Name: 斑马鱼胰岛单细胞分辨率钙成像对β细胞功能的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 了解斑马鱼胰岛β细胞单细胞分辨率钙成像技术，利用GCaMP6s传感器实时监测葡萄糖刺激下的钙内流动态。该方法可揭示β细胞功能异质性，为糖尿病研究提供高时空分辨率的活体成像平台。

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感谢Ninov实验室成员对本文稿的评论，感谢德累斯顿再生治疗中心（CRTD）鱼类和显微镜设施成员提供的技术支持。N.N. 的研究得到德国研究基金会-德累斯顿工业大学卓越集群（DFG-CRTD）、德国研究基金会（DFG）以及德国糖尿病研究中心（DZD）的资助。

所有涉及动物受试者的操作均已获得《动物福利法》的批准，并已取得德国萨克森州地区管理局（Landesdirektion Sachsen, Germany）的许可（批准号：AZ 24–9168.11-1/2013-14, T12/2016）。
1. 准备
注意：本方案适用于 离体 双转基因斑马鱼 Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)19 的原发性胰岛成像。在该转基因品系中，胰岛素启动子（ins）驱动β细胞特异性表达两种转基因：nls-Renilla-mKO2，其通过单体Kusabira橙色2（mKO2）荧光标记β细胞的细胞核；以及 GCaMP6s15，其在细胞内钙离子水平升高时发出绿色荧光。GCaMP6s 在β细胞中的特异性表达使得能够在不受周围其他细胞类型钙信号干扰的情况下研究β细胞对葡萄糖的响应性。
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中，将10 mg牛纤维蛋白原溶解于1 mL含Ca2+/Mg2+的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，配制新鲜的纤维蛋白原储备液（10 mg/mL）。剧烈涡旋振荡，直至纤维蛋白原粉末完全溶解。室温下静置至少15分钟。 
	注意：储备液可在室温下保存2–3小时。若溶液开始发生聚合并变得黏稠，则应弃用。</li>
	<li>用HBSS将纤维蛋白原储备液稀释三倍，配制纤维蛋白原工作液（3.3 mg/mL）。例如，将300 µL纤维蛋白原储备液与600 µL HBSS混合，得到900 µL纤维蛋白原工作液。</li>
	<li>将10单位凝血酶溶解于1 mL HBSS或磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制凝血酶溶液（10 U/mL）。 
	注意：该溶液可预先配制，分装为50 µL每份，于-20 °C冷冻保存。</li>
	<li>将1.8 g D-葡萄糖溶解于50 mL水中，配制200 mM D-葡萄糖溶液。长期保存时置于4 °C冰箱中。</li>
	<li>将1.1 g KCl溶解于50 mL水中，配制300 mM KCl溶液。长期保存时置于4 °C冰箱中。</li>
	<li>准备直径为35 mm的玻璃底培养皿，用于胰岛的固定。</li>
	<li>进行胰岛解剖和固定时，使用配备荧光灯和红色滤光片立方体的体视显微镜（TRITC：激发光：532–554 nm，发射光：570–613 nm；或Texas-Red：激发光：540–580 nm，发射光：592–667 nm）。</li>
	<li>为成像β细胞中的钙离子内流，使用倒置共聚焦显微镜（Zeiss LSM 780或类似型号），配备20倍（0.8 NA）空气物镜，并配有适用于直径35 mm玻璃底培养皿的载物台夹具。</li>
	<li>配制200 mg/L的三卡因甲磺酸盐（MS222）溶液，用于处死斑马鱼。</li>
	<li>准备直径为90 mm的培养皿，用于斑马鱼解剖。</li>
</ol>
2. 斑马鱼原代胰岛分离与制备
<ol>
	<li>使用MS222长期孵育法处死一条鱼。具体操作为：用渔网轻轻将鱼从鱼缸中取出，放入含有MS222溶液的培养皿中孵育，直至动物不再出现鳃盖（鳃）运动；通常需要5分钟。随后将鱼转移至含有含Ca2+/Mg2+的HBSS溶液的培养皿中。</li>
	<li>在配备荧光灯和红色滤光片的体视显微镜下，解剖动物腹部右侧的皮肤以分离胰腺。
	<ol>
		<li>操作时，使用锋利的镊子从斑马鱼口部开始沿至肛门鳍剪开皮肤。剥离切开的皮肤以暴露腹腔；此步骤可使内部器官显露。通过观察β细胞中mKO2表达产生的红色荧光，在显微镜下目视确定胰岛的位置。如有需要，可移除可能覆盖胰岛的肝叶，以便于定位。 
		注意：主胰岛位于腹部前部区域，通常在右侧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心去除胰岛周围组织（如肝脏和脂肪细胞）以清洁主胰岛。操作时需避免损伤或刺破胰岛；清除周围组织后，胰岛表面的单个细胞将变得可辨识。</li>
	<li>用移液器将30 µL HBSS液滴滴加至玻璃底培养皿中央。将解剖得到的胰岛转移至该液滴中。</li>
	<li>依次用HBSS和30 µL纤维蛋白原工作溶液（3.3 mg/mL）各清洗胰岛一次。清洗过程中务必避免胰岛干燥，否则会导致细胞死亡。</li>
	<li>缓慢而轻柔地加入10 µL凝血酶溶液（10 U/mL）。将胰岛和培养皿静置15–20分钟，期间勿扰动。此时可观察到纤维蛋白原与凝血酶混合液逐渐变得黏稠且略显浑浊。</li>
</ol>
3. 离体 斑马鱼初级胰岛中GCaMP荧光强度的活体成像
<ol>
	<li>在模具上方加入 200 µL HBSS，小心将培养皿放置在共聚焦显微镜的载物台支架上。使用 20X、0.8 NA 的空气物镜进行共聚焦成像。利用明场模式定位胰岛。</li>
	<li>使用红色荧光滤光片观察 β 细胞中核定位的 mKO2 荧光，对焦至胰岛。单个细胞核应清晰可见。</li>
	<li>通过手动调节共聚焦显微镜的焦平面，沿 z 轴方向穿过胰岛厚度，找到一个清晰的成像平面。确保该成像平面包含足够数量（50–100 个）的 β 细胞用于成像，且核内 mKO2 荧光强度均匀，尤其是在胰岛中心区域。</li>
	<li>在 &#34;Smart Setup Menu&#34; 中设置 GCaMP6s 和 mKO2 荧光的顺序采集，参数如下：GCaMP6s，激发波长：488 nm，发射波长：500–555 nm，伪彩色：绿色（选择 &#34;GFP&#34;）；mKO2，激发波长：561 nm（mCherry），发射波长：570–630 nm，伪彩色：红色（选择 &#34;mCherry&#34;）。 
	注意：在此设置下，红色通道将记录 β 细胞核的位置，绿色通道将记录 GCaMP 的荧光强度。</li>
	<li>在 &#34;Acquisition Mode&#34; 中，将图像分辨率设为 1,024 × 1,024 像素，扫描速度设为 10，平均次数为 1。选择 &#34;Time-series&#34; 模式进行连续记录，并设置 &#34;Duration&#34; 为 500 个循环，每帧采集时间约为 2 秒。 
	注意：时间序列的前 50 帧对应 β 细胞在 5 mM 葡萄糖浓度下的活动，此为基线反应。有响应的 β 细胞会随时间表现出绿色荧光强度的周期性波动。我们观察到少数（1–5%）β 细胞在 5 mM 葡萄糖下即出现振荡。</li>
	<li>密切关注成像周期。在前 50 帧采集完成后，在不停止记录的情况下，将周围溶液的葡萄糖浓度提高至 10 mM。
	<ol>
		<li>在不干扰图像采集的前提下，轻轻在承载胰岛的凝胶上方加入 5 µL 200 mM D-葡萄糖溶液。在 10 mM 葡萄糖条件下继续采集 150 帧。 
		注意：葡萄糖浓度升高将导致绿色通道中发生 GCaMP 荧光振荡的 β 细胞数量增加。</li>
		<li>确保细胞核在整个过程中保持稳定。若在采集期间胰岛剧烈晃动，导致细胞核移出焦平面，则应弃用该样本（如有必要）。</li>
		<li>等待足够时间，以确保纤维蛋白原-凝血酶模具充分聚合，从而保障后续样本的稳定性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第 200 帧时，通过轻轻加入 10 µL 200 mM D-葡萄糖溶液，进一步将溶液浓度提升至 20 mM。在 20 mM 浓度下采集 150 帧。</li>
	<li>在第 350 帧后，使用 30 mM KCl 对胰岛进行去极化处理。具体操作为加入 20 µL 300 mM KCl 储备液。此时应观察到 GCaMP6s 荧光振荡停止，并稳定在高强度水平；那些对葡萄糖无反应的 β 细胞在加入 KCl 后也可能表现出绿色荧光强度的上升。</li>
</ol>
4. 单个β细胞GCaMP荧光信号的定量分析
注意：为了追踪并量化单个β细胞对不同葡萄糖浓度的反应，需对整个成像期间的GCaMP荧光强度进行量化。量化需在细胞分辨率下进行。为此，使用FIJI20从图像中提取GCaMP荧光的强度值（步骤4.1–4.6），并使用电子表格软件或R21进行数据分析（步骤4.8–4.9）。
<ol>
	<li>使用 FIJI 打开图像文件 &#34;LSM 工具箱&#34;为此，选择 &#34;插件 | LSM 工具箱 | 显示 LSM 工具箱&#34;. 在 &#34;LSM 工具箱&#34;，点击 &#34;开放LSM&#34; 并选择图像文件。 
	注意：对于 JoVE 不支持的格式 &#34;LSM 工具箱&#34;，先将其转换为 TIFF 格式再进行分析。</li>
	<li>使用 FIJI 中的感兴趣区域（ROI）工具提取细胞的响应。打开 &#34;ROI 管理器&#34; 在 &#34;分析&#34; 菜单下方 &#34;工具&#34;手动绘制 ROI &#34;多边形选择工具&#34; 位于工具栏中。</li>
	<li>在红色通道中绘制 ROI，使其中可见 β 细胞核。选择 ROI 时，应使其覆盖的区域大于细胞核，以包含部分细胞的细胞质。确保 ROI 在各帧之间位置一致，必要时进行位置调整。</li>
	<li>将选定的 ROI 添加到 &#34;ROI 管理器&#34; 通过点击 &#34;添加 [t]&#34; 按钮。选择并添加多个感兴趣区域（ROI），以获取多个细胞的数据。</li>
	<li>接下来，从 &#34;分析&#34; 菜单，选择 &#34;设置测量参数&#34;选择 &#34;积分密度&#34; 用于指定区域内总荧光强度的提取。</li>
	<li>切换至包含GCaMP荧光的绿色通道并选择 &#34;多参数检测&#34; 在 &#34;ROI 管理器&#34;. 
	注意：这将提供整个时间序列中细胞的强度测量值。</li>
	<li>如果ROI位置因胰岛移动而需要调整，需手动整理不同帧中的强度测量值，并将数值复制粘贴至另一个电子表格中。</li>
	<li>从图像帧中获取时间戳 &#34;LSM 工具箱&#34;使用 &#34;应用印章 | 应用 t 印章 | 文件名 | 导出到文本文件&#34; 以获取时间戳。使用以下方法保存时间戳 &#34;保存为&#34; 选项，或将其复制到电子表格中。</li>
	<li>在收集所有细胞的强度值后，可逐个细胞进行分析，或自动完成分析例如，使用 Excel 公式或 R）。</li>
	<li>分两个步骤分析单个细胞。
	<ol>
		<li>第一步，计算高于基线的荧光强度。为此，计算基线荧光强度（F0) 作为前50帧荧光强度的平均值（5 mM葡萄糖）。然后减去基线（F0）从整个时间序列（F – F0). 
		注意：一些细胞在基础葡萄糖浓度下即可表现出明显的GCaMP振荡，这种振荡通常在给予较高浓度葡萄糖刺激后仍持续存在。对于此类细胞，仅能估算F0 通过取细胞荧光强度开始下降时最初几帧的平均强度来确定。</li>
		<li>在分析的第二步，通过归一化荧光强度获得最终的 GCaMP 荧光强度。 
		注意：此步骤旨在消除不同动物来源的胰岛之间的差异。单个胰岛在葡萄糖刺激下表现出不同程度的荧光发射。</li>
		<li>通过将荧光强度除以最高强度值来归一化荧光强度。为此，计算峰值强度（F最大 – F0)，并将基线校正后的数值除以峰值强度，以得到最终的 GCaMP 荧光强度（F – F0)/(F最大 – F0).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弃去在KCl刺激后未表现出强度变化的细胞，因为这些细胞可能不健康或已受损。</li>
	<li>使用随本文提供的 R 脚本（plotcelltrace.R）在 R 中执行分析（步骤 4.9–4.10）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文展示了一种在单细胞分辨率下定量分析β细胞葡萄糖响应能力的技术。该技术通过使用基因编码的钙离子指示剂GCaMP6s监测细胞内钙离子浓度来实现。通过将胰岛置于纤维蛋白原-凝血酶凝胶模具中，可在ex vivo条件下记录β细胞的活性。该实验方案的关键步骤在于模具的稳定性。必须给予足够时间使纤维蛋白原完全溶解于HBSS溶液中；否则，模具无法充分聚合，难以在成像过程中提供足够的稳定性。将胰岛固定于纤维蛋白原-凝血酶凝胶模具中并浸没于细胞培养基后，其活性可维持至少一周（数据未显示）。除纤维蛋白原-凝血酶凝胶模具外，也可使用低熔点琼脂糖等替代方法固定胰岛22。另一个关键参数是胰岛的解剖分离。在此步骤中，必须在不损伤或刺破胰岛的前提下，彻底去除其周围的组织。熟练的解剖操作需要通过实践逐步掌握。
成像方案的一个局限性在于仅限于胰岛的一个共聚焦平面。这是为了捕捉单个β细胞内钙离子流入的动力学过程。若对胰岛全厚度进行Z轴层扫，会导致成像速度降低，并丢失单个细胞的振荡信号。该局限性可通过采用更快的共聚焦成像技术（如转盘显微镜）加以改进，从而实现三维空间中钙动力学的捕捉。另一个前沿方向将是 在体 钙成像12斑马鱼胚胎的透明特性或使用无色素斑马鱼成体品系23 可能为……开辟新的可能性 体内 未来的成像技术
以高空间和时间分辨率成像β细胞活性，能够研究单个β细胞之间的功能异质性。该方法有助于揭示β细胞亚群的存在。近年来，多项研究已表明，在名义上均一的β细胞中存在亚群24,25,26。ex vivo成像可与遗传报告系统结合，用于表征亚群对葡萄糖的响应。此外，将成像系统与药理学刺激相结合，可实现对能够改善β细胞功能的化合物进行筛选。
总之，本文介绍的技术可实现对单个β细胞葡萄糖反应性的定量与比较。该技术为β细胞功能提供了直接的观察窗口，而β细胞功能是糖尿病发病过程中一个重要的参数。

我们的血糖水平能够维持在一个较窄的范围内，很大程度上归功于胰腺的内分泌功能。胰腺的内分泌功能由朗格汉斯岛（islets of Langerhans）执行，其中包含多种激素分泌细胞。分泌胰岛素的β细胞负责在摄入含碳水化合物的食物后降低血糖水平。β细胞胰岛素分泌不足可能导致糖尿病

关键词：血糖, 胰腺, 内分泌功能, 朗格汉斯岛, 激素分泌细胞, 胰岛素, β细胞, 碳水化合物, 血糖水平, 胰岛素分泌, 糖尿病1，其特征是持续性高血糖。1型和2型糖尿病目前在全球影响超过4亿人，可导致发病和死亡2通过研究导致β细胞功能障碍的分子和环境因素，我们将更深入地了解2型糖尿病的起始与进展机制。此外，将人类干细胞分化为功能性β细胞的能力 体外 可为1型糖尿病的细胞替代疗法提供新的β细胞来源。为此，研究遗传模型生物中β细胞的功能与成熟过程至关重要，以获得在体外培养出功能性β细胞所必需的知识。
可通过定量葡萄糖刺激下胰岛整体分泌的胰岛素总量，在整个胰岛水平上监测β细胞功能。这种累积性方法将胰岛作为一个整体细胞群进行研究，而不区分单个细胞的个体特性。然而，对单个β细胞葡萄糖反应的分析揭示了β细胞功能特性的多样性以及功能异质性的存在3。为了评估单个β细胞的功能，可以监测导致胰岛素分泌的细胞内变化4。胰岛素分泌之前，葡萄糖进入β细胞。进入β细胞的葡萄糖迅速代谢生成ATP。细胞内ATP浓度升高会降低ATP敏感性钾离子通道的开放概率，从而导致β细胞去极化。去极化打开电压敏感性钙离子通道，使细胞内钙离子浓度升高。随后，钙离子触发胰岛素的胞吐作用，胰岛素被释放入血液循环，通过促进葡萄糖利用来降低血糖水平5,6,7。
已有多种策略被用于研究β细胞的功能，包括监测膜电位8、直接观察胰岛素囊泡的胞吐过程9，以及通过细胞内Ca2+内流的定量来间接评估葡萄糖响应性10。其中，细胞内Ca2+成像的优势在于，可在同一个胰岛内对多个单个细胞进行同步分析11,12，从而实现不同β细胞之间葡萄糖响应性的直接比较。细胞内Ca2+浓度可通过钙离子敏感的荧光染料13或基因编码的钙离子指示剂（GECIs）14进行监测。钙离子指示染料缺乏细胞类型特异性，而GECIs则可通过特异性启动子实现在特定细胞类型中的表达。此外，新一代GECIs（如GCaMP6）具有更高的信噪比和更快的时间动力学特性15。本文描述了新一代GECIs（特别是GCaMP6s）在单细胞分辨率下可视化β细胞内钙离子动态的应用。我们以斑马鱼初级胰岛作为研究模型。在胚胎发育过程中，初级胰岛中的β细胞起源于背侧和腹侧胰腺芽16。初级胰岛位于斑马鱼胰腺中一个典型且固定解剖位置，便于其识别与分离。初级胰岛中的β细胞对葡萄糖调节至关重要，其遗传性消融会导致高血糖17,18。此外，这些β细胞在斑马鱼早期发育阶段即已具备葡萄糖响应性19。本实验方案也可用于成像后胚胎阶段形成的次级胰岛。该方法可在体外（ex vivo）条件下，于发育后期并在设定的葡萄糖浓度下对β细胞进行成像观察。

<table><tbody><tr><td>转基因斑马鱼品系：Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td><td></td><td></td><td>由作者提供</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>ZEISS</td><td>495015-0001-000</td><td>SteREO Discovery.V8</td></tr><tr><td>荧光灯</td><td>ZEISS</td><td>423013-9010-000</td><td>Illuminator HXP 120 V</td></tr><tr><td>红色滤光片组</td><td>ZEISS</td><td>000000-1114-462&amp;nbsp;</td><td>Filter set 45 HQ TexasRed</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>牛纤维蛋白原</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（Hanks 平衡盐溶液）</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 直径玻璃底培养皿</td><td>ThermoFisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐</td><td>Sigma</td><td>E10521&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>FIJI，使用 ImageJ 版本：2.0.0-rc-43/1.50e</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>R，版本 3.2.4</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/</td></tr><tr><td>plotcelltrace.R</td><td></td><td></td><td>随稿件提供的自定义脚本</td></tr></tbody></table>

利用斑马鱼胰岛单细胞分辨率钙成像分析β细胞功能

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

胰腺β细胞通过分泌胰岛素来响应升高的血糖浓度。β细胞功能障碍会导致高血糖及严重且危及生命的后果。了解β细胞在生理条件下的运作机制，以及可能导致其功能障碍的遗传和环境因素，有助于为糖尿病患者提供更佳的治疗方案。测量β细胞内钙离子水平的能力是评估β细胞功能的重要指标，因为钙离子内流会触发胰岛素的释放。本文介绍了一种利用基因编码的钙离子传感器GCaMP6s，监测斑马鱼β细胞中葡萄糖刺激下钙离子内流的实验方案。该方法可实现单细胞分辨率下细胞内钙离子动态变化的实时监测 离体 移植的胰岛。在不同葡萄糖浓度下，可同时捕获同一胰岛内β细胞对葡萄糖的响应性，表明斑马鱼β细胞之间存在功能异质性。此外，该技术具有高时间与空间分辨率，能够揭示葡萄糖刺激下钙内流的振荡特性。本方法为利用斑马鱼作为模型研究遗传和环境因素对β细胞功能及功能障碍的影响开辟了新途径。

采用上述方案，分析了受精后45天（dpf）斑马鱼胰岛中β细胞对葡萄糖的反应。实验中，从安乐死的斑马鱼体内分离出主胰岛，并将其置于玻璃底培养皿中的纤维蛋白原-凝血酶凝胶模具内。胰岛浸没于含5 mM葡萄糖的HBSS溶液中，随后逐步将葡萄糖浓度升高至10 mM和20 mM，记录β细胞对递增葡萄糖浓度的反应。最后，使用30 mM KCl使β细胞去极化（图1）。KCl诱导的去极化可促使健康的β细胞内钙离子流入。
利用 FIJI 和数据分析软件，提取并归一化单个β细胞的 GCaMP6s 荧光强度（图2）。从荧光强度的轨迹可见，单个β细胞在葡萄糖刺激下表现出 GCaMP6s 荧光的振荡，而在 KCl 刺激后振荡停止。该技术可提供单细胞水平上β细胞对葡萄糖响应性的解析，并揭示其功能状态。
<img alt="葡萄糖和KCl条件下细胞反应的显微图像；荧光检测结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 离体 使用 GCaMP6s 对斑马鱼 β 细胞中的钙离子内流进行活体成像。 一个原代胰岛细胞 Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); Tg(ins:GCaMP6s) 将45日龄的斑马鱼置于纤维蛋白原-凝血酶模具中，并在5 mM（基础浓度）葡萄糖条件下孵育。β细胞用红色核标记物标记，而GCaMP6s荧光信号出现在绿色通道中。胰岛通过依次孵育10 mM和20 mM D-葡萄糖的葡萄糖梯度刺激，并通过添加30 mM KCl实现去极化。箭头指示了用于分析其活性的单个β细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞实验中葡萄糖刺激的荧光响应图；时间 vs. 相对荧光变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：单个β细胞的标准化GCaMP6s荧光强度轨迹 箭头标记的β细胞中标准化的GCaMP6s荧光强度轨迹 图1横轴表示时间（单位：秒）。上方的条形图表示HBSS培养基中葡萄糖和KCl的浓度。纵轴表示时间序列中的归一化荧光强度。该值基于基线荧光强度（F0) 以5 mM葡萄糖孵育期间的平均荧光强度作为基准值。该基准值从整个时间序列数据中扣除（F - F0）。细胞的强度相对于基线的变化通过细胞显示的最大强度进行归一化处理（F - F0)/(F最大值- F0归一化轨迹显示了β细胞对葡萄糖的振荡性反应，当使用30 mM KCl使细胞去极化时，该反应趋于稳定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

β细胞功能对于血糖稳态至关重要，可通过基因编码的钙离子内流报告系统在单细胞水平上进行评估。

胰岛β细胞通过分泌激素胰岛素来响应升高的血糖浓度。β细胞功能障碍会导致……

该方法有助于理解β细胞领域中的重要问题，例如胰岛内单个β细胞之间的功能异质性。该技术的主要优势在于，通过对β细胞进行活体成像，可提供高时空分辨率。我们可以捕获单个β细胞内的钙振荡。根据文本方案将一条鱼实施安乐死后，将其转移至含有钙和镁的HBSS溶液的培养皿中。然后在配备荧光灯和红色滤光镜组的体视显微镜下，使用锋利的镊子从口部向肛门鳍方向剪开皮肤。剥离右侧的切口皮肤以暴露腹腔，从而显露内部器官。然后利用红色荧光识别β细胞中的mKO2表达，定位胰岛。通过仔细去除周围组织（如肝脏和脂肪细胞），清洁原代胰岛。注意避免损伤或戳破胰岛。接下来，用移液器将30 µL的HBSS液滴滴加到玻璃底培养皿的中央，然后将分离的胰岛转移至液滴中。用HBSS小心清洗胰岛一次，然后用30微升纤维蛋白原工作液清洗一次。清洗过程中避免胰岛干燥，以免导致细胞死亡。缓慢而轻柔地向胰岛中加入10微升浓度为10单位/毫升的凝血酶溶液。将胰岛和培养皿静置15至20分钟，不要触碰。观察纤维蛋白原-凝血酶液滴逐渐变得黏稠且稳定。需给予足够时间，使凝血酶在纤维蛋白原溶液中充分聚合。否则在成像过程中模具将无法提供稳定性。为进行GCaMP荧光的离体活体成像，先在模具上加入200 µL HBSS，然后小心地将培养皿放置在共聚焦显微镜的载物台支架上。接着使用20倍、0.8 NA的物镜并启用明场模式，定位胰岛。使用红色荧光滤光片观察β细胞中核定位的mKO2荧光，聚焦于胰岛。单个细胞核应清晰可见。通过手动沿Z轴方向移动穿过胰岛的厚度，找到清晰的成像平面。确保成像平面包含 50 至 100 个β细胞用于成像，且细胞核内 mKO2 荧光亮度均匀，尤其是在胰岛中心区域。接下来，在智能设置菜单中，按照以下参数为 GCaMP6 和 mKO2 荧光设置顺序采集。对于 GCaMP6，选择 488 纳米的激发光，发射光波长范围约为 500 至 555 纳米。在伪彩中选择 GFP。对于 mKO2，选择 561 纳米的激发光和 570 至 630 纳米的发射光。伪彩选择 mCherry。在采集模式下，将图像分辨率设置为 1,024 × 1,024 像素，扫描速度设为 10，平均次数设为 1。选择时间序列选项，设置持续时间为 500 个循环，每帧采集时间约为 2 秒，以启动连续记录。密切观察成像循环过程。在前50帧不干扰图像采集后，轻轻将5微升200毫摩尔的D-葡萄糖溶液滴加到承载胰岛的凝胶表面。随后在10毫摩尔葡萄糖条件下采集150帧图像。时间序列的前50帧对应β细胞在5毫摩尔葡萄糖条件下的活性。这是基础活性。响应性的β细胞会随时间推移显示出绿色荧光的逐渐增强和减弱。在第200帧时，通过轻轻加入10微升200毫摩尔的D-葡萄糖，将葡萄糖浓度提高至20毫摩尔。然后在 20 毫摩尔浓度下采集 150 帧图像。要在 FIJI 中打开图像文件，请选择插件（Plugin），LSM Toolbox，显示 LSM Toolbox。在 LSM Toolbox 中点击 Open LSM 并选择图像文件。在“分析”菜单的“工具”下打开 ROI 管理器。使用工具栏中的多边形选择工具，手动绘制感兴趣区域（ROI）。在红色通道中绘制 ROI，使其覆盖大于细胞核的区域，以包含部分细胞的细胞质。确保各帧之间的 ROI 位置保持一致，必要时调整其位置。通过单击“添加”按钮，将选定的 ROI 添加到 ROI 管理器中。选择并添加多个 ROI，以获取多个细胞的数据。接下来，从“分析”菜单中选择“设置测量”。然后选择“积分密度”，以指定提取该区域内总的荧光强度。切换到包含 GCaMP 荧光的绿色通道，在 ROI 管理器中选择“多点测量”。这将提供整个时间序列中细胞的强度测量值。将FIJI的输出结果保存为逗号分隔的文本文件。从LSM工具箱中获取图像帧的时间戳。使用“应用图章”、“应用 t-图章”、“文件名”、“导出到文本文件”功能获取时间戳。通过“另存为”选项保存时间戳，或将其复制到电子表格中。在汇总所有细胞的强度值后，可逐个细胞进行分析，或自动完成分析。更多细节请参见文字版实验方案。在本实验中，对来自45天斑马鱼龄（DPF）转基因品系的单个原代胰岛β细胞进行了刺激，该品系在β细胞中特异性表达核定位的mKO2和GCaMP6。实验中采用葡萄糖梯度刺激细胞，随后用氯化钾使其去极化，并对细胞的活动进行了分析。使用 FIJI 和数据分析软件，提取并归一化了单个β细胞的 GCaMP6 荧光强度。从该荧光强度轨迹可见，当葡萄糖刺激时，单个β细胞表现出 GCaMP6 荧光的振荡，而加入氯化钾后荧光趋于稳定。该技术可提供β细胞对葡萄糖响应能力的细胞级分辨率，并揭示其功能特性。一旦掌握，若操作正确，该技术可在45分钟内完成。在执行此操作过程中，重要的是要验证β细胞的活性。在此操作之后，可进行其他方法，如基因操作，以研究特定基因在β细胞功能中的作用。观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何测量单个β细胞内的葡萄糖反应。

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