用优化的n-甲基 d-葡乙胺保护恢复法制备急性脑切片

该协议演示了一种优化的N-甲基 D-葡乙胺 (NMDG) 脑切片制备保护恢复方法的实现。一个单一的媒体配方是用来可靠地获得健康的脑切片从动物的任何年龄和不同的实验应用。

该程序的总体目标是从成熟成年动物中制备适合膜片钳电生理学实验的健康脑切片。因此，这种用于脑切片制备的优化 NMDG 保护性恢复方法使研究人员能够探索许多不同大脑区域和几乎任何年龄的动物的脑细胞类型的内在和突触特性。因此，这种特殊技术的主要优点是，与以前的方法相比，它允许人们制备具有更高程度神经元保留的脑切片。

而且这些脑切片更适合膜片钳记录。该方法针对成年小鼠脑组织进行了优化。它可用于各种其他物种，包括神经外科切除的人脑组织。

要开始此过程，请使用组织切片机和手术器械设置切片站。使用快速胶水将锆陶瓷注射器刀片连接到刀片臂上。然后插入样品架，并将刀片的前缘与样品架边缘对齐。

留出一个小间隙以确保刀片不会刮伤金属。用 250 毫升 NMDG HEPES aCSF 填充 200 毫升烧杯。并将其在冰上预冷却，不断渗碳 10 分钟以上。

然后用 150 毫升 NMDG HEPES aCSF 填充初始脑切片恢复室。并将腔室置于 32 至 34 摄氏度的水浴中。要设置脑切片保存室，请在储液器中加入 450 毫升 HEPES aCSF，并在恒定碳化作用下加热至室温直至使用。

接下来，使用 50 ml 锥形瓶的开口端从先前制备的培养皿中切出一块 2% 琼脂糖，制备用于组织包埋的熔融琼脂糖。松散地盖上锥形瓶盖，然后用微波炉加热 10 到 30 秒，直到琼脂糖开始熔化。不要过热。

将熔融琼脂糖倒入 1.5 毫升试管中。使用设置为 42 摄氏度的热混合器在剧烈摇晃下将琼脂糖保持在熔融状态。并小心确保熔融的琼脂糖不会过早凝固。

此时，在冰上预冷切片机的附件冷却块。在这个过程中，在头部皮肤上切开一个，露出头盖骨。然后，用细的超级剪刀剪掉无边帽上的皮肤。

并在颅骨尾腹基的两侧横向做小切口。从颅骨的尾侧开始，沿着背中线的喙方向向上移动，进行额外的浅切口。注意不要损伤底层大脑。

之后，在嗅球水平垂直于中线进行最终 T 形切割。随后，使用圆尖镊子从喙内侧开始抓住颅骨，并在一侧向尾侧方向剥离。重复此过程，使另一侧裂开。

并去除颅骨帽的背半部分，露出大脑。轻轻地将完整的大脑舀入预冷的 NMDG HEPES aCSF 的烧杯中。并让大脑均匀冷却约一分钟。

现在，用大抹刀将大脑从烧杯转移到覆盖有滤纸的培养皿上。根据首选的切片角度和所需的感兴趣大脑区域修剪和安装大脑。快速工作以避免在处理过程中长时间缺氧。

然后，使用胶水将脑阻滞剂固定在标本架上。缩回标本架的内件，将脑阻滞完全拉入内部。然后将熔融的琼脂糖直接倒入支架中，直到脑块完全被琼脂糖覆盖。

随后，将预冷的附件冷却块夹在样品架周围 10 秒钟，直到琼脂糖凝固。将样品架插入切片机上的插座中，并验证是否正确对齐。之后，用 250 毫升烧杯中剩余的预冷含氧 NMDG HEPES aCSF 填充储液器，并在切片过程中将泡泡石放入储液器中，以确保足够的氧合。

接下来，调整千分尺以开始推进琼脂糖包埋的脑标本。启动切片机并凭经验将前进速度和振荡频率调整到所需的水平。继续以 300 微米的增量推进和切片组织，直到感兴趣的大脑区域被完全切片。

切片过程的总时间应少于 15 分钟。用于初始 NMDG 恢复。切片程序完成后，使用切断的塑料牧草移液管收集所有切片，并将它们转移到装有 150 毫升 MMDG HEPES ACSF 的 34 摄氏度恢复室中。

急性脑切片恢复步骤的时机非常重要，以便能够在形态保留和每个神经元的电生理特性的功能恢复之间取得平衡。在确定最佳钠加标方案后，根据小鼠年龄通过在指定时间添加指定体积的钠加标溶液来执行步骤 Y 钠加标程序。将钠加标溶液直接添加到初始回收室的起泡器烟囱中，以促进快速混合。

为各种不同年龄范围提供的钠摄入量加标时间表是一个很好的起点。但它应该针对您自己的特定实验设计进行优化和利用。之后，将所有切片转移到维持在室温下的 HEPES aCSF 长期保存室中。

在膜片钳记录实验之前，让切片在 HEPES 保持室中再恢复一小时。这里显示的是从不同大脑区域和三个月大小鼠的急性切片中获得的代表性 IR DIC 图像，用于评估神经元的形态保存。此处显示的结果来自使用控制 NMDG 保护性切割方法，没有保护性恢复步骤。

而这些结果来自优化的 NMDG 保护性恢复方法。总体而言，使用优化的 NMDG 保护性恢复方法观察到神经元保存得到改善。将具有逐渐加钠程序的优化 NMDG 保护性恢复方法与原始 NMDG 保护性恢复方法进行了比较。

当逐渐加钠程序与 NMDG 保护性恢复步骤一起应用时，GigaOhm 密封形成和膜片钳记录的平均时间显着缩短。使用这种脑切片方法实现的神经元保存得到改善，有助于具有挑战性的实验应用，包括但不限于探测局部突触连接的多电极膜片钳电生理学。如此处所示，使用源自神经手术的成人 ex vevo 新皮质脑切片。

通过观看此视频，科学家们应该对如何实施我们优化的 NMDG 保护性恢复方法有很好的了解，包括我们描述的新钠加标程序，用于制备适用于膜片钳记录的脑切片。因此，在掌握了此协议后，应该可以在每天不到一小时的时间内完成脑切片程序。并且应该产生高质量、可重复的脑切片，并且几乎适用于任何年龄的动物。

所以这个程序，这个方法可以帮助准备适合使用电生理学、实时光学成像和光遗传学、受体运输测定和其他类型的功能测定等技术来解决脑功能问题的脑切片，以探索脑细胞类型的功能。因此，这项技术也很有用，因为它将帮助研究人员能够从功能上探测不同的大脑区域，包括传统上不适合在脑切片中记录成年动物膜片钳的大脑区域。