Name: 用 Bioinspired 法制备功能性二氧化硅 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学习仿生法制备功能性二氧化硅材料并实现酶的原位固定化。该方法快速环保，可在五分钟内完成合成，通过快速酸中和步骤调控材料性能，为生物材料研究提供高效可控的绿色合成策略。

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作者感谢谢菲尔德大学化学与生物工程系以及英国工程与自然科学研究委员会（EPSRC，项目编号 EP/L017059/1 和 EP/P006892/1）提供的经费支持。

1. 前驱体溶液的制备（以及可选的封装剂溶液）
<ol>
	<li>将1.5 mmol硅酸钠五水合物（318.2 mg）加入一个180 mL塑料容器中，用20 mL去离子水溶解。</li>
	<li>同样，在另一个容器中称取0.25 mmol的五乙烯六胺（PEHA，58.1 mg），溶于20 mL去离子水中。
	<ol>
		<li>使用其他含胺化合物时 例如，二乙烯三胺（DETA）或三乙烯四胺（TETA），确保总Si:N摩尔比保持恒定为1即， 对应于所述步骤中的0.5 mmol DETA或0.375 mmol TETA15.</li>
		<li>使用聚合胺类添加剂时 例如，聚乙烯亚胺（PEI）或盐酸聚烯丙基胺（PAH），保持浓度为1 mg/mL（终反应体积）15. 
		警告：仅可在通风橱内操作这些胺类物质，因其纯品具有腐蚀性或毒性（尤其是其蒸气）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行 原位 合成过程中进行包封时，将预定质量的蛋白质（此处为50 mg牛血清白蛋白，BSA）溶解于5 mL去离子水中。从用于溶解五水合硅酸钠的去离子水体积中扣除该部分水量。
	<ol>
		<li>为在不改变蛋白质结构的前提下促进其溶解，与去离子水混合后，应盖紧容器并置于 4 °C 环境中保存。应定期检查溶解进程，最好避免搅拌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 二氧化硅合成
<ol>
	<li>将五水合硅酸钠和PEHA溶液加入一个180 mL容器中，并加入足够的去离子水，使最终溶液体积达到41 mL（或46 mL，若 原位 包封步骤被省略。</li>
	<li>将新配制的硅酸钠与PEHA溶液混合物置于搅拌器上，并加入搅拌子以确保混合均匀。</li>
	<li>将 pH 探针悬入该容器中，记录初始 pH 值。
	<ol>
		<li>此步骤可选：可取750 µL初始混合液作为样品，用于后续按照步骤8.1所述的钼蓝分光光度法测定初始[Si]浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过加入预先计算好的一定量的 1 M HCl 开始合成反应，该用量由 图1，并观察浊度的即时变化（参见 图2)</li>
	<li>酸添加一结束，应尽快加入包封剂溶液（如有）。 
	注意：上述试剂用量最终得到50 mL总反应混合物体积，其中Si和N的浓度均为30 mM。通过将上述所有用量乘以相同倍数，可按需进行规模放大。</li>
	<li>5分钟后记录pH值以确定反应是否完成；确保pH值为7 ± 0.05。</li>
</ol>
3. 材料的酸洗脱
<ol>
	<li>在反应完成后（无论是直接使用生成的凝胶还是重新悬浮先前合成的二氧化硅样品），通过添加额外的酸来调节所生成二氧化硅的组成。</li>
	<li>若需重新悬浮二氧化硅，取约150 mg已制备的仿生二氧化硅与100 mL去离子水加入180 mL塑料容器中，并置于搅拌器平台上搅拌。</li>
	<li>待悬浮液充分混匀后，将pH探针浸入容器中。</li>
	<li>继续滴加HCl，直至达到目标pH值（介于7至2之间），并静置约1分钟使其稳定。</li>
	<li>再等待5分钟，以确保体系完全平衡，随后进行固体二氧化硅的分离。</li>
</ol>
4. 二氧化硅的分离与干燥
<ol>
	<li>将仿生二氧化硅悬浮液倒入50 mL离心管中。</li>
	<li>在5,000 g条件下离心15分钟。</li>
	<li>离心后弃去上清液并储存以备进一步分析（例如 Bradford法测定，见下文）。用去离子水重新填充离心管，并使用涡旋混合器重新悬浮二氧化硅。</li>
	<li>重复离心、上清液储存和重新悬浮操作两次。</li>
	<li>最后一次离心后，弃去上清液，并将二氧化硅刮入陶瓷坩埚中。</li>
	<li>在85 °C烘箱中过夜干燥。
	<ol>
		<li>若已发生包封，应使用冷冻干燥设备或在真空条件下运行的烘箱，以避免蛋白质变性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 用于[Si]测定的钼蓝试剂（MBR）的制备
<ol>
	<li>在通风橱中，向一个塑料1 L容量瓶中加入8 mmol（10 g）四水合钼酸铵。</li>
	<li>在搅拌下，用500 mL去离子水溶解。</li>
	<li>小心加入60 mL 10 M HCl溶液，将溶液酸化。</li>
	<li>将体积定容至1 L。</li>
</ol>
6. 用于[Si]测定的对氨基苯酚硫酸盐还原剂（RA）的制备
<ol>
	<li>在通风橱内，将一个500 mL玻璃容量瓶置于搅拌器上，并放入室温水浴中。</li>
	<li>加入111 mmol（10 g）无水草酸、19.5 mmol（3.35 g）对氨基苯酚硫酸盐和16 mmol（2 g）亚硫酸钠，用250 mL水溶解。</li>
	<li>在搅拌下小心缓慢加入92 g（50 mL）饱和硫酸，待溶液冷却。</li>
	<li>最后用去离子水定容至500 mL。</li>
</ol>
7. 单体硅物种的硅钼酸测定法
<ol>
	<li>在5 mL塑料小瓶中，将5.4步骤制备的300 µL MBR用3 mL去离子水稀释。</li>
	<li>加入10 µL硅酸盐测试溶液，振荡混匀。 
	注意：该溶液将缓慢变为黄色。</li>
	<li>准确反应15分钟后，加入1.6 mL由第6节制备的还原剂，将黄色的硅钼络合物还原为其蓝色异构体。</li>
	<li>让蓝色显色至少2小时，但不超过24小时。</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计在810 nm处测定样品的吸光度，并根据标准曲线计算[Si]浓度。</li>
</ol>
8. 聚合硅物种上的硅钼酸测定法
<ol>
	<li>采用钼蓝法测定多硅酸盐物种浓度时，在微量离心管中加入 750 µL 的 2 M 氢氧化钠溶液和 750 µL 硅悬浮液。</li>
	<li>密封后将离心管放入微量离心管浮架中。
	<ol>
		<li>确保管内留有足够的顶空空间，以防止因压力积聚导致管体破裂。 
		注意：通常保留 500 µL 的顶空空间即可避免此问题。或者，也可在敞口小瓶中进行该操作，但需考虑蒸发造成的液体损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将微量离心管置于 80 °C 水浴中漂浮，并静置溶解 1 小时。</li>
	<li>1 小时后，取出微量离心管并擦干外壁。</li>
	<li>待冷却后，可按照上述第 7.2 至 7.5 步所述方法测定 [Si]。</li>
</ol>
9. 采用 Bradford 法测定硅胶中蛋白质浓度的实验步骤
<ol>
	<li>在指定的比色皿中加入预定体积的（室温）考马斯亮蓝试剂和样品（具体体积见表1和表2）。每个比色皿均使用一次性移液器吸头，以避免因试剂性质导致的体积变化，并对每个样本进行三次重复测定。</li>
	<li>通过倒置混合各比色皿3次，室温静置10分钟使其充分显色。</li>
	<li>以纯净上清液作为空白对照，在595 nm波长下测定吸光度。</li>
	<li>通过从每个样品的吸光度值中减去对照样品（两组实验中的0号比色皿）的吸光度，计算各比色皿的原始吸光度。</li>
	<li>利用标准曲线（图3）计算未知样品的蛋白质浓度。若原始样品经过稀释，则需计入稀释倍数。
	<ol>
		<li>通过将测得的吸光度值对牛血清白蛋白（BSA）浓度作图，为每组实验建立标准曲线，以消除可能影响检测灵敏度的随机波动。</li>
		<li>尽管该蛋白质测定法通常使用BSA作为标准品来定量各类蛋白质，但为提高准确性，建议针对每种目标蛋白质单独建立标准曲线。</li>
		<li>若未知样品的蛋白质含量预计超出标准曲线的检测范围，应根据需要进行适当稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在样品重悬过程中测定每份样品的蛋白质含量，以监测可能发生的蛋白质损失。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

在本研究中，我们介绍了一种快速沉淀仿生二氧化硅材料并将其用于包封生物分子的方法。我们重点展示了实验过程中的关键步骤，即引发反应所需加入的酸量以及生物分子包封剂的加入时机。我们展示了酸添加量对反应进程和产率的影响（分别为图4和图5），并演示了一种对合成条件进行精确控制的方法，从而在存在敏感性的情况下仍可实现结果的一致性。关于活性物质的包封，尽管操作步骤简单，但包封效果被证明对实验条件（添加顺序、添加时的pH值、环境条件）较为敏感；然而，通过规范操作仍可实现材料性能的一致性。
可通过使用不同的添加剂来调整合成条件，其中许多添加剂已在其他文献中发表。15 提供多种形貌和孔隙结构。此外，已有报道通过后合成技术对仿生二氧化硅材料进行修饰和化学定制，例如温和纯化方法13 以及表面胺基修饰。20 最后，由于该合成反应条件温和且以水为介质， 原位 封装适用于比本实验所展示的更广泛的底物范围，包括从酶开始的各种物质17,18 完整细胞21 金属盐，22 活性药物成分，23 和量子点。24
与其他有机介导的二氧化硅合成方法（如MCM-41或SBA-15系列材料）不同，仿生添加剂的多功能性无法形成有序的孔道结构，也无法产生类似Stöber型二氧化硅所具有的高度单分散的粒径分布。25 这是由于仿生添加剂（特殊情形除外）缺乏明确的胶束化行为，26 同时其催化活性较单功能含胺添加剂更高所致。26
另一方面，这种多功能添加剂的特性使得反应时间更短，反应温度更温和 &amp;与其它有机介导的二氧化硅合成方法相比，该方法具有较低的压力要求。这也使得如上所述的室温下添加剂洗脱成为可能，而由于表面化学特性的限制，这一目标在其它二氧化硅材料体系中尚未实现。27,28,29 因此，仿生二氧化硅材料已被证明在大规模生产中更具经济性和实用性，从而更易于实现商业化和进一步开发。14
总之，仿生二氧化硅合成是一种快速、简便的制备活性物种载体或气体吸附介质的方法。通过在反应过程中及反应结束后严格控制pH值，可制备出具有不同性质的多种二氧化硅-胺复合材料，这一优势还可与以下可能性相结合： 原位 封装多种不同的有机、无机或生物有机材料。尽管目前尚未实现对仿生添加剂和封装剂浓度的独立后合成修饰，但这些方法代表了迈向环境友好型化学工艺的有前景的一步。

二氧化硅作为工业催化剂的结构载体已有广泛应用，可提高催化剂的活性、稳定性和可加工性1，从而可能降低运行成本。在酶固定化方面，这种优势更为显著，因为将酶储存于二氧化硅孔道体系中，可显著延长其寿命，优于游离酶形式。因此，研究人员已投入大量精力，致力于寻找将酶固定于二氧化硅材料的最佳方法，并已有多种综述对不同固定化方法在硅基固体载体上的应用进行了比较分析2,3,4。
酶通常通过物理吸附或共价结合的方式固定，此外还可将其包埋于多孔材料中。5 然而，每种方法均存在显著的局限性：物理吸附依赖于二氧化硅与生物分子之间的瞬时表面相互作用，这种作用很容易因反应条件的变化而减弱，导致酶发生不可接受的泄漏。共价结合虽然更为牢固，但通常会因活性物质构象自由度降低而导致酶活性下降。包埋法可能由于酶无法接触底物或存在扩散限制，从而导致活性降低。6
近年来，温和（常被称为“仿生”）二氧化硅合成领域的发展已确立 原位 在材料合成过程中对生物分子及其他活性物质的包封7,8,9 该方法克服了传统固定化的诸多缺陷——与化学吸附法不同，它通过较弱的非共价相互作用保持了生物分子的构象自由性；同时，由于孔腔在生物分子周围形成，仍可防止其渗漏。事实上，该封装技术已被证明适用于多种生物分子，甚至完整细胞。10 并且通过仿生二氧化硅包封，可避免因严苛的工艺条件导致的失活等效应。7,11
本方法旨在通过使用一种仿生有机添加剂，在常温条件下制备具有可控特性的多孔二氧化硅材料。该方法可轻松改进以包封无机或生物有机分子，本文将展示部分可选的包封实例。我们进一步展示了一种简便的方法，用于对合成后的材料进行改性，以获得理想的体相特性，并通过酸洗脱去除有机模板实现纯化。
与传统的模板化多孔二氧化硅载体合成方法相比（例如，通过超分子表面活性剂组装体（如 MCM-41 或 SBA-15）作为模板制备的二氧化硅材料12 该方法显著更快且更温和，能够实现定制化的 原位 无需多次固定化步骤和繁琐的纯化过程即可实现包封。此外，采用酸洗脱而非煅烧，为有机表面功能化提供了可能。
该方法适用于在活性物质固定化领域工作且发现物理吸附或共价固定化效果不佳的研究人员。对于从事工艺放大研究的人员而言，该方法同样具有应用价值，因为与传统的模板化二氧化硅材料相比，这种仿生合成方法在工业化方面具有独特优势。13,14 不建议将此方法用于需要材料内具有有序孔阵列的应用 例如，对于光子学而言，由于材料结构无序，即使整体性质相似，也会产生影响。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;二氧化硅合成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>五水硅酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>10070470</td><td></td></tr><tr><td>五乙烯六胺（PEHA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>292753</td><td></td></tr><tr><td>二乙烯三胺（DETA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D93856</td><td>有毒</td></tr><tr><td>三乙烯四胺（TETA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90460</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Polysciences</td><td>6088</td><td>1.2K 分子量</td></tr><tr><td>聚烯丙基胺盐酸盐（PAH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>283215</td><td>17.5k 分子量</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）1M</td><td>Fisher Scientific</td><td>10487830</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;硅钼酸检测法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>四水钼酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7302</td><td>产品已被 M1019 替代</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）37.0%wt</td><td>Fluka Analytical</td><td>84436</td><td></td></tr><tr><td>无水草酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75688</td><td></td></tr><tr><td>对氨基苯酚硫酸盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>10446880</td><td></td></tr><tr><td>亚硫酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234400</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84727</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bradford 检测法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动滴定仪 Titrando 902</td><td>Metrohm</td><td>2.902.0010</td><td></td></tr><tr><td>801 磁力搅拌器</td><td>Metrohm</td><td>2.801.0040</td><td>与上述设备配套使用</td></tr><tr><td>800 Dosino</td><td>Metrohm</td><td>2.800.0010</td><td>与上述设备配套使用</td></tr><tr><td>Aquatrode Plus</td><td>Metrohm</td><td>6.0253.100</td><td>与上述设备配套使用</td></tr><tr><td>离心机 Sorvall ST16</td><td>Thermo Scientific</td><td>11814243</td><td>货号对应 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>UV-Vis 分光光度计 Genesys 10A</td><td>Thermo Scientific</td><td>12104972</td><td>货号对应 Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

采用仿生法制备功能性二氧化硅

Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method

本方案旨在合成仿生二氧化硅材料，将酶包埋于其中，并通过酸洗脱对包埋产物进行部分或完全纯化。通过将硅酸钠与一种多功能仿生添加剂结合，在中和条件下即可在常温环境中快速形成二氧化硅。
研究了中和速率和生物分子添加位点对二氧化硅产率的影响，并报道了不同添加位点下的生物分子固定效率。与其他多孔二氧化硅合成方法相比，结果表明，仿生二氧化硅合成所需的温和条件完全适用于敏感生物分子的包埋。此外，整个合成与修饰过程均在温和条件下进行，使得仿生二氧化硅作为一种裸材料及活性载体介质，在规模化生产和商业化应用方面具有广阔前景。
该合成反应对条件表现出高度敏感性， 即， 中和速率和最终合成 pH 值，然而通过使用自动滴定方法可实现对这些参数的严格控制，从而在反应进程路径和产率方面实现高度可重复性。 
因此，仿生二氧化硅是一种优异的活性材料载体选择，在当前众多应用中表现出广泛的适用性，不仅限于本文所展示的应用，而且在未来应用中也具有巨大潜力。

上述技术能够稳定且可重复地沉淀二氧化硅。最明显的判断依据是反应容器内迅速出现浑浊，停止搅拌后，浑浊物会自发沉降形成一层致密的二氧化硅沉淀凝胶（图2）。通过分离后称量该凝胶的质量，可确认反应程度及产率，通常为 58 ± 6.5%（图4，黄色）。
通过改进钼蓝分光光度法，可进一步了解反应进程，该方法可用于检测未反应的单体硅酸盐物种的含量，以及已反应生成多硅酸盐或“低聚物”但尚未达到足够尺寸而发生凝聚的物种（图4，分别以红色和蓝色表示）。
在比较沉淀反应的不同滴定效率时，这种特定的硅酸盐形态数据尤为值得关注——即最终反应pH值以及达到该pH值的速率如何影响单体硅酸向“低聚物”的聚合及其随后凝聚为固相二氧化硅的过程。通过在步骤2.4中略微调整所添加酸的量，可实现对反应混合物的欠滴定或过滴定（图5）。在这两种情况下再次测定硅酸盐形态，尽管滴定曲线仅有微小变化（图5），但反应完成程度存在明显差异（图4）。
尽管在三种反应情况下，单体硅物种的消耗量没有差异（保持在29%至33%之间），但每种情况下沉淀的寡聚硅物种的量存在明显差异。这与传统的溶胶-凝胶二氧化硅理论一致：在“未达目标”情况下，pH值在较长时间内保持较高，使单个颗粒得以生长，从而促进有效的凝聚；而在“超过目标”情况下，由于滴定速度快，凝聚过程被迅速引发，因此较少的硅物种能够生长到足以凝聚的尺寸，导致更多物种仍滞留在胶体相中。16
鉴于滴定对二氧化硅形成的重要性， 先验的 了解适当的滴定体积至关重要。尽管由于胺类添加剂复杂的质子化行为以及凝结过程中二氧化硅表面酸性的变化，无法从反应化学计量关系中直接推导出滴定体积，但系统组分、浓度与滴定体积之间高度可靠的实证关系却易于建立。图1).
一旦凝固完成，即可通过酸洗脱的方法对材料表面进行便捷的修饰，该方法此前已有作者在其他文献中报道。13 这可以对材料的性质（如成分、孔隙率以及添加剂的化学活性）进行精细调控。图6a 和 b).
本研究以牛血清白蛋白（BSA）作为包埋酶的示例，但此处描述的技术可适用于多种酶17,18。蛋白质检测采用 Bradford 法19，使用每次离心后保存的上清液进行。通过标准曲线计算上清液中的蛋白含量，该标准曲线由已知浓度的 BSA 溶解于不含蛋白质的对照样品上清液中制备而成。包埋入二氧化硅中的蛋白量将通过从初始加入的蛋白量中减去上清液中检测到的蛋白量来计算。该检测所需的唯一试剂为 Bradford 试剂（可直接购买或按标准配方自行配制）。
根据样品体积、预期检测的蛋白含量以及所用检测方法的不同，共有三种类型的检测方法。本文所述方法适用于分光光度计，需使用一次性比色皿（包括常规尺寸和微量尺寸），可检测的蛋白浓度范围为 10 µg/mL 至 1.4 mg/mL。
在图7中，每次洗涤后（步骤4.3）检测到的蛋白量以初始蛋白量（50 mg）的百分比形式表示。第一次离心后，上清液中检测到约50%的BSA，表明固定化效率约为50%。由于在后续洗涤步骤中未检测到BSA，说明BSA（或其他酶）可在二氧化硅合成过程中被稳定包埋，无泄漏现象——这是该方法的一个显著优势。为了确认BSA存在于所生成的二氧化硅中，进行了傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析。在含BSA条件下制备的样品中，在1,500/cm和1650/cm区域观察到酰胺I和II的特征吸收峰，而对照样品（无BSA）中未出现这些峰（图8），从而证实了BSA存在于固体产物中。
除了上述酶添加方法（在中和反应混合物期间加入BSA）之外，还有其他可能的变体 例如，在硅酸盐溶液与添加剂溶液混合过程中加入BSA，或在中和前将酶加入硅酸盐溶液或添加剂溶液中。部分上述方案被进一步探究，测定了固定化效率（通过Bradford法测定，以固定化的BSA质量占加入反应体系中酶总质量的百分比表示）以及最终二氧化硅产物中BSA的含量（以二氧化硅中BSA浓度占所生成复合物总重量的百分比表示，见 图9）。很明显，当将 BSA 加入未反应的试剂时（A-C 情况下） 图9）在固定化效率或所得复合物中BSA的量方面没有显著差异。然而，当在二氧化硅形成过程中加入BSA时（情况D） 图9），固定化效率以及最终产物中BSA的含量均显著降低。尽管存在这些差异，所生成二氧化硅的平均量仍保持不变（85–90 mg）。这些现象可基于BSA、硅酸盐/二氧化硅及添加剂的电离特性（或等电点）进行解释。不同的添加方式会导致酶与二氧化硅前体之间产生不同的相互作用。随着酶添加时pH的变化，各组分的电离状态将决定分子间相互作用，进而影响固定化效率。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>比色皿编号</td>
			<td>BSA 浓度 (mg/mL)</td>
			<td>Bradford 试剂 (mL)</td>
			<td>样品 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>0（对照）</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>0.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>0.75</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>未知样品 (X)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：大体积Bradford测定法的设置及计算出的组分体积。 适用于0.1-1.4 mg/mL的测定范围（1个重复的体积）
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>比色皿编号</td>
			<td>BSA 浓度 (ug/mL)</td>
			<td>Bradford 试剂 (mL)</td>
			<td>样品 (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>0 (对照)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>7.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>未知样品 (X)</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：微量Bradford测定法的实验设置及计算所得组分体积。 适用于1-10 µg/mL的检测范围（单次重复的体积）
<img alt="显示PEHA和DETA浓度关系的化学平衡分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 使用DETA或PEHA作为添加剂的反应体系中，达到所需滴定体积随二氧化硅浓度的变化。在保持[N]:[Si]比率为1的条件下，使用两种不同的添加剂化学物质合成了不同浓度的二氧化硅。误差线表示均值上下一个标准差。
<img alt="结晶过程、固液分离、实验结果；圆筒中可见沉淀。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2： 反应容器中二氧化硅凝胶在搅拌过程中（a）和搅拌结束后（b）的照片，展示了溶液的浑浊度及沉降现象，表明反应达到最佳状态。 
<img alt="吸光度校准曲线，BSA浓度分析，线性R²=0.99975，分光光度法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：Bradford宏量法典型校准曲线。 在不含BSA的仿生二氧化硅合成上清液中加入已知量的蛋白质，随后按照步骤9.1所述进行Bradford分析。
<img alt="不同反应条件下硅物种的最终聚合状态" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：不同反应条件下硅物种的最终聚合状态。 在最佳（基线）条件以及过滴定或欠滴定条件下合成二氧化硅，随后对单体或二聚体硅酸盐（红色）、多硅酸盐“低聚物”（蓝色）和不稳定的凝聚态二氧化硅（黄色）的相对浓度进行定量分析。
<img alt="酸碱滴定 pH 随时间变化图，显示欠滴定、基线和过滴定结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图 5： 反应体系中 pH 随初始滴定体积变化的进程。 在混合约 38 秒后立即加入酸，导致 pH 迅速下降至 8 以下。随后，系统自动继续添加一定量的酸，使 pH 在初始加酸后 300 秒时维持在 7.0 ± 0.05。在过滴定情况下，该目标无法实现，因为初始剂量已足以使 pH 降至 7 以下，在 300 秒时达到 pH 6.65。‘欠滴定’、‘基线’和‘过滴定’对应的初始 HCl 加入体积分别为 6.90、7.05 和 7.20 mL。
<img alt="PEHA浓度随pH变化及比表面积随pH变化的图表，显示酸碱滴定结果和吸附情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6： 凝聚二氧化硅材料酸化过程中典型性质的变化。 (a) 添加剂浓度随pH的变化，(b) 二氧化硅孔隙率随pH的变化。经Creative Commons许可转载自Manning et al. 13。
<img alt="蛋白质检测图；蛋白质含量与洗涤次数的关系；蛋白质纯化结果分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：生物启发硅合成上清液中的 BSA 浓度。对反应后离心所得的上清液进行 Bradford 测定，以确定其中残留的相对蛋白量（即未被合成的硅包埋的部分）。
<img alt="光谱图，二氧化硅+BSA 吸收光谱，波长与吸光度关系，蛋白质研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 8"> 
图 8： 含与不含活性物质包封的仿生二氧化硅的傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析。光谱显示：黑线：仿生二氧化硅；灰色线：纯 BSA；蓝线：负载 BSA 的仿生二氧化硅。垂直虚线表示特征性的酰胺键吸收峰。
<img alt="比较使用 PEHA 制备的二氧化硅中 BSA 固定化效率和 BSA 含量的柱状图；类别 A-D，误差线表示百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57730/57730fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 9"> 
图 9： 使用 PEHA 制备的二氧化硅复合材料中 BSA 的固定化效率及含量。 BSA 分别在以下阶段加入：(A) 混合硅酸盐前加入 PEHA 溶液中，(B) 混合 PEHA 前加入硅酸盐溶液中，(C) PEHA 与硅酸盐溶液初步混合后，以及 (D) PEHA 与硅酸盐溶液混合并中和后。固定化效率定义为反应混合物中被包埋的 BSA 占所加总 BSA 的百分比，而二氧化硅中的 BSA 含量表示最终二氧化硅复合材料中 BSA 的质量百分比浓度。误差线表示均值上下一个标准差。

本文介绍了一种合成仿生二氧化硅材料并将其用于固定酶的实验方案。二氧化硅通过硅酸钠与一种胺类“添加剂”以可控速率中和反应而合成。材料的性质与功能可通过以下方式加以调控： 原位 酶固定化或封装添加剂的合成后酸洗脱。

本方案旨在合成仿生二氧化硅材料，将酶包封于其中，并实现部分或完全...

该方法的主要优点在于快速、简便、环境友好，并可实现材料的定制化。该方法有助于深入了解仿生二氧化硅的形成机制、生物分子的掺入方式以及合成后的材料处理。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为二氧化硅的形成速度较快，必须迅速加入特定量的酸才能获得最佳结果。当我们意识到该方法的反应条件非常温和，能够与酶相容时，便首次提出了这一方法的构想。我们考虑利用该方法来提升酶的性能和稳定性。对该方法进行可视化演示至关重要，因为酸的中和步骤对最终材料的性能最为关键。首先，将318.2毫克五水硅酸钠称取至一个180毫升的塑料容器中，并溶于20毫升去离子水中。在第二个容器中，称取58.1毫克五乙烯六胺（PEHA），并溶于20毫升去离子水中。从用于溶解五水硅酸钠的去离子水体积中减去这部分水量。为在合成过程中进行原位包封，将预定质量的蛋白质溶解于5毫升去离子水中，并将溶液置于冰箱中以完成完全溶解。应不时检查溶解进程，最好避免搅拌。将五水合硅酸钠与PEHA溶液混合于其中一个容器中，并加入足量去离子水，使最终溶液体积达到41.5毫升。将新鲜配制的混合物置于搅拌器上，并加入搅拌子以确保混合均匀。然后，将 pH 探针悬置于搅拌中的溶液内，记录初始 pH 值。通过加入预定量的 1 摩尔盐酸开始合成反应，观察溶液立即出现的浑浊现象。第一步关键操作是快速加入酸以启动二氧化硅的形成。需要尽快将 pH 降低至 7。如果进行包封，应在加酸完成后立即加入包封剂溶液。五分钟后记录 pH 值，以确定反应是否完成。待反应完全后，通过向混合物中加入更多盐酸来调节所生成二氧化硅的组成，直至达到 2 至 7 之间的目标 pH 值，并让悬浮液稳定约一分钟。随后，将仿生二氧化硅悬浮液倾入 50 毫升离心管中，于 5,000 ×g 离心 15 分钟。离心后，移除上清液并保存以供进一步分析。用去离子水重新填充离心管，并使用涡旋混合器重悬二氧化硅。若涉及生物分子的掺入，关键步骤是收集生物仿生二氧化硅洗涤后的上清液，以便进一步分析。重复离心和重悬步骤两次后，弃去上清液，并将二氧化硅刮入陶瓷坩埚中。在85摄氏度的烘箱中过夜干燥二氧化硅。在5毫升塑料小瓶中，将300微升预先配制的钼蓝试剂与3毫升去离子水混合稀释。然后，加入 10 µL 水杨酸检测试剂，振荡混匀。15 分钟后，加入 1.6 mL 已预先配制好的对氨基酚硫酸还原剂，将黄色的硅钼酸络合物还原为其蓝色异构体。随后，在紫外-可见分光光度计中于 810 nm 处测定样品的吸光度，并根据标准曲线计算硅的浓度。使用一次性移液枪头，向指定的每支比色皿中加入预设量的考马斯亮蓝试剂和样品。通过倒置混匀各比色皿三次，室温静置反应10分钟。随后，以纯净的上清液作为空白对照，于595纳米处测定各溶液的吸光度。通过从每次测量值中减去对照样品的吸光度，计算每个比色皿的原始吸光度。接着，通过绘制测定吸光度与牛血清白蛋白（BSA）浓度的关系曲线，为每组实验建立标准曲线，以消除可能影响检测灵敏度的随机波动。最后，在重悬过程中确定每个样品的蛋白质含量，以监测可能发生的蛋白质损失。硅酸盐形成反应的产率通常为58±6.5%。钼蓝分光光度法可检测未反应的单体硅酸盐物种，以及已反应生成多硅酸盐或寡聚物但尚未达到足够尺寸而发生凝聚的物种。一旦凝聚完成，可通过酸洗脱法对材料表面进行有效修饰，从而精细调控添加剂的组成、孔隙率及化学活性等材料特性。第一次离心后，在上清液中检测到约50%的BSA，表明固定化效率为50%。由于在后续洗涤步骤中未检测到 BSA，因此在合成过程中 BSA 可被稳定包封，无泄漏现象。含 BSA 样品的二氧化硅 FTIR 谱图显示出特征性的酰胺吸收峰，而对照样品中则无此峰。当将 BSA 加入未反应的试剂中时，所得复合材料中 BSA 的固定效率及含量均无显著差异。当在二氧化硅形成过程中加入BSA时，固定化效率以及产物中的BSA含量显著降低。一旦掌握该技术，若操作得当，整个过程可在五分钟内完成。在进行该实验时，需注意准确称量反应物的质量和体积，并迅速一次性加入酸液。采用此方法后，还可进一步通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电镜（SCM）、孔隙率测定以及酶活性检测等方法，对材料的性质、形貌特征以及生物分子的活性进行更深入的研究。该技术一经建立，便为生物仿生二氧化硅形成领域的研究人员提供了一种快速、简便、可控且环境友好的二氧化硅合成方法，同时实现了生物分子的原位包封。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用生物仿生法合成二氧化硅、实现生物分子的原位包封、测定包封效率，以及在合成后对添加物进行洗脱操作。请注意，操作胺类、酸类、生物分子时可能具有极高危险性，进行本实验时必须采取个人防护装备（PPE）和防泄漏等预防措施。

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