于年轻成年动物。该方法基于如下假设：在切片过程中，被动的Na+内流及其引发的水分进入和细胞肿胀是导致神经元存活率低下的主要损伤机制，特别是位于表层的神经元，更易因刀片移动造成直接机械损伤。然而，无论采用何种aCSF配方，保护性切割法在制备成年动物脑切片方面仍存在明显不足。
已有研究描述了一种简单而有效的解决方案2,3,4,5,6，称为“保护性复苏”脑片制备法。该方法的原始版本使用以NMDG替代钠离子的aCSF，因为NMDG在多种候选的钠离子替代物（包括蔗糖、甘油、胆碱和Tris）中被证实为最通用且最有效的成分。通过添加HEPES以抵抗脑片水肿并提供更强的pH缓冲能力7，以及加入可拮抗氧化应激有害作用的补充成分，进一步优化了该培养基配方（表1）。经验确定，在成年动物脑组织切片后，立即在低Na+、低Ca2+、高Mg2+的NMDG aCSF中进行初始恢复孵育步骤，对于在广泛的脑区、细胞类型和动物年龄条件下改善神经元的保存效果，既必要又充分3,5,6。
值得注意的是，现在被称为保护性恢复法的技术，其早期形式在文献中已有记载1,8,9,10,11,12,13，尽管早期研究尚未认识或展示成年及衰老动物脑片与膜片钳记录技术的全部潜力。此外，为支持特定实验应用，细微的操作步骤差异仍在不断涌现4,14,15,16大量研究团队的集体工作成果充分验证了该保护性复苏方法在改善组织保存方面的稳健性和可靠性。目前，NMDG保护性复苏方法已被广泛采纳并应用于众多利用成年动物脑片制备的已发表研究中。这些急性脑片研究涵盖了新皮层3,17,18海马体15,19,20,21, 纹状体22,23,24中脑25,26,27,28,29和后脑30,31,32,33,34 区域，以及多种神经递质和神经调质类型，包括谷氨酸能4,30，GABA能18,20,31,35,36多巴胺能24,29,37,38胆碱能14,37,38,39去甲肾上腺素能40，以及5-羟色胺能的27,28 神经传递。该方法也适用于对转基因动物来源的脑片中神经元活动进行光遗传学控制3,39 或在之后 体内 病毒注射17,27,28,40,41,42,43以及功能性 Ca2+ 神经元活动成像2,44,45,46短期可塑性的分析4,47,48 以及多种形式的长时程可塑性16,35,48 已有相关报道。最近一项研究采用NMDG保护性恢复法，结合八通道膜片钳记录配置，对成年成熟小鼠脑切片视觉皮层中的突触连接进行了广泛而系统的探究。49 ——充分展示了该方法的有效性和稳健性。保护性回收方法甚至已成功应用于此前未曾预料的实验场景中，例如在成年动物大脑皮层脑片中实现了对血管系统及周细胞的更佳保存50在1至1.5岁阿尔茨海默病小鼠模型中对移植的中间神经元群体进行膜片钳记录20以及成年脑切片受体运输检测51.
以下方案详细描述了采用优化的NMDG保护性复苏法进行脑片制备的逐步操作流程，以提高急性脑片的存活率。文中讨论了改善神经元保存效果的基本原理，并展示了该方法在年轻成年转基因小鼠脑片以及成熟成年中国人脑神经外科脑片的复杂多神经元膜片钳记录实验中的显著优势。本方案已验证适用于21天至一岁以上的实验小鼠，以及来自成年患者的神经外科人脑组织标本。

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>振动式组织切片机（推荐）</td></tr><tr><td>N-甲基-D-葡萄糖胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>硫脲</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>aCSF组分</td></tr><tr><td>2,2,2-三溴乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>麻醉剂组分1</td></tr><tr><td>2-甲基-2-丁醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>麻醉剂组分2</td></tr><tr><td>弯头钝头镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11065-07</td><td>脑组织解剖工具</td></tr><tr><td>精细解剖剪（超锐）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>脑组织解剖工具</td></tr><tr><td>大型重型剪刀（7英寸）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td>脑组织解剖工具</td></tr><tr><td>金属刮勺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>脑组织解剖工具</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>脑组织解剖工具</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate Scientific</td><td>S-BSK4</td><td>脑片保存室</td></tr><tr><td>尼龙网&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>用于构建小型脑片回收室</td></tr><tr><td>Pyrex玻璃烧杯（250 mL）</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>用于构建小型脑片回收室</td></tr><tr><td>35 mm塑料培养皿，圆形</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>用于构建小型脑片回收室</td></tr><tr><td>气体扩散石（10 &amp;micro;m）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>用于持续通入碳合气（产生细小气泡）</td></tr><tr><td>琼脂糖I-B型</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>用于包埋脑组织样本</td></tr><tr><td>微量加样尖头</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>用于填充膜片钳电极</td></tr><tr><td>硅胶（Sylgard）</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>用于制作定制解剖平台</td></tr><tr><td>盐酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>用于调节培养基pH值</td></tr><tr><td>氢氧化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>用于调节培养基pH值</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>用于调节培养基pH值</td></tr><tr><td>3 mL刻度塑料移液管</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>用于转移脑片</td></tr><tr><td>氧化锆陶瓷注射刀片</td><td>Cadence Specialty Blades</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr><tr><td>KG-33硼硅酸盐玻璃毛细管（带丝）</td><td>King Glass Company</td><td>custom quote</td><td>内径：0.87 mm，外径：1.50 mm</td></tr><tr><td>生物胞素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>细胞内电极液组分</td></tr><tr><td>磷酸肌酸二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>细胞内电极液组分</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>细胞内电极液组分</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>细胞内电极液组分</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>细胞内电极液组分</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>细胞内电极液组分</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>细胞内电极液组分</td></tr><tr><td>加热恒温水浴（2.5 L）</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td>其他</td></tr><tr><td>滤纸圆片</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td>其他</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>其他</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>其他</td></tr><tr><td>10X磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>其他</td></tr><tr><td>30 mL注射器</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>其他</td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>其他</td></tr><tr><td>25 5/8号针头</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td>其他</td></tr><tr><td>恒温混匀仪（配1.5 mL离心管模块）</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>用于保持琼脂糖处于熔融状态&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

使用优化方法制备急性脑切片 n甲基-d-葡糖胺保护回收法

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

本方案是脑切片制备中 N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）保护性复苏方法的实用指南。近年来大量研究已证实，该方法在提高神经元保存效果和整体脑切片活性方面具有显著优势。早期采用者应用该技术，已成功开展多种实验研究，涵盖不同动物年龄、脑区和细胞类型，深入探究了脑功能。本文详细阐述了采用优化的 NMDG 人工脑脊液（aCSF）培养基配方及改进操作流程进行保护性复苏脑切片技术的步骤，以稳定获得适用于膜片钳电生理实验的健康脑切片。通过这一改进方法，在靶向膜片钳记录实验中，吉欧姆封接（gigaohm seal）的形成速度和可靠性得到显著提升，同时保持优异的神经元保存状态，从而促进了高难度实验的实施。文中提供了来自多神经元膜片钳记录实验的代表性结果，用于检测由年轻成年转基因小鼠和成年成人神经外科手术标本获取的新皮层脑切片中的突触连接性。此外，优化后的 NMDG 保护性复苏脑切片方法适用于幼年和成年动物，解决了原始方法的一项局限性。总之，该单一培养基配方和脑切片制备流程可广泛应用于不同物种和年龄段，实现优异的组织活性与保存效果。

本方案演示了一种优化方法的实施 NN-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）保护性复苏法在脑片制备中的应用。该方法采用单一培养基配方，可稳定地从任何年龄的动物获取健康的脑组织切片，适用于多种实验研究。

使用优化方法制备急性脑切片 N甲基-D-葡糖胺保护回收法

本方案是脑切片制备中N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）保护性复苏方法的实用指南。近年来多项研究已……

本实验的总体目标是从成熟的成年动物中制备适用于膜片钳电生理实验的健康脑切片。因此，这种经过优化的NMDG保护性复苏法在脑切片制备中使研究人员能够研究多种不同脑区中各类脑细胞的固有特性及突触特性，并适用于几乎所有年龄段的动物。该技术的主要优势在于，与以往的方法相比，它能够制备出神经元保存程度更高的脑切片。此外，这些脑切片更适合进行膜片钳记录。该方法针对成年小鼠脑组织进行了优化，但也可用于多种其他物种，包括神经外科切除的人脑组织。开始此操作前，使用组织切片机和外科器械设置切片工作站。使用快干胶将氧化锆陶瓷切割刀片固定在刀臂上。然后插入样本架，并将刀片的前沿与样本架边缘对齐。留出微小间隙，确保刀片不会刮擦金属。取一个250毫升烧杯，加入200毫升NMDG HEPES aCSF，并在冰上预冷，持续通入碳氧混合气（carbogen）超过10分钟。然后，通过向初始脑片恢复室中加入 150 毫升 NMDG HEPES aCSF 来设置该恢复室，并将该室置于 32 至 34 摄氏度的水浴中。要设置脑片保存室，需向储液槽中加入 450 毫升 HEPES aCSF，并在持续通入碳合气的条件下使其升温至室温，直至使用。接下来，通过使用50毫升锥形瓶的开口端从预先制备好的培养皿中切下一小块2%琼脂糖，以制备用于组织包埋的熔融琼脂糖。将锥形瓶盖 loosely 盖上，然后微波加热10至30秒，直至琼脂糖开始融化。切勿过热。将熔化的琼脂糖倒入1.5毫升离心管中。使用设定为42摄氏度并剧烈振荡的恒温混匀仪，保持琼脂糖处于熔融状态。并小心确保熔融琼脂糖不会过早凝固。此时将切片机的辅助冷却块置于冰上预冷。在此步骤中，先在头部皮肤上做一切口以暴露颅骨。然后使用精细的超剪剪除颅骨上方的皮肤。在颅骨尾端腹侧基部两侧分别做小的侧向切口。从颅骨尾端背侧开始，沿背侧中线向前端方向做额外的浅切口，注意不要损伤下方的脑组织。随后，在嗅球水平处，沿中线垂直进行最终的 T 形切口。接着，使用圆头镊子从吻侧中线部位开始夹住颅骨，并向尾侧外侧方向剥离一侧颅骨。重复此操作处理另一侧，以打开颅腔。去除颅骨盖的背侧半部分以暴露脑组织。轻轻将完整的脑组织舀入盛有预冷的NMDG HEPES aCSF的烧杯中，并让脑组织均匀冷却约一分钟。现在，使用大刮刀将脑组织从烧杯转移至覆盖有滤纸的培养皿上。根据所需的切片角度和目标脑区，修剪并固定脑组织。操作过程应迅速，以避免在处理过程中长时间缺氧。随后，使用粘合胶将脑组织块固定在样本架上。缩回样本架的内层部分，使脑组织块完全收入内部。然后将熔化的琼脂糖直接倒入样本架中，直至脑组织块完全被琼脂糖覆盖。随后，将预冷的辅助冷却块夹紧在样品架周围约十秒钟，直至琼脂糖完全凝固。将样品架插入切片机上的插槽中，并确认其位置正确对齐。接着，用250毫升烧杯中剩余的预冷加氧NMDG-HEPES人工脑脊液填充储液槽，并在整个切片过程中将通气石置于储液槽内，以确保充分供氧。接下来，调节千分尺以开始推进琼脂糖包埋的脑组织样本。启动切片机，并根据经验将推进速度和振荡频率调整至所需水平。以300微米为增量持续推进并切片，直至目标脑区完全被切片完毕。切片过程的总时间应少于15分钟，用于初始的NMDG恢复。切片完成后，使用截断的塑料巴斯德吸管收集所有切片，并将其转移至一个装有150毫升NMDG HEPES aCSF、温度为34摄氏度的恢复室中。急性脑片恢复步骤的时间非常关键，需要在形态学保存与每个神经元电生理特性的功能恢复之间取得平衡。在确定最佳的钠离子增强方案后，根据小鼠年龄执行步骤Y的钠离子增强程序，在指定时间加入指定体积的钠离子增强溶液。将钠离子增强溶液直接加入初始恢复室的通气管中，以促进快速混合。所提供的钠离子尖峰插入方案包含多种不同的年龄范围，是一个非常好的起点。但应根据您自身的具体实验设计对其进行优化和应用。随后，将所有切片转移至在室温下保存的HEPES aCSF长期储存室中。在进行膜片钳记录实验之前，将脑片置于HEPES孵育室中再恢复一小时。图中显示的是从三个月龄小鼠的不同脑区和急性脑片获取的代表性红外微分干涉（IR DIC）图像，用于评估神经元形态的保存情况。此处展示的结果采用的是对照NMDG保护性切片法，且未包含保护性恢复步骤。这些结果来自优化的NMDG保护性复苏方法。总体而言，采用优化的NMDG保护性复苏方法可观察到神经元保存效果更佳。本研究将采用逐步钠离子添加程序的优化NMDG保护性复苏方法与原始的NMDG保护性复苏方法进行了比较。当采用逐步钠离子脉冲法并结合NMDG保护性恢复步骤时，吉欧姆封接形成和膜片钳记录的平均时间显著且大幅缩短。通过该脑片方法实现的神经元保存条件的改善，有助于开展具有挑战性的实验应用，包括但不限于多电极膜片钳电生理记录以探究局部突触连接性。如本研究所示，该方法适用于来源于神经外科手术的成人人类离体新皮质脑片。科研人员通过观看本视频，应能充分掌握如何实施我们优化的NMDG保护性复苏方法，包括文中所述的新型钠离子脉冲加入步骤，以制备适用于膜片钳记录的脑片。掌握本方案后，每天可在一小时之内完成脑片制备流程，获得高质量且可重复的脑片，并适用于几乎所有年龄段的动物。因此，该操作方法可用于制备适用于研究脑功能的脑切片，进而通过膜片钳电生理、活体光学成像、光遗传学、受体转运检测以及其他类型的细胞功能检测等技术，探索不同类型脑细胞的功能特性。此外，该技术还具有重要应用价值，因为它能够帮助研究人员对多种脑区进行功能性探测，包括那些传统上难以从成年动物脑切片中进行膜片钳记录的脑区。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用优化的n-甲基 d-葡乙胺保护恢复法制备急性脑切片

本视频介绍了一种采用基于N-甲基-D-葡萄糖胺（NMDG）的保护性复苏方法制备脑切片的实验方案。将分离的脑组织在含有NMDG和HEPES的无钙人工脑脊液（aCSF）中孵育，以在切片过程中最大限度地减少神经元细胞的死亡和损伤。切片后将脑片置于aCSF中恢复，以重建细胞活性...

采用NMDG保护性复苏法进行脑切片制备

我们介绍了两种用于可视化和定量分析小鼠模型海马中树突分支的方法：实时成像和扩展景深成像。前者可实现复杂的拓扑追踪，并对分支程度进行定量分析，后者则能够快速可视化树突树结构。...

小鼠海马区齿状回树突分支的评估

本方案描述了在小体积循环缓冲液中稳定氧浓度的方法，以及在浸没式急性海马脑片中记录活动依赖性突触可塑性的技术要点。...

在小型循环灌流浸没式切片记录系统中记录急性海马脑片的突触可塑性

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，能够迅速响应其环境变化并发生形态学改变。本方案描述了如何利用双光子显微镜研究小鼠急性脑切片中小胶质细胞突起向血清素或三磷酸腺苷（ATP）的趋化反应。...

双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

本方案介绍了一种从成年及衰老小鼠海马组织制备急性脑片的方法，该方法采用经心脏灌注及冰冻NMDG-aCSF溶液进行脑片切割，以减少组织的缺氧损伤。所获得的脑片可在数小时内保持良好的活性，适用于长期的膜片钳和场电位记录实验。...

最小化成年及衰老小鼠海马脑片中的缺氧现象

本文旨在描述一种系统性的方案，用于获取小鼠的水平脑切片。该方法的目的是保持海马纤维通路（如穿通通路和苔藓纤维束）的完整性，以评估与齿状回相关的神经过程。...

小鼠脑水平海马切片

我们介绍一种制备小鼠背侧-中间海马区急性脑片的方案。我们将这种横向切片制备方法与冠状切片在记录质量以及所记录神经元形态特征的保存方面进行比较。...

成年小鼠背侧海马急性脑片制备用于全细胞记录及齿状回神经元重建

连续块面扫描电子显微镜（SBEM）用于对小鼠海马区的树突棘进行成像和分析。...

用于树突棘研究的连续块面扫描电子显微镜技术（SBEM）

在此，展示了如何利用清醒状态下的闭合性头部损伤模型来研究重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）对海马突触可塑性的影响。该模型可复制r-mTBI患者的重要病理特征，并可与电生理记录、行为学检测及分子生物学分析等技术联合使用 体外...

利用清醒状态下闭合性头部损伤的轻度创伤性脑损伤模型评估突触可塑性的变化

本研究提出了一种利用急性高血糖C57BL/6小鼠进行大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）建立出血性转化（HT）高度可重复动物模型的实验方案。...

一种由急性高血糖联合短暂局灶性缺血诱导的出血性转化小鼠模型

了解优化的N-甲基-D-葡乙胺保护恢复法制备急性脑切片技术，用于神经科学电生理学研究。该方法可提高神经元存活率，适用于不同年龄动物及人脑组织，为膜片钳记录提供高质量样本。

使用优化方法制备急性脑切片 N甲基-D-葡糖胺保护回收法

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