Name: 骨髓间充质干细胞片对肝癌体外发育的潜能探讨 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 探索利用细胞片层技术构建裸鼠肝癌模型的方法，通过移植骨髓间充质干细胞与HepG2癌细胞共培养形成的细胞片层，观察肿瘤发育过程。该技术为抗癌药物评估提供了可靠的体内研究平台。

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作者谨向沙特国王大学医学院实验外科与动物实验室的工作人员表示感谢，感谢他们的合作与支持，特别是Hussain Almukhayzim和Hisham Aloudah。作者还感谢沙特国王阿卜杜勒-阿齐兹大学媒体团队在视觉材料准备方面的工作，特别是Muath bin Ghannam和Abdulwahab Alsulami。

本方案遵循沙特国王大学伦理委员会的动物护理指南。在动物身上实施的手术操作、麻醉剂及其他药物使用均经沙特国王大学伦理委员会批准。所有实验工作均由经过适当培训的人员完成。
1. 细胞膜片构建
<ol>
	<li>用未稀释的胎牛血清（FBS）包被培养皿（3.5 cm 温度响应性培养皿），确保完全覆盖培养皿表面。 
	注意：此步骤对细胞片的脱落至关重要，因为它有助于细胞以单层形式生长，并防止细胞聚集。</li>
	<li>将培养皿置于含5% CO2和95%空气的湿润环境中，37 °C孵育24小时。</li>
	<li>从包被后的培养皿中去除多余的FBS，并在室温（RT）下干燥至少1小时。</li>
	<li>制备三种细胞悬液：1 × 106个HepG2细胞、1 × 106个HepG2细胞与BMMSCs的混合细胞、以及1 × 106个HepG2细胞与UCMSCs的混合细胞（BMMSCs和UCMSCs均按4:1的比例混合）。</li>
	<li>将相应的细胞悬液接种至已标记的各个培养皿中。</li>
	<li>将所有细胞悬浮于添加了10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中。</li>
	<li>将细胞置于含5% CO2和95%空气的湿润环境中，37 °C孵育。</li>
</ol>
2. 细胞膜片脱离
<ol>
	<li>当细胞融合度达到100%时，将培养皿从37 °C培养箱中取出。</li>
	<li>将仅含HepG2细胞的细胞膜片培养皿在室温下孵育1小时，同时将HepG2/BMMSC和HepG2/UCMSC共培养细胞膜片培养皿置于含5% CO2和95%空气的湿润环境中，于20 °C孵育30至40分钟。 
	注意：仅由HepG2细胞形成的细胞膜片较为脆弱；将其置于20 °C会导致膜片结构受损。</li>
</ol>
3. 手术操作的实施
注意：在细胞片脱离的孵育期间，开始进行动物实验操作。
<ol>
	<li>手术区域准备指南
	<ol>
		<li>在实验室内的无菌独立区域（如超净台、层流柜或无菌手术室）进行所有外科手术操作。确保手术区域的所有表面均无孔、密封、耐用且可消毒。</li>
		<li>穿戴适当的防护装备，包括刷手服、手套、口罩、头套和鞋套。</li>
		<li>使用清洁且已灭菌的手术器械（通过 高压灭菌（手术开始时对茎段进行高压饱和蒸汽灭菌）</li>
		<li>在大鼠之间更换手套。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术前动物准备
	<ol>
		<li>使用8至12周龄的裸鼠。</li>
		<li>为大鼠制备可注射麻醉剂。
		<ol>
			<li>配制麻醉溶液（氯胺酮-赛拉嗪）时，混合2 mL氯胺酮、1 mL浓度为20 mg/mL的赛拉嗪以及1 mL无菌生理盐水。例如，0.9% 氯化钠）加入无菌的 10 mL 血清收集瓶中，使用前充分振荡混匀。</li>
			<li>按每100克大鼠体重腹腔注射0.2 mL的氯胺酮-赛拉嗪溶液进行麻醉。 
			注意：该溶液的总剂量为每千克体重100 mg的氯胺酮和每千克体重10 mg的赛拉嗪。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>清除手术部位可见的污物/碎屑。</li>
		<li>通过测试足部退缩反射（对两只后足足垫进行夹捏）来检查麻醉深度。 
		注意：如果足垫夹捏引起反应，则以 0.05 mL/100 g 的剂量重复给药（约每 30 分钟一次），然后重新评估麻醉深度。</li>
		<li>使用聚维酮碘/异丙醇进行两步法擦洗，对手术区域进行消毒。</li>
		<li>用无菌手术巾覆盖大鼠，以避免切口污染。</li>
		<li>皮下注射丁丙诺啡（0.01 - 0.05 mg/kg）给大鼠8 在进行切口之前。</li>
		<li>使用无菌手术刀，在皮肤与下方肌肉之间做一个7至10厘米的切口，以暴露肝脏。
		<ol>
			<li>使用手术刀的钝背边缘将腹肌与皮肤分离。</li>
			<li>小心地刺入 白线 使用解剖刀切开，并用锋利的剪刀延长切口。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞膜片移植
注意：细胞片移植在肝脏上进行。
<ol>
	<li>从培养皿中收集细胞片。
	<ol>
		<li>轻轻敲击培养皿底部，使细胞片从培养皿表面脱离。</li>
		<li>使用无菌移液器吸头沿细胞片边缘以半圆形方式刮取，将细胞片与培养皿表面分离。</li>
		<li>轻柔地将培养皿中的全部培养基移除。</li>
		<li>确保细胞片完整无损；若出现破损，则不可使用（图1）。 
		注意：所得的细胞片可直接用肉眼观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备无菌膜（滤纸）以从培养皿中收获细胞片。
	<ol>
		<li>首先用生理盐水浸湿膜，然后用无菌棉垫吸去多余的盐水。</li>
		<li>将湿润的膜覆盖在细胞片上，注意避免膜与细胞片之间产生褶皱或气泡。</li>
		<li>在膜和细胞片上滴加少量生理盐水，以便更易于收集。 
		注意：&#160;为避免细胞片破裂，切勿使用冷盐水，并避免使用镊子用力夹取膜和细胞片。</li>
		<li>静置数秒，确保细胞片已牢固附着于膜上，然后进行收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备肝脏以进行细胞片移植。
	<ol>
		<li>用无菌棉垫轻轻擦拭肝脏表面，确保其干燥。</li>
		<li>使用无菌镊子将带有细胞片的膜覆盖在大鼠肝脏的单个叶上。</li>
		<li>滴加少量无菌生理盐水，并对膜施加轻柔压力，使细胞片从膜上脱离。</li>
		<li>等待5分钟后，小心移除膜。 
		注意：此步骤旨在确保细胞片已牢固附着于肝脏表面。</li>
		<li>最后，使用5-0尼龙缝线缝合肌肉层和皮肤切口。</li>
		<li>用聚维酮碘对术区进行消毒。 
		注意： 图2 展示了在裸鼠肝脏上进行细胞片移植过程的示意图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 术后护理
<ol>
	<li>手术后立即将大鼠单独饲养，以避免发生食仔或窒息，并定期（至少每15分钟一次）监测，直至其恢复意识并能完全自主活动。</li>
	<li>随后每日对大鼠进行评估，持续5至14天，且术后至少评估5天，以确保无并发症发生。在每日评估过程中，需确认以下事项：
	<ol>
		<li>伤口已闭合，缝线完整，且无过度张紧。</li>
		<li>切口部位无感染迹象，如发热、明显肿胀或脓性分泌物。</li>
		<li>无疼痛相关表现，如食物和饮水摄入减少、体重下降、脱水、皮肤回弹延迟或呼吸急促、张口呼吸等。若存在中至重度术后疼痛，可于术后至少48至72小时内，每6至8小时皮下注射一次布托啡诺（buprenorphine，0.01 - 0.05 mg/kg）9以控制疼痛。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 移植区域的分析
<ol>
	<li>移植后一个月，处死大鼠并采集移植区域，用于组织学和免疫组织化学分析。</li>
</ol>

<ol><li>Marra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+and+oxidative+stress+biomarkers+in+hepatocellular+carcinoma%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 171(2011).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Kushida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+culture+temperature+releases+monolayer+endothelial+cell+sheets+together+with+deposited+fibronectin+matrix+from+temperature-responsive+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).</li>
<li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly+%28N-isopropylacrylamide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide).</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), e10088(2010).</li>
<li>Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+1+%28MSC1%29-based+therapy+attenuates+tumor+growth+whereas+MSC2-treatment+promotes+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis.</a> PLoS One. 7 (9), e45590(2012).</li>
<li>Curtin, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+buprenorphine+in+a+postoperative+pain+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats.</a> Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).</li>
<li>Nowland, M. H. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence. , 
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<li>Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+cell+sheet+technique+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+in+rat+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models.</a> PLoS One. 12 (8), e0184004(2017).</li>
<li>Russo, J., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+and+histologic+classification+of+tumors+of+the+rat+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).</li>
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<li>Driscoll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preclinical+new+drug+research+program+of+the+National+Cancer+Institute%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reports%22%5BJournal%5D)">The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute.</a> Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).</li>
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<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+cell+sheet+technique+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of the cell sheet technique in tissue engineering.</a> Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).</li>
<li>Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+transplantation+for+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell sheet transplantation for heart tissue repair.</a> Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).</li>
<li>Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+development+of+bioengineered+human+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+using+cell+sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology.</a> International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?</a> Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

大量研究致力于开发一种能够模拟人类癌症的充分的体内临床前动物模型。目前，构建癌症动物模型的主要方法包括基因工程和细胞移植11。转基因动物模型是鉴定和验证靶基因以及理解药物诱导毒性的分子机制的良好工具。然而，该模型也存在一些局限性；例如，对特定基因的修饰并不总是产生预期的表型12。细胞移植方法更常用于在动物体内诱导癌症，该方法涉及注射癌细胞悬液。然而，这种简单便捷的方法也有其自身的缺点。为了制备细胞悬液，需通过酶消化步骤收获癌细胞，这会导致部分黏附蛋白的丢失，从而降低移植细胞的植入效率。因此，无法保证移植的癌细胞能够形成癌组织，更不用说控制所诱导肿瘤的大小。此外，该方法还存在另一个严重缺陷，即移植的癌细胞可能迅速进入血液循环，或在非靶器官中发生细胞植入13。
新型细胞膜片技术的开发旨在克服这些缺点。Suzuki 等14 已成功利用癌细胞片移植方法构建了结肠、肝...

肝细胞癌（HCC）是一种原发性肝癌，与预后不良显著相关。每年全球约有50万新诊断的HCC患者，占全球肝癌患者总数的85%1.&#160;肝癌的发生并非单一疾病形式，而是一组具有不同组织病理学特征、遗传和基因组异质性以及不同预后结局的疾病集合。1因此，肝细胞癌（HCC）有效治疗策略开发面临的主要挑战在于对HCC生物学特性的了解仍然有限，以及&#160;缺乏合适的实验动物模型来帮助理解这种复杂的疾病。 体内 用于模拟人类癌症的动物模型对于筛选候选基因、鉴定与癌症发生相关的预后/预测标志物，以及研究可能影响癌症对治疗药物反应的各种因素至关重要。
体外 癌症研究仍存在诸多主要局限性，这主要是因为癌细胞会失去其许多原有特性 体内 在培养过程中维持的特征。细胞发生的变化 体外 由于缺乏完整组织的生理环境而产生的结果 离体 微环境中的癌细胞间相互作用（基质细胞、免疫细胞、血管、上皮细胞） 等等。肿瘤微环境中的特征在很大程度上反映了癌细胞的特性2肿瘤微环境可能改变癌细胞的基因/蛋白表达和表型特征，以及血管生成能力和转移潜能。二维（2-D） 体外 培养系统还缺乏一种合适的组织基质，而这种基质对于调控肿瘤进展是必需的。因此，由于这些局限性， 在体 模型应始终用于支持初步研究结果 体外 模型。在本研究中，我们采用细胞片技术来开发一种 体内 阐明肝细胞癌（HCC）完整生物学过程的动物模型
十多年前，冈野实验室建立了一种基于细胞片技术的新型组织工程方法3。该技术利用一种温度响应性培养塑料，通过调控表面疏水性实现细胞黏附/脱附的可逆过程。这种方法能够以完整三维（3-D）结构（即细胞片）温和地收获培养细胞，同时较好地保留细胞外基质（ECM）以及细胞间相互作用。细胞片技术需要预先在培养皿表面包被一种温度响应性聚合物聚异丙基丙烯酰胺（PIPA Am），该聚合物已有商品化产品并可直接使用。当温度低于20 °C时，PIPA Am聚合物会吸水并溶解于水溶液中；而在较高温度（37 °C）下，聚合物则脱水并转变为浑浊的沉淀物。该聚合物含有亲水性酰胺链和疏水性侧链（异丙基）。在高温条件下，水分子的布朗运动增强；而在低温条件下，围绕水合结构中异丙基的水分子结构被破坏，导致疏水性异丙基因疏水相互作用而聚集。因此，整个聚合物链发生聚集并沉淀4。
在本研究中，该技术被用于利用三种不同的细胞片层构建肝细胞癌（HCC）动物模型。第一种细胞片层仅由HCC细胞系细胞组成，而另外两种细胞片层则由HCC细胞系细胞与两种不同来源的间充质干细胞（MSCs）共同构成：骨髓来源的间充质干细胞（BMMSCs）和脐带来源的间充质干细胞（UCMSCs）。MSCs是一类非造血性基质细胞，具有分化为中胚层谱系细胞后代的能力，包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞。5使用这些细胞来制备癌细胞片层的原因在于，间充质干细胞（MSCs）对癌症作用的研究报道存在不一致性。有研究表明，MSCs可能具有两种不同的表型： &#34;MSC1&#34;一种促炎表型，以及 &#34;MSC2&#34;，一种免疫抑制表型6间充质干细胞（MSCs）表达Toll样受体（TLRs）。TLR4激活可增强MSCs分泌促炎因子，而TLR3激活则可增强其分泌免疫抑制因子。6。一个 体外 有研究报道，MSC1与癌细胞系共培养可抑制癌细胞生长，而MSC2共培养则产生相反效应。7这意味着间充质干细胞（MSCs）可能具有促癌或抑癌作用，具体取决于其表型。因此，除了利用细胞膜片技术建立肝细胞癌（HCC）动物模型外，我们还希望探讨MSC移植对肿瘤发展的影响，以及使用这些细胞会促进还是抑制该模型的肿瘤形成。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5671-500ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S0817-1GA</td><td></td></tr><tr><td>人HepG2细胞系</td><td>ATCC，美国</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>人类骨髓间充质干细胞系</td><td>美国 PromoCell</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>人脐带组织间充质干细胞</td><td>PromoCell，美国&amp;nbsp;</td><td>C-12971</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮 50%</td><td>Rompun，拜耳</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% 赛拉嗪</td><td>Rompun</td><td>23076-35-9</td><td></td></tr><tr><td>Alphadine&amp;reg;&amp;nbsp;溶液</td><td>利雅得制药</td><td>LBL0816</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;一次性用品：&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯高透明度离心管</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 无菌 UpCell 培养皿（含滤纸膜）</td><td>Sigma</td><td>174904-1CS</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &amp;micro;l &amp;nbsp;移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CLS4868-1000EA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>基本操作铺巾</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PMD5293.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加样枪，可调体积</td><td>Eppendorf&amp;reg;&amp;nbsp;研究&amp;reg;</td><td>Z683779-1EA</td><td></td></tr><tr><td>组织培养箱 37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养箱 20 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌外科手术器械与裸鼠：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;尼龙缝合线&amp;nbsp; 5-0</td><td>Accutome</td><td>AB-3854S</td><td>单丝纤维，采血针</td></tr><tr><td>1 ml 结核菌素注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-88</td><td></td></tr><tr><td>裸鼠&amp;nbsp;</td><td>查尔斯河</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

探讨间充质干细胞片对肝细胞癌发展的影响潜力 体内

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

一种模拟人类癌症的体内动物模型可能具有多种应用，能够提供重要的临床信息。目前用于构建体内癌症模型的技术存在诸多局限性。因此，本研究旨在应用细胞片技术来建立一种体内癌症模型。利用源自肝细胞癌（HCC）细胞系的细胞片，成功在裸鼠体内诱导出肝细胞癌。癌细胞片通过细胞间黏附及由细胞外基质调控的分层结构形成而产生。这使得HCC细胞片可被移植至肝脏，并在一个月内建立荷瘤动物模型。此外，本研究还探讨了间充质干细胞（MSC）在该癌症模型构建中的作用。除HCC细胞系细胞片外，还制备了另外两种细胞片：HCC细胞与骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的复合细胞片，以及HCC细胞与脐带间充质干细胞（UCMSCs）的复合细胞片。含有HCC细胞与MSC的复合细胞片同样能够形成荷瘤动物模型。然而，加入MSC会减小所形成肿瘤的体积，且这种对肿瘤发育的抑制效应因MSC来源不同而有所差异。这表明，由特定MSC亚型构成的细胞片可能在肿瘤的管理和控制中具有应用潜力。

细胞膜片移植在大鼠中的致瘤性：
移植后一个月，大鼠肝脏中所有移植的细胞片均形成了肿瘤（图3）。HepG2、HepG2/BMMSC 和 HepG2/UCMSC 细胞片所形成肿瘤的平均大小分别为 4.5 cm、4 cm 和 2.5 cm10。
肝脏组织的组织学分析：
未移植大鼠的苏木精-伊红（H&amp;E）染色显示，肝细胞呈板状排列，相互吻合，细胞核呈圆形，含一个或两个明显的核仁。相比之下，所采集的肿瘤组织切片显示，存活的皮下肝细胞边缘伴有炎...

在此，我们介绍一种建立 体内 利用细胞膜片技术构建的癌症模型。该模型可用于评估抗癌治疗药物。

一种模拟人类癌症的体内动物模型可能具有多种应用，可提供重要的临床信息。目前常用的……

您好，我是来自阿卜杜拉国王国际医学研究中心干细胞与再生医学科的Dr. Alaa Alshareeda。今天我们将通过细胞膜片技术，演示间充质干细胞对大鼠模型中肝细胞癌发展的影响。您好，我是Abdullah Almubarak。我正在沙特国王大学的实验外科与动物实验室工作。我们使用裸鼠以避免细胞片移植后发生任何排斥反应。此图展示了在裸鼠上进行细胞片移植的步骤。本研究将使用 8 至 12 周龄的裸鼠。首先，对裸鼠进行切口处理，使用手术刀在皮肤与下方肌肉之间做一个 7 至 10 厘米的切口，以暴露肝脏。为转移细胞膜片，使用无菌膜。将膜置于细胞层上以收集细胞层。然后，将带有膜的细胞层放置于肝脏的一个叶上。细胞层构建。在接种细胞前，使用未稀释的胎牛血清（FBS）包被3.5厘米温敏性UpCell培养皿。用FBS包被培养皿有助于细胞在膜层中的生长，并防止细胞降解。确保完全覆盖培养皿的所有表面。将培养皿置于含5%二氧化碳和95%空气的湿润环境中，37摄氏度孵育24小时。次日，去除多余的胎牛血清（FBS），并将培养皿在室温下干燥至少一小时。将至少一百万个HepG2癌细胞单独或与间充质干细胞共培养接种至DMEM培养基中。培养基中添加10% FBS和1%青霉素-链霉素。本研究中癌细胞与间充质干细胞的比例为4:1。加入细胞后，轻轻摇动培养皿。将细胞置于含5%二氧化碳和95%空气的湿润环境中，37摄氏度培养。细胞片的脱离：当细胞融合度达到100%时，将培养皿从37摄氏度的培养箱中取出。现在，将HepG2癌细胞片在室温下孵育1小时，同时将HepG2与间充质干细胞共培养物置于含5%二氧化碳和95%空气的湿润环境中，在20摄氏度下孵育30至40分钟。在细胞片脱离孵育期间，开始动物实验操作。所有动物研究均经沙特国王大学伦理委员会批准。进行手术操作。通过测试足底回缩反射来检查麻醉深度。使用碘伏对手术区域进行消毒。现在，用碘再次进行第二次擦洗。用无菌手术巾覆盖动物体表，以避免切口污染。使用无菌手术刀在皮肤与下方肌肉之间做一个长约7至10厘米的切口，以暴露肝脏。用手术刀的钝背边缘将腹肌与皮肤分离。使用手术刀小心刺入白线，并用锐利的剪刀延长切口。将细胞片移植到大鼠肝脏上。轻轻敲击培养皿底部，使细胞片从表面脱落。通过半圆形刮擦细胞片边缘，将细胞片与培养皿表面分离。然后，轻柔地将所有培养基从培养皿中移除。确保膜片完整无损，否则无法使用。准备无菌膜以收获和转移细胞膜片。首先，用生理盐水浸润膜片，然后用无菌棉签去除多余的盐水。将湿润的膜置于细胞层上方，注意避免膜与细胞层之间产生气泡。在膜和细胞层上滴加少量生理盐水，以收集材料。静置数秒，确保细胞层已牢固附着于膜上，然后进行收集。现在，准备进行肝脏移植。确保肝脏表面干燥。将带有细胞片的膜覆盖在大鼠肝脏的单个叶上。加入几滴无菌生理盐水，使细胞层从膜上脱落。等待五分钟，然后小心地移除膜。在此视频中，可见细胞层已附着在肝脏上。最后，用五针尼龙缝线缝合深层肌肉和皮肤切口。缝合切口后，用碘伏对术区进行消毒。从停止麻醉到动物抬头的时间因个体而异，通常在5至20分钟之间。结果。该图显示了移植 HepG2 细胞片一个月后大鼠肝脏上形成的肿瘤。此处的肿瘤是由 HepG2 癌细胞与骨髓间充质干细胞构建的细胞片移植后形成的。而该图显示的是由 HepG2 癌细胞与脐带间充质干细胞构建的细胞片移植后，大鼠肝脏上形成的最小肿瘤。该图显示了细胞片移植一个月后大鼠肝脏的 H 和 E 染色结果。其中 A 代表正常大鼠肝细胞，B 显示癌变大鼠肝细胞。结论：通过观看本视频，您应能够利用细胞膜片技术在裸鼠上建立肝细胞癌模型。感谢观看。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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探索利用细胞片层技术构建裸鼠肝癌模型的方法，通过移植骨髓间充质干细胞与HepG2癌细胞共培养形成的细胞片层，观察肿瘤发育过程。该技术为抗癌药物评估提供了可靠的体内研究平台。

探讨间充质干细胞片对肝细胞癌发展的影响潜力体内

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