斑马鱼胰岛单细胞分辨率钙成像对β细胞功能的分析

这种方法可以帮助理解 β 细胞领域中的重要问题。例如胰岛内单个 β 细胞之间的功能异质 IT。该技术的主要优点是 β 细胞实时成像提供的空间和时间分辨率。

我们可以捕获单个 β 细胞内的钙振荡。根据文本方案对鱼实施安乐死后，将其转移到含有钙和镁的 HBSS 溶液的 Petrie 培养皿中。然后在配备有荧光灯和红色滤光片立方体的立体显微镜下，使用锋利的镊子切开从嘴到臀鳍的皮肤。

剥去右侧切开的皮肤，露出腹部，露出内脏。然后使用红色荧光鉴定 β 细胞中的 mKO2 表达，定位胰岛。通过小心去除周围组织（如肝脏和脂肪细胞）来清洁原代胰岛。

采取预防措施，不要伤害或戳到胰岛。接下来，将 30 微升 HBSS 滴到玻璃底培养皿的中心。然后将解剖的胰岛转移到液滴中。

使用 HBSS，小心地洗涤胰岛一次，然后使用 30 微升纤维蛋白原工作溶液洗涤一次。避免在洗涤步骤中干燥胰岛，否则可能导致细胞死亡。缓慢而轻柔地向胰岛中加入 10 微升每毫升 10 单位的凝血酶溶液。

将胰岛和培养皿保持原样 15 到 20 分钟。观察纤维蛋白原凝血酶滴剂会变得粘稠且稳定。需要给予足够的时间让凝血酶在纤维蛋白原溶液中聚合。

否则，模具在成像过程中将无法提供稳定性。为了进行 GCaMP 荧光的离体实时成像，在模具顶部添加 200 微升 HBSS，并小心地将培养皿放在共聚焦显微镜的板架上。然后使用 20X 0.8 NA 误差物镜和明场选项，找到胰岛。

使用红色荧光滤光片观察 β 细胞中的核 mKO2 荧光，聚焦于胰岛。单个细胞核应清晰可见。通过沿胰岛的 Z 轴手动移动穿过胰岛的厚度，找到一个清晰的成像平面。

确保成像平面包含 50 至 100 个 β 细胞用于成像，并且核 mKO2 荧光的亮度均匀，尤其是在胰岛中心。接下来，在智能设置菜单中，使用以下设置为GCaMP6和mKO2荧光设置顺序采集。对于 GCaMP6，请选择 488 纳米的激发波长和 500 至 555 纳米的近似发射波长。

在 false color （伪彩色） 下，选择 GFP （GFP）。对于 mKO2，请选择 561 纳米的激发波长和 570 至 630 纳米的发射波长。对于 false 颜色，请选择 mCherry。

在采集模式下，将图像分辨率设置为 1， 024 x 1， 024 像素，将速度设置为 10，并将平均设置为 1。通过选择 Time Series （时间序列） 选项并将持续时间设置为 500 个周期，每帧的采集时间约为 2 秒，从而启动连续记录。密切关注成像周期。

在前 50 帧后，在不干扰图像采集的情况下，在固定胰岛的凝胶顶部轻轻吸取 5 微升 200 毫摩尔 D-葡萄糖溶液。然后以 10 毫摩尔葡萄糖采集 150 帧。时间序列的前 50 帧对应于 5 毫摩尔葡萄糖的 β 细胞活性。

这是基础活动。响应的 β 细胞将随着时间的推移显示绿色荧光的起伏。在 200 帧时，通过轻轻添加 10 微升 200 毫摩尔 D-葡萄糖，将葡萄糖浓度增加到 20 毫摩尔。

然后以 20 毫摩尔浓度采集 150 帧。要在 FIJI 中打开映像文件，请选择 Plugin（插件）、LSM Toolbox（LSM 工具箱）、Show LSM Toolbox（显示 LSM 工具箱）。在 LSM 工具箱中，单击 Open LSM 并选择映像文件。

在 Analyze 菜单的 Tools 下，打开 ROI Manager。使用工具栏中的多边形选择工具，手动绘制 ROI。在红色通道中绘制 ROI，使其覆盖比细胞核更大的区域，以包括一些细胞的细胞质。

确保帧之间的 ROI 位置一致，并根据需要调整位置。通过单击 Add 按钮，将选定的 ROI 添加到 ROI Manager。选择并添加多个 ROI 以获取多个单元格的数据。

接下来，从 Analyze（分析）菜单中选择 Set Measurements（设置测量）。然后选择 积分密度 以指定区域内总荧光强度的提取。切换到包含 GCaMP 荧光的绿色通道，然后在 ROI 管理器中选择 Multi Measure。

这将提供整个时间序列中像元的强度测量值。将 FIJI 输出另存为逗号分隔的文本文件。从 LSM Toolbox 中，获取图像帧的时间戳。

使用 Apply Stamps（应用图章）、Apply t-stamps（应用 t 图章）、File Name（文件名）、Dump to textfile（转储到文本文件）来获取时间戳。使用 Save as 选项保存时间戳，或将其复制到电子表格中。编译所有单元格的强度值后，一次执行一个单元格的分析或自动执行分析。

有关其他详细信息，请参阅文本协议。在该实验中，来自 45 个在 β 细胞中特异性表达核 mKO2 和 GCaMP6 的 DPF 转基因品系的单个原代胰岛 β 细胞，用葡萄糖斜坡刺激，然后用氯化钾去极化。分析细胞的活性。

使用 FIJI 和数据分析软件，提取单个 β 细胞的 GCaMP6 荧光强度并归一化。从这种荧光强度的痕迹中可以看出，当用葡萄糖刺激时，单个 β 细胞在 GCaMP6 荧光中表现出振荡，并且氯化钾的添加使荧光稳定。该技术提供了 β 细胞葡萄糖反应性的细胞分辨率和了解其功能的窗口。

一旦掌握，如果作正确，这项技术可以在 45 分钟内完成。在执行此过程时，验证 β 细胞的活力很重要。按照这个程序，可以执行其他方法，如基因作，以了解特定基因对 β 细胞功能的作用。

观看此视频后，您应该对如何测量单个 β 细胞内的葡萄糖反应有很好的了解。