使用优化方法制备急性脑切片 N甲基-D-葡糖胺保护回收法

本实验的总体目标是从成熟的成年动物中制备适用于膜片钳电生理实验的健康脑切片。因此，这种经过优化的NMDG保护性复苏法在脑切片制备中使研究人员能够研究多种不同脑区中各类脑细胞的固有特性及突触特性，并适用于几乎所有年龄段的动物。该技术的主要优势在于，与以往的方法相比，它能够制备出神经元保存程度更高的脑切片。

此外，这些脑切片更适合进行膜片钳记录。该方法针对成年小鼠脑组织进行了优化，但也可用于多种其他物种，包括神经外科切除的人脑组织。

开始此操作前，使用组织切片机和外科器械设置切片工作站。使用快干胶将氧化锆陶瓷切割刀片固定在刀臂上。然后插入样本架，并将刀片的前沿与样本架边缘对齐。

留出微小间隙，确保刀片不会刮擦金属。取一个250毫升烧杯，加入200毫升NMDG HEPES aCSF，并在冰上预冷，持续通入碳氧混合气（carbogen）超过10分钟。

然后，通过向初始脑片恢复室中加入 150 毫升 NMDG HEPES aCSF 来设置该恢复室，并将该室置于 32 至 34 摄氏度的水浴中。要设置脑片保存室，需向储液槽中加入 450 毫升 HEPES aCSF，并在持续通入碳合气的条件下使其升温至室温，直至使用。

接下来，通过使用50毫升锥形瓶的开口端从预先制备好的培养皿中切下一小块2%琼脂糖，以制备用于组织包埋的熔融琼脂糖。将锥形瓶盖 loosely 盖上，然后微波加热10至30秒，直至琼脂糖开始融化。切勿过热。

将熔化的琼脂糖倒入1.5毫升离心管中。使用设定为42摄氏度并剧烈振荡的恒温混匀仪，保持琼脂糖处于熔融状态。并小心确保熔融琼脂糖不会过早凝固。

此时将切片机的辅助冷却块置于冰上预冷。在此步骤中，先在头部皮肤上做一切口以暴露颅骨。然后使用精细的超剪剪除颅骨上方的皮肤。

在颅骨尾端腹侧基部两侧分别做小的侧向切口。从颅骨尾端背侧开始，沿背侧中线向前端方向做额外的浅切口，注意不要损伤下方的脑组织。

随后，在嗅球水平处，沿中线垂直进行最终的 T 形切口。接着，使用圆头镊子从吻侧中线部位开始夹住颅骨，并向尾侧外侧方向剥离一侧颅骨。重复此操作处理另一侧，以打开颅腔。

去除颅骨盖的背侧半部分以暴露脑组织。轻轻将完整的脑组织舀入盛有预冷的NMDG HEPES aCSF的烧杯中，并让脑组织均匀冷却约一分钟。

现在，使用大刮刀将脑组织从烧杯转移至覆盖有滤纸的培养皿上。根据所需的切片角度和目标脑区，修剪并固定脑组织。操作过程应迅速，以避免在处理过程中长时间缺氧。

随后，使用粘合胶将脑组织块固定在样本架上。缩回样本架的内层部分，使脑组织块完全收入内部。然后将熔化的琼脂糖直接倒入样本架中，直至脑组织块完全被琼脂糖覆盖。

随后，将预冷的辅助冷却块夹紧在样品架周围约十秒钟，直至琼脂糖完全凝固。将样品架插入切片机上的插槽中，并确认其位置正确对齐。接着，用250毫升烧杯中剩余的预冷加氧NMDG-HEPES人工脑脊液填充储液槽，并在整个切片过程中将通气石置于储液槽内，以确保充分供氧。

接下来，调节千分尺以开始推进琼脂糖包埋的脑组织样本。启动切片机，并根据经验将推进速度和振荡频率调整至所需水平。以300微米为增量持续推进并切片，直至目标脑区完全被切片完毕。

切片过程的总时间应少于15分钟，用于初始的NMDG恢复。切片完成后，使用截断的塑料巴斯德吸管收集所有切片，并将其转移至一个装有150毫升NMDG HEPES aCSF、温度为34摄氏度的恢复室中。

急性脑片恢复步骤的时间非常关键，需要在形态学保存与每个神经元电生理特性的功能恢复之间取得平衡。在确定最佳的钠离子增强方案后，根据小鼠年龄执行步骤Y的钠离子增强程序，在指定时间加入指定体积的钠离子增强溶液。将钠离子增强溶液直接加入初始恢复室的通气管中，以促进快速混合。

所提供的钠离子尖峰插入方案包含多种不同的年龄范围，是一个非常好的起点。但应根据您自身的具体实验设计对其进行优化和应用。随后，将所有切片转移至在室温下保存的HEPES aCSF长期储存室中。

在进行膜片钳记录实验之前，将脑片置于HEPES孵育室中再恢复一小时。图中显示的是从三个月龄小鼠的不同脑区和急性脑片获取的代表性红外微分干涉（IR DIC）图像，用于评估神经元形态的保存情况。此处展示的结果采用的是对照NMDG保护性切片法，且未包含保护性恢复步骤。

这些结果来自优化的NMDG保护性复苏方法。总体而言，采用优化的NMDG保护性复苏方法可观察到神经元保存效果更佳。本研究将采用逐步钠离子添加程序的优化NMDG保护性复苏方法与原始的NMDG保护性复苏方法进行了比较。

当采用逐步钠离子脉冲法并结合NMDG保护性恢复步骤时，吉欧姆封接形成和膜片钳记录的平均时间显著且大幅缩短。通过该脑片方法实现的神经元保存条件的改善，有助于开展具有挑战性的实验应用，包括但不限于多电极膜片钳电生理记录以探究局部突触连接性。如本研究所示，该方法适用于来源于神经外科手术的成人人类离体新皮质脑片。

科研人员通过观看本视频，应能充分掌握如何实施我们优化的NMDG保护性复苏方法，包括文中所述的新型钠离子脉冲加入步骤，以制备适用于膜片钳记录的脑片。掌握本方案后，每天可在一小时之内完成脑片制备流程，获得高质量且可重复的脑片，并适用于几乎所有年龄段的动物。

因此，该操作方法可用于制备适用于研究脑功能的脑切片，进而通过膜片钳电生理、活体光学成像、光遗传学、受体转运检测以及其他类型的细胞功能检测等技术，探索不同类型脑细胞的功能特性。此外，该技术还具有重要应用价值，因为它能够帮助研究人员对多种脑区进行功能性探测，包括那些传统上难以从成年动物脑切片中进行膜片钳记录的脑区。