Name: 基于表型梯度的鸡蛋排斥试验对鸡蛋识别极限的探讨 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学习鸟类卵排斥实验的标准化方法，使用钛白涂料和丙烯颜料制作模型卵，通过光谱仪量化颜色，在野外观察宿主对寄生卵的识别与排斥行为。该方案为进化生态学中宿主-寄生者相互作用研究提供了可重复的技术手段。

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MEH 获得了伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校 HJ Van Cleave 教授职位基金的资助。此外，我们感谢人类前沿科学计划（资助对象：M.E.H. 和 T.G.）以及欧洲社会基金和捷克共和国国家预算（项目编号：CZ.1.07/2.3.00/30.0041，资助对象：T.G.）提供的经费支持。我们感谢 Ocean Optics 为本文支付出版费用。

本文所述所有方法均已获得长岛大学波斯特校区机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 丙烯颜料的调和
<ol>
	<li>混合蛋壳底色，该颜色将均匀覆盖整个蛋壳表面。以下配方可制备 50 g 油漆，足以填充两个以上 22 mL 的铝制油漆管。
	<ol>
		<li>使用 18.24 g 钴蓝绿浅色、20.77 g 钛白、6.52 g 钴绿色、2.86 g 钴蓝绿和 1.61 g 熟赭石，调配出蓝绿色，代表蓝绿色蛋壳（例如，美洲知更鸟 T. migratorius 的蛋壳）。</li>
		<li>使用 4.12 g 红色氧化铁、9.75 g 镉橙、22.15 g 浅生赭石和 13.97 g 钛白，调配出棕色，代表棕色蛋壳（例如，家鸡 Gallus gallus domesticus 的蛋壳）。</li>
		<li>使用 10.60 g 棕色蛋色、8.28 g 蓝绿色、18.51 g 钛白和 12.61 g 黄赭石，调配出米色，代表米色蛋壳（例如，日本鹌鹑 Coturnix japonica 的蛋壳）。</li>
		<li>直接使用钛白调配白色，无需混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>混合深棕色斑点色，用于模拟日本鹌鹑 C. japonica 蛋壳上的斑点，配方为 8.38 g 棕色蛋色、26.04 g 熟赭石和 15.59 g 马斯黑。</li>
	<li>通过将蓝绿色与棕色颜料按不同比例互为增减地混合，调配出从蓝绿色到棕色之间的中间色系（例如，蓝绿色与棕色颜料的比例分别为：10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9 和 0:10，见 图 1E）。
	<ol>
		<li>如需生成更多中间色，可将这些中间色等量混合，并重复此过程，直至获得所需数量的独特颜色。蓝绿色与棕色的等量混合将产生中性灰色，但可根据需要使用白色或米色进行调整。若需要更精确的颜色（例如，某种特定宿主鸟蛋的颜色），可使用减色混合模型预测不同颜料组合的光谱反射率，并选择与目标颜色之间最小可觉差（JND）最低的混合配方（参见步骤 3.3–3.7）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将颜料储存于空的 22 mL 铝制油漆管中。
	<ol>
		<li>将颜料装入一个塑料三明治袋中，剪去袋子一角的一小部分。将塑料袋的开口端插入油漆管口，挤压袋子将颜料挤入管中，并轻轻敲击管体底部以排除气泡。</li>
		<li>利用袋体自带的粘合边缘，将管口折叠回自身至少 3–4 次，以密封管口。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 绘制实验用卵模型
<ol>
	<li>获取实验用蛋模型。
	<ol>
		<li>使用三维（以下简称3D）打印机打印模型蛋，或从供应商处购买32。推荐此简单方法，因其可生成大小和形状一致的蛋模型32。 
		注意：模型蛋也可由石膏、黏土、木材或其他材料制成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在每个蛋表面均匀涂覆一层钛白颜料，以遮盖底层颜色。</li>
	<li>使用镊子夹持每个蛋，用高质量丙烯颜料和洁净画笔涂上所需颜色，使每个蛋具有独特的色彩。</li>
	<li>使用冷风档位的吹风机，加快每个刚涂完颜料的蛋的干燥过程。</li>
	<li>待蛋完全干燥后，使用砂纸打磨蛋表面可能出现的任何凸起。
	<ol>
		<li>重复步骤2.3，直至蛋表面形成均匀无颗粒的漆层。每个蛋至少需涂覆两层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过画笔精细涂抹或使用牙刷轻弹溅射的方式，在模型蛋上添加斑点。仅需单层涂覆即可。 
	警告：若需模拟紫外线（UV）反射特性，可均匀涂覆一层UV颜料；但除非已获得机构、州/省级及联邦许可部门的使用许可，否则不建议采用此类颜料。</li>
</ol>
3. 颜色的量化
<ol>
	<li>按下电源按钮以打开光谱仪。</li>
	<li>将SD卡插入SD卡插槽，通过按下红色取消按钮将其连接至系统，选择 文件系统 通过按下绿色确认按钮进行选择 查找SD卡 通过按菜单向上按钮。然后，按红色取消按钮两次，或按主页按钮。
	<ol>
		<li>将光纤电缆连接到光谱仪和光源上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接标记为 光源 连接到光源模块，并连接标有标签的一端 光谱仪 连接到光谱仪模块。</li>
	<li>将探针头安装到光纤探针的末端。 
	注意：可在补充代码文件中获取一个适用于3D打印的探针头示例。该部件需自行配装合适的拇指螺钉。
	<ol>
		<li>建立距离（例如，5 mm）以最大化信噪比。使用软尺确保测量距离保持一致。 
		注意：确切距离会因每台光谱仪所采用的光栅与狭缝宽度组合、光学宽度及光源的不同而有所差异。所有测量应保持相同距离。灵活规则可作为补充代码文件下载。</li>
		<li>使用正入射测量角度（90°），除非天然寄主卵或模型卵具有光泽表面，此时应采用45°正入射倾斜测量角度。所有卵（包括真实卵和人工卵）均需采用相同的角度进行测量。</li>
		<li>用95%乙醇清洗探针尖端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按向下按钮三次以打开光源，然后选择 PX-Lamp 通过按下绿色确认按钮进行选择 设置 通过按下向右滚动按钮进行选择 时间对照 通过按下向右滚动按钮，然后连续三次按下向下按钮，最后按压选择自由运行模式 接受按钮.
	<ol>
		<li>至少等待15分钟后，再进行任何测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准并配置光谱仪。为此，请按下主菜单按钮，然后选择 工具 通过按下向左滚动按钮进行选择 手动控制 通过按下菜单向上按钮，并选择 获取参数 通过按下菜单向上按钮。
	<ol>
		<li>将盒式平滑设为5：按下向右滚动按钮，再连续按两次向右滚动按钮将光标向右移动两格，然后按五次菜单上键以增加盒式平滑值。选择 接受 完成后，按下绿色确认按钮。</li>
		<li>将平均值设为10：先按下菜单下键，然后连续按两次向右滚动按钮，移动至十位数位置，按一次菜单上键将其设为1，再按一次向右滚动按钮移至个位数位置，最后按一次菜单下键将其设为0。选择 接受 完成后，按下绿色确认按钮。</li>
		<li>按下主页按钮，选择 反射率 通过按下菜单上键，将探头牢固地放置在白色标准板上。然后再次按下菜单上键以保存参考白色标准。接着按下向右滚动按钮以保存暗标准，并通过按下菜单下键查看反射率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在钝端（蛋的宽端）附近测量两次，蛋的赤道位置测量两次，尖端（较窄的一端）附近测量两次，每个蛋壳的反射率共测量六次。需明确报告是否避开了斑点区域。该操作应同时在实验组蛋和宿主蛋上进行。</li>
	<li>使用颜色分析软件，采用平滑跨度为0.25 nm的局部加权多项式函数对反射率曲线中的噪声进行平滑处理33如果蛋模型不同区域的颜色评分（如亮度）之间不具有显著的重复性（步骤3.7），则重新涂绘蛋模型（步骤2.2–2.6）；否则，对整个蛋模型的颜色进行平均。</li>
	<li>确定最适合该问题的一组相对光感受器敏感性。 
	注意：这可能是一种通用的紫外线敏感或紫光敏感鸟类，也可选择模拟相对敏感性34,35,36.</li>
	<li>量化量子捕获37 对于每种光感受器，均包括单个38 和双锥细胞39,40，通过在鸟类视觉光谱范围内对蛋壳反射率、光感受器敏感性以及适当的辐照度光谱的乘积进行积分即，300-700 nm）
	<ol>
		<li>利用相对量子捕获估计值在鸟类四面体颜色空间内生成坐标37,41确保这些相对量子捕获的总和为1，与量子捕获不同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用量子捕获值（步骤 3.10）估算宿主蛋壳颜色（见步骤 2.6.1）与每种外来蛋表观颜色之间的可分辨性，以 JND 为单位，采用基于神经噪声限制的视觉模型36,42,43.
	<ol>
		<li>如果可能，使用与测量模型卵相同的分光光度计和光源来测量宿主自身卵壳的颜色（步骤 3.7）。 
		注意：由于实际或操作上的限制，这可能无法实现，此时可测量来自不同巢穴的部分宿主卵，以确定宿主卵壳颜色的平均值。</li>
		<li>使用长波敏感视锥细胞的韦伯分数 0.144.</li>
		<li>考虑视锥细胞的相对丰度以及双视锥细胞的主要组成部分34. 
		注意：若所使用的卵颜色仅对应于自然蛋壳颜色的渐变，则宿主卵与实验卵之间的JND可乘以1或−1，以区分两端极端的差异例如，蓝绿色或棕色，参见步骤1.1.1–1.1.2）。若所用卵的颜色跨越多个梯度或覆盖整个颜色空间，应使用感知均匀的色度图总结卵之间可感知的颜色差异45该类图中的坐标描述了实验卵与宿主卵颜色之间感知色差的方向和大小，这些数据可用于进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 野外工作
<ol>
	<li>确定要研究的物种。 
	注意：需考虑的因素包括（但不限于）宿主和/或寄生虫物种的丰度，以及宿主是否为可抓握的46 或穿刺47 拒收者，这将影响所用鸡蛋的类型（例如，不要使用坚硬的人工模型蛋进行穿刺弹射器实验48).</li>
	<li>在研究区域内系统性地搜寻鸟巢。查阅以往的繁殖记录，这些记录可为某些物种提供合理的搜寻起点49. 
	注意：可见标记或标识可能会增加被捕食的风险50；因此，建议改用便携式GPS。</li>
	<li>每天通过直接观察或视频记录的方法监测这些巢穴，记录每枚宿主卵的存在情况，直至实验开始（步骤4.4）；例如，在产完卵后一天开始。 
	注意：此每日监测将持续进行，直至实验结束（步骤 4.6）。
	<ol>
		<li>听到成年个体发出的警戒叫声时应立即离开该区域，若警戒叫声持续超过30秒。当有潜在的巢捕食者出现时，切勿接近鸟巢，尤其是视觉导向型捕食者存在的情况下例如，鸦科）</li>
		<li>从不同位置接近和离开巢穴， 即，经过巢穴时留下较少的化学痕迹，从而使哺乳类捕食者无法直接通过化学线索定位巢穴。 
		注意：此方法在某些生境中可能不可行，例如茂密的芦苇丛。</li>
		<li>始终尽量减少对巢穴及其周围区域的物理干扰。</li>
		<li>在筑巢期间不要靠近鸟巢，因为许多鸟类在产卵前若受到干扰会弃巢50.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻地将实验用卵滑入宿主鸟巢的巢杯侧边，放入巢中。切勿直接投放实验模型，以免损坏宿主的卵。 
	注意：随机分配处理组。
	<ol>
		<li>记录寄主亲鸟是否停留在附近，从而有机会目睹人工寄生行为51记录并进行统计控制，以反映宿主是否从巢中被惊飞的变量51在亲代不在时进行卵的引入。</li>
		<li>如果系统中的寄生虫移除了寄主卵，则收集一个寄主卵。 
		注意：对于移除卵子不会影响宿主对实验卵反应的宿主种类，此步骤可能并非必要22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用一组对照巢（即被访问、检查并触碰卵但不添加或替换实验卵的巢）来确定自然弃巢率。仅当实验巢中移除了宿主卵时，才可从对照巢中移除宿主卵（见步骤 4.5.1）。 
	注意：这一点至关重要，因为弃巢行为可能并非针对某些外来卵的特异性反应，而是对其他类型卵的普遍反应。
	<ol>
		<li>选择对照巢穴的数量 先验的 根据已知或预期的样本量和估计效应大小分配每个 nth&#160;将该巢作为对照巢，直至通过统计分析确定弃巢行为是否为宿主对实验卵的响应（步骤5.1）。 
		注意：若移除宿主卵，需移除与实验处理组相同数量的宿主卵，用手握住一枚宿主卵5秒后放回原处，并在巢内停留与实验组巢相同的时间。若不移除宿主卵，则用手握住一枚宿主卵5秒后放回原处，在巢内停留的时间应与在实验组巢停留的时间相同（例如，10秒）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复检查鸟巢，以确定每个宿主巢穴的反应，包括对照组。在实验处理后几小时内检查巢穴。 
	注意：在某些物种中，排斥行为可能在实验性寄生操作当天发生；因此，实验操作后数小时内检查巢穴非常重要52.
	<ol>
		<li>使用伸缩镜检查巢穴，以避免与巢或卵团直接接触。</li>
		<li>避免在恶劣天气（如降雨、高温或低温）条件下进行观察，因为这可能增加对雏鸟和鸟卵的危险50.</li>
		<li>每天进行检查，直至寄主对引入的卵产生反应或达到一定时间。 
		注意：按照惯例，若卵在巢中保留5-6天，则认为宿主为接受者22；然而，某些宿主个体的反应甚至更晚53 遗漏此类反应必然会导致卵子拒绝率估计出现偏差。理想情况下，研究人员应确定其系统中拒绝反应潜伏期的95%家族-wise置信区间上限，并将其作为判断标准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 统计分析
<ol>
	<li>在完全随机化的研究中使用费舍尔精确检验（即，实验组与对照组巢穴完全交错分布，因此在产卵日期、窝卵数或任何其他已知影响弃巢行为的参数上均无差异），以比较对照组（步骤 4.5）与处理组巢穴之间的弃巢数量。否则，应采用包含潜在相关协变量的广义线性模型（GLM），这是一种通常更为谨慎的方法。
	<ol>
		<li>若实验组巢穴的弃巢率显著高于对照组巢穴，则将被移除的卵和被遗弃的卵均编码为“拒绝”。 
		注：按照惯例，当宿主识别出寄生卵并将其移除或连同整个巢穴一并遗弃时，即视为宿主“拒绝”了该卵。</li>
		<li>若实验组与对照组巢穴的弃巢率无显著差异，则在分析中排除弃巢事件，因为这并非宿主对寄生行为的反应，并将反应编码为“弹出”。 
		注：按照惯例，“弹出”指卵实际已被从巢中移除。</li>
		<li>记录宿主拒绝卵的具体日期和时间。根据步骤 5.1.1 至 5.1.2 的结果重新编码反应变量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>报告费舍尔精确检验结果、相应的比值比（odds ratio）及其适当的置信区间。</li>
	<li>确定可用于预测模型中的任何有意义的协变量（例如，步骤 5.4–5.5）。
	<ol>
		<li>明确每个协变量的编码方式（例如，连续型、分类型或有序型）。</li>
		<li>将日期编码为有序日数，并在每年内分别对日期进行中心化处理，以消除因年份或季节性变化可能带来的混杂效应7,51,54,55。</li>
		<li>对参与交互作用的协变量进行中心化处理，以便在模型输出中更易于解释其低阶项。 
		注：对协变量进行标准化处理有助于在不同研究间直接比较效应大小，有时还能改善模型的收敛性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用具有二项误差分布和 logit 链接函数的广义线性模型（GLM）或广义线性混合模型（GLMM）来预测宿主反应（弹出或拒绝 vs 接受）。 
	注：选择 GLM 或 GLMM 取决于数据结构以及是否包含随机效应（例如，巢穴 ID、年份）。随机因子应至少具有 5 个水平，否则其方差估计可能不准确56。
	<ol>
		<li>报告决定系数（通常为 R2），以说明线性模型解释的方差比例57,58。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用具有负二项误差分布的广义线性模型（若数据无过度离散，也可使用泊松误差分布）和对数链接函数，预测鸟类对实验性寄生行为的反应所需时间。 
	注：研究人员将鸟类产生反应所需的时间称为“反应潜伏期”（latency to response），应精确到天；因此，在实验当天即被拒绝的卵其潜伏期为零。对于包含过多零值（&#62;50%）的反应变量，应使用零膨胀模型或 Hurdle 模型进行建模59。</li>
	<li>使用诊断工具检查模型对数据的拟合是否充分，并报告模型摘要统计量，以量化模型解释的方差比例60,61。报告决定系数（通常为 R2），参见步骤 5.4.2。
	<ol>
		<li>通过生成分位数-分位数图并将 Pearson 残差对拟合值作图，进行图形化验证，以评估负二项模型的拟合效果。 
		注：一个良好拟合的模型应无异常值或意外模式59。</li>
		<li>使用优度检验（如 Hosmer-Lemeshow 检验）以及 R 软件包 'binomTools' 中提供的其他诊断工具对二项模型进行验证，该包包含一整套诊断功能62。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确保研究间的一致性和可比性，应考虑控制一致的协变量。 
	注：常见的协变量包括窝卵数22、产卵日期63、操作时的巢龄53，以及宿主在操作时是否从巢中惊飞51。许多早期研究未使用任何协变量。作者应考虑额外分析卵类型（或不同梯度）的效应而不包含协变量，以使结果在数量上可与未使用协变量的研究进行比较。
	<ol>
		<li>采用信息理论方法，报告多个可能解释宿主行为的模型的平均结果64。 
		注：也可使用逐步回归分析作为模型选择算法65。研究人员应预先设定选择标准（例如，调整后 R2、Mallows' Cp、赤池信息准则 AIC、贝叶斯信息准则 BIC 或 p 值），并同时提供完整模型（含常见协变量）和最终简化模型。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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尽管弃卵实验是研究巢寄生者与宿主共同进化的最常用方法70，但目前尚缺乏对材料、技术或实验方案进行标准化的系统性努力。这一点对于元分析尤为不利。据我们所知，迄今为止尚无任何关于宿主弃卵行为的元分析控制了各研究之间在方法学上的差异71,72，包括对“拟态卵”或“非拟态卵”的界定标准。这是一个严重的问题，因为从人类标准来看具有拟态特征的卵有时反而比看似非拟态的卵更常被宿主拒绝73，这表明人类对颜色的分类在推断鸟类认知能力方面既不充分也不恰当18。此外，元分析往往忽略了这样一个事实：即使针对同一宿主物种的研究，对弃巢行为的处理方式也存在差异，有的研究将其计入反应结果22，而有的则将其排除在分析之外7,71,</su...

巢寄生者将卵产在其他物种的巢中，由这些宿主代为抚育其后代，并承担亲代抚育的相关代价1,2,3。寄生者通过欺骗手段逃避宿主识别，而宿主则通过侦测机制识别寄生者，这种相互博弈对双方均构成强烈的自然选择压力。在某些鸟类巢寄生案例中，宿主对异源寄生卵的识别能力促使寄生者演化出模拟宿主卵外观的特征，从而在宿主与寄生者之间引发协同进化的军备竞赛4。研究巢寄生现象具有重要意义，因其为研究自然界中协同进化动态与决策行为提供了理想的模型系统5。卵排斥实验是野外研究鸟类巢寄生现象最常用的方法之一，也是生态学家探究种间相互作用的重要工具6。
在进行卵排斥实验的过程中，研究人员通常会引入天然卵或模型卵，并在标准化的时间段内评估宿主对这些实验卵的反应。此类实验可能包括在不同巢穴之间交换外观各异的真实卵7，或对真实卵的表面进行染色或涂绘（可选择性添加图案）后将其放回原巢8，或制作具有人为操控特征的模型卵，例如颜色9、斑点10、大小11和/或形状12。宿主对不同外观卵的反应可提供重要信息，揭示其在做出卵排斥决策时所依赖的识别依据13，以及卵的差异需达到何种程度才能引发排斥反应14。最优接受阈值理论15指出，宿主应通过比较自身卵（或其内部模板）与寄生卵之间的差异，权衡误接受寄生卵（接受错误）或误移除自身卵（排斥错误）的风险，从而做出决策。因此，存在一个接受阈值，当刺激超过该阈值时，宿主即认为差异过大而无法容忍。当寄生风险较低时，接受错误的风险也较低；而当寄生风险较高时，该风险则上升；因此，宿主的决策具有情境依赖性，并会随着感知风险的变化而相应调整14,16,17。
最优接受阈值理论认为，宿主的决策依赖于宿主与寄生虫表型的连续变异。因此，要确定一个具有自身表型变异的宿主种群对一系列寄生表型的耐受程度，必须测量宿主对不同寄生表型的反应。然而，迄今为止几乎所有相关研究都依赖于分类的卵色和斑纹处理（例如，拟态/非拟态）。只有当宿主蛋壳表型不发生变化时——而这在生物学上并不现实——所有反应才能直接比较（无论拟态程度如何）。否则，在不同种群内部和之间，“&#34;拟态&#34;”卵模型与宿主卵的相似程度会有所不同，这在比较研究结果时可能引起混淆18。理论表明，宿主的决策依据是寄生卵与其自身卵之间的差异14，而不一定取决于某种特定的寄生卵颜色。因此，除非实验关注的是卵模型类型与个体宿主卵色之间的最小可觉差（下文简称 JND），否则使用单一类型的卵模型并非检验宿主决策阈值或辨别能力假设的理想方法。这一局限性同样适用于通过交换或添加自然卵来测试宿主对自然颜色范围反应的实验研究19。然而，尽管这些研究确实允许宿主和寄生虫表型存在变异，但其受限于性状中自然存在的变异范围6，尤其是在使用同种卵时7。
相比之下，制作各种颜色人工卵的研究人员则不受自然变异的限制（例如，他们可以研究对超常刺激的反应20），使其能够探究宿主感知能力的极限6近期研究采用新型技术，通过绘制旨在匹配并超越蛋壳自然变异范围的实验性卵蛋，来测量宿主在表型范围内的反应9 以及斑点颜色21研究宿主对颜色呈梯度变化的卵的反应可以揭示潜在的认知过程，因为理论预测（如接受阈值）15 或协同进化拟态4，基于性状之间的连续差异。例如，通过使用这种方法，Dainson 等21 已证实，当蛋壳底色与斑点颜色之间的色度对比度更高时，美洲知更鸟 Turdus migratorius 更倾向于强烈拒绝寄生卵。这一发现为研究该宿主如何通过斑点特征等信息识别并决定是否移除寄生卵提供了重要见解。通过定制颜料混合物，研究人员能够精确调控实验卵颜色与宿主卵颜色之间的相似度，同时标准化其他干扰因素，例如斑点模式。10卵的大小22 和卵形23.
以促进进一步的重复实验与元重复研究24 在经典和近期的卵子排斥研究中，科学家采用在系统发育（不同宿主物种）中标准化的方法学至关重要7,22，空间（不同宿主种群）7,22,25,26 以及时间（不同的繁殖季节）7,22,25,26,27，这种情况极为少见。尚未标准化的方法学28 后来被证明会导致人为假象结果29,30本文为研究人员提供了一套指导方案，用于重复此类考察对连续变异反应的卵排斥实验，并强调了若干重要的方法学概念：对照巢的重要性， 先验的 假设、元重复、伪重复以及颜色和光谱分析。尽管卵排斥实验在鸟类宿主-寄生虫协同进化领域占据主导地位，但目前仍缺乏一套全面的实验方案。因此，这些指南将成为提高实验室间和实验室内可重复性的重要资源，因为对任何假设的真正检验在于元重复。 即，跨系统发育、空间和时间重复整个研究24，只有在使用一致的方法时才能有意义地完成29,30,31.

<table><tbody><tr><td>Replicator Mini +</td><td>Makerbot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 钴蓝绿浅色</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28382</td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 钛白</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28489</td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 钴绿</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28381</td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 钴蓝绿</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28449</td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 烧赭</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28433</td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 氧化铁红</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28486</td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 镉橙</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28437</td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 生赭浅色</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28391</td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 黄土色</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28491</td><td></td></tr><tr><td>专业丙烯颜料 火星黑</td><td>Winsor &amp; Newton</td><td>28460</td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>Utrecht</td><td>206-FB</td><td>圆头笔刷</td></tr><tr><td>画笔</td><td>Utrecht</td><td>206-F</td><td>平头笔刷</td></tr><tr><td>吹风机</td><td>Oster</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>光纤电缆</td><td>Ocean Optics Inc.</td><td>OCF-103813</td><td>1 米定制分叉光纤组件，带蓝色拉链管（PVDF），标称外径护套 3.8 mm，双分支</td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>Ocean Optics Inc.</td><td>Jaz</td><td>光谱仪单元，配备 50 μm 狭缝宽度，安装有 200–850 nm 检测器（DET2B-200-850）和光栅选项 #2</td></tr><tr><td>光谱仪电池和 SD 卡模块</td><td>Ocean Optics Inc.</td><td>Jaz-B</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>Ocean Optics Inc.</td><td>Jaz-PX</td><td>脉冲氙灯光源</td></tr><tr><td>白色标准板</td><td>Ocean Optics Inc.</td><td>WS-1-SL</td><td>由 Spectralon 材料制成</td></tr><tr><td>OHAUS Adventurer Pro 天平</td><td>OHAUS</td><td>AV114C</td><td>精密微量天平</td></tr><tr><td>Gemini-20 便携式秤</td><td>AWS</td><td>Gemini-20</td><td>标准秤</td></tr><tr><td>空铝制颜料管（22 ml）</td><td>Creative Mark</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>伸缩镜</td><td>SE</td><td>8014TM</td><td></td></tr><tr><td>GPS</td><td>Garmin</td><td>Oregon 600</td><td></td></tr><tr><td>220 目砂纸</td><td>3M</td><td>21220-SBP-15</td><td>极细砂纸</td></tr><tr><td>400 目砂纸</td><td>3M</td><td>20400-SBP-5</td><td>极细砂纸</td></tr><tr><td>色彩分析软件：&amp;lsquo;pavo&amp;rsquo;，一个 R 软件包</td><td>用于 &lt;em&gt;R: 统计计算的语言与环境&lt;/em&gt;</td><td>v 1.3.1</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/pavo/index.html</td></tr><tr><td>UV 透明清漆</td><td>Flock off!</td><td>UV-001</td><td>一种透明的紫外涂料</td></tr><tr><td>塑料三明治袋</td><td>Ziploc</td><td></td><td>可在超市购买的普通 Ziploc 塑料三明治袋</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>11 × 21 cm Kimwipes 擦拭纸</td></tr><tr><td>牙刷</td><td>Colgate</td><td></td><td>牙刷</td></tr></tbody></table>

利用表型梯度上的卵排斥实验探究卵识别能力的极限

Probing the Limits of Egg Recognition Using Egg Rejection Experiments Along Phenotypic Gradients

巢寄生者将卵产在其他雌鸟的巢中，由宿主亲鸟负责孵化并抚育其后代。研究巢寄生者如何操纵宿主抚养其后代，以及宿主如何识别寄生行为，为协同进化生物学领域提供了重要的科学见解。像杜鹃和拟鹂这类巢寄生者获得了进化上的优势，因为它们无需承担抚育自身后代的代价。然而，这种代价促使宿主进化出针对寄生者各个发育阶段（包括卵、雏鸟和成鸟）的防御机制。卵排斥实验是研究宿主防御行为最常用的方法。在实验过程中，研究人员将一枚实验用卵放入宿主巢中，并观察宿主的反应。通常会操控卵的颜色，预期宿主对卵的辨别概率与其自身卵和实验卵之间的颜色差异程度呈正相关。本文旨在为开展卵排斥实验提供指导，涵盖从制作颜色一致的实验卵的方法到实验结果分析的全过程。特别关注一种新方法，即使用沿颜色梯度分布的独特颜色卵，该方法有望揭示宿主识别过程中的颜色偏好。若缺乏标准化操作，不同研究之间的结果将难以进行有意义的比较；本领域内建立统一的标准实验方案，将有助于后续实验获得更加准确且可比的结果。

制备彩色蛋模型
定制油漆混合物与天然鸟蛋的反射光谱如图1A-1D所示。在巢寄生研究中所使用的油漆混合物，其光谱形状（颜色）和反射强度（亮度）应与天然鸟蛋的反射测量值高度一致。若能达到这一标准，实验用蛋的颜色将被宿主视为自然的蛋壳颜色。为了评估宿主的识别能力，这些反射光谱需转换至相关的鸟类色觉空间。为此，可通过积分反射光谱、太阳辐照度和光感受器敏感性的乘积，计算出量子捕获量37。鸟类的色觉与人类不同，因其使用四个而非三个光感受器来感知颜色。这四个感受器的量子捕获量可转换为四面体色觉空间中的坐标（图1E），其中每个顶点代表一种特定光感受器的相对刺激程度：紫外、短波、中波和长波敏感型光感受器...

本方案提供了进行卵排斥实验的指导：概述了绘制实验卵模型的技术，以模拟天然鸟类卵的颜色，以及野外工作的开展和所收集数据的分析方法。本方案为开展可比较的卵排斥实验提供了一种统一的方法。

巢寄生者将卵产在其他雌性的巢中，由宿主亲鸟负责孵化和抚育其后代。研究巢寄生者如何操控……

该方法有助于解答进化生态学领域的一些关键问题，例如宿主如何区分自己的卵与寄生者的卵。该技术的主要优势在于提供了一种可重复的卵排斥实验方法。首先，在一个3D打印或手工制作的模型卵表面均匀涂抹一层钛白漆。使用吹风机的冷风档加速干燥。待蛋壳干燥后，使用高质量的丙烯颜料为蛋壳上色，使其具有独特的外观。可先用画笔手工绘制斑点，再用牙刷喷溅颜料以增加效果。为了量化颜色，使用分光光度计。首先，将 SD 卡插入分光光度计中。要将 SD 卡连接到系统，请在控制界面中选择文件系统，然后选择查找 SD 卡。通过按下 Home 按钮完成此操作。接下来，将光纤电缆连接到光谱仪和光源。沿着电缆连接，确保将正确的端口连接到对应的接口。然后，将定制的探头尖端插入光纤探头末端。操作前，用95%乙醇清洗探头尖端。接下来，连续按三次向下按钮以打开光源。首先，选择 PX 灯，然后选择设置，最后在定时控制中选择自由运行模式。随后，等待至少 15 分钟后再进行任何测量，以使仪器充分预热。在仪器预热期间，请注意使用标准化的蛋与探头之间的距离进行颜色测量，该距离应能获得最佳的信噪比。从大约五毫米处开始，并据此进行调整。机器预热后，进行校准。首先按下“主页”按钮以选择“工具”。然后，从菜单中选择手动控制，再选择采集参数。现在，设置盒式移动平均平滑。将光标向右移动两次，然后使用向上按钮将盒式移动平均设置增加至5。使用绿色确认按钮保存更改。接下来，依次按下向下、向右、向右，将平均次数设置为10。使用向上按钮滚动设置十位数，然后向右移动一位，设置个位数的数值。完成后，按下绿色确认按钮。接着，按下“Home”（主页）按钮并选择“Reflectants”（反射体）选项。然后，将探头牢固地放置在白色标准板上，并通过按下“Up”（向上）按钮保存该数值。现在，将探头放置在远离光线的黑暗区域。然后，通过按向右滚动按钮存储暗标准，并通过按菜单下按钮查看反射率。接着，对每个蛋壳的反射率测量六次。在钝极附近测量两次，在赤道处测量两次，在尖极处测量两次。务必报告是否避开了斑点区域。对实验用卵以及实验卵拟模拟的天然宿主卵均进行上述测量。以常规的谨慎方式接近被监测的鸟巢。然后，通过将实验用卵轻轻滑入鸟巢杯状结构的一侧，将其放入寄主巢中。切勿抛掷实验模型，以免损坏寄主的卵。鸟类不得观察到卵的引入过程，若无法避免，则需在统计上控制实验时鸟类的存在情况。我们在多个物种中发现，这有助于解释它们的卵排斥行为。每次操作均应在每个巢穴停留相同的时间，然后撤离。在数小时内及之后定期重新检查所有鸟巢，以确定宿主鸟类对实验卵的反应。检查鸟巢时，应使用伸缩镜以避免与鸟巢或卵直接接触。在巢寄生研究中所使用的颜料混合物，其光谱形状和强度应与自然反射率的测量值高度一致。如果在紫外和可见光范围内均实现这一点，则宿主将把实验卵的颜色感知为自然颜色的卵。鸟类的颜色感知依

probing-limits-egg-recognition-using-egg-rejection-experiments-along

Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

基于表型梯度的鸡蛋排斥试验对鸡蛋识别极限的探讨

胚胎易于获取的特点使得研究人员能够采用多种方法进行细胞命运图谱的绘制实验，包括鸡-鹌鹑嵌合体和局灶性染料标记等技术。本文中，我们展示了一种已优化用于延长存活时间的卵子制备方法。...

用于发育研究的鸡胚开窗法

Drosophila 卵收集与去壳：一种去除卵最外层的方法

Drosophila 卵产选择偏好实验：一种用于检测果蝇决策行为的方法

C. elegans 的产卵行为可为发育、生殖和解剖学研究提供重要信息。...

产卵实验：一种用于定量分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）产卵行为的方法

本文介绍了一种通过自然交配产生斑马鱼胚胎并对其发育阶段进行分选的实验方案。该方案进一步用于利用转基因鱼分析胰腺β细胞。...

交配与卵子分期：一种按发育阶段生成并分选胚胎的方法

本方案中所述的直立成像方法可实现对发育中黑腹果蝇（Drosophila...

直立成像 果蝇 卵室

我们描述了一种利用Xenopus卵母细胞和动物帽系统进行基因表达克隆的方法，可用于筛选能够诱导有反应能力的外胚层产生应答的基因，并讨论了对这些基因进行后续分析的技术。该系统在多种基因产物的功能鉴定中具有重要应用价值。...

使用 Xenopus 卵母细胞表达系统进行功能克隆

本方案描述了一种高通量检测黑腹果蝇（Drosophila...

高通量检测方法用于分析个体产卵偏好 黑腹果蝇

在此，我们介绍一种用于测定生物体偏好环境温度的实验方案。 果蝇...

一种用于测定生物体温度偏好的温度梯度实验方法 果蝇 幼虫

本文介绍了一种蟋蟀卵显微注射的实验方案，该技术是开展蟋蟀多种实验研究的基础方法，包括但不限于RNA干扰和基因组编辑。...

注射Gryllus bimaculatus卵

学习鸟类卵排斥实验的标准化方法，使用钛白涂料和丙烯颜料制作模型卵，通过光谱仪量化颜色，在野外观察宿主对寄生卵的识别与排斥行为。该方案为进化生态学中宿主-寄生者相互作用研究提供了可重复的技术手段。

利用表型梯度上的卵排斥实验探究卵识别能力的极限

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