Name: 用于表征土壤微生物的脂质提取和分析方法在许多样品的实验中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 39 s
Description: 学习土壤微生物脂质提取与分析方法，该方法通过氯仿-甲醇-磷酸盐缓冲液顺序提取，实现高通量处理多样本，同时平衡工作量与准确性，用于表征土壤微生物群落结构。

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本工作部分由美国能源部大湖生物能源研究中心（美国能源部科学办公室生物能源研究计划 DE-FC02-07ER64494）和美国能源部生物能源技术办公室可再生能源与能源效率计划（DE-AC05-76RL01830）资助。作者谨此感谢 Anders Gurda 在视频拍摄与编辑工作中所付出的耐心与精湛贡献。

注意：在整个操作过程中，务必始终佩戴适当的个人防护装备（PPE）。为避免样品可能受到污染，请勿用手直接接触玻璃器皿。在执行需要接触氯仿的实验步骤时，应佩戴适当的手套。
1. 准备工作（约40个样本需2天）
<ol>
	<li>将土壤采集到无菌袋中，并用含冰的冷藏箱从野外运回。若无法立即过筛并进行冷冻干燥，应将样品储存于 -80 °C 超低温冰箱中，直至开始分析。</li>
	<li>通过均质化处理土壤。去除根系和石块，并通过粗筛（例如 2 mm）打碎土块。</li>
	<li>按照冻干机说明书的要求，将子样品放入合适的容器中，尽快进行冷冻干燥。土壤冻干后，应储存在密封容器中并加入干燥剂，直至提取前。最好将冻干土壤至少储存在 -20 °C，更佳条件为 -80 °C。</li>
	<li>为提取做准备时，从储存中取出冻干土壤，研磨至类似面粉的细度。研磨方法包括球磨机、振荡磨和研钵研杵。研磨后，将土壤存入冰箱（见步骤 1.3）。 
	注意：用于提取的样品量取决于其有机质含量。一般建议，对于含碳量为 12% 至 18%（质量分数）的土壤，使用 0.5 至 1 g；对于含碳量为 1% 至 3%（质量分数）的土壤，使用 3 至 5 g。</li>
	<li>用正己烷预冲洗 30 mL 离心管。向管中加入约 2 至 3 mL 正己烷，涡旋振荡 5 秒。将正己烷倾入另一管中再次涡旋。2 至 3 mL 正己烷可依次冲洗六支离心管。将冲洗后的离心管倒置存放于通风橱中，使用过的正己烷应倒入适当的废液容器中处理。</li>
	<li>用 2 至 3 层铝箔包裹玻璃器皿，并放入马弗炉中。在 450 °C 下灼烧（马弗）4.5 小时。</li>
	<li>配制试剂。
	<ol>
		<li>根据所用土壤量，按磷酸盐缓冲液（P 缓冲液）: CHCl3 : MeOH 体积比 0.8:1:2 的比例加入化学试剂。</li>
		<li>配制 P 缓冲液：磷酸盐缓冲液，0.1 M，pH 7.0。
		<ol>
			<li>加入 61 mL 1 M K2HPO4 储备液（无菌，试剂应为 ACS 认证级或更高纯度），再加入 39 mL 1 M KH2PO4 储备液（无菌，试剂应为 ACS 认证级或更高纯度）。用 1 级水定容至 1000 mL&#160;。用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.0。未使用的溶液可在室温下保存最多 7 天，或在冰箱中保存 30 天。</li>
			<li>或者，称取 10.62 g K2HPO4 和 5.31 g KH2PO4，用 1 级水稀释至 1 L。检测 pH，必要时进行调节。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制试剂 1：皂化试剂。
		<ol>
			<li>量取 300 mL 1 级水。加入 300 mL CH3OH（HPLC 级或更高纯度）。加入 90.00 g NaOH（ACS 认证级或更高纯度）。在搅拌下将 NaOH 颗粒加入溶液中，持续搅拌至完全溶解。建议该溶液储存时间不超过 30 天。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制试剂 2：甲基化试剂。
		<ol>
			<li>量取 275 mL CH3OH（HPLC 级或更高纯度）。在搅拌下加入 325 mL 6.00 N HCl（经认证）。建议该溶液储存时间不超过 30 天。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制试剂 3：提取试剂：50% C6H14（正己烷），50% C5H12O（MTBE）。
		<ol>
			<li>在通风橱中，将 200 mL C6H14（HPLC 级或更高纯度）与 200 mL C5H12O（HPLC 级或更高纯度）混合。充分混匀后密封。储存于易燃品柜或通风橱中，储存时间不超过 1 年。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制试剂 4：碱洗试剂。
		<ol>
			<li>量取 900 mL 1 级水至烧杯中。在搅拌下加入 10.80 g NaOH（ACS 认证级或更高纯度）。搅拌至颗粒完全溶解。建议该溶液储存时间不超过 30 天。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制内标储备液。
		<ol>
			<li>称取 100 mg 19:0 EE 标准品，加入经正己烷冲洗过的 50 mL 容量瓶中。加入约 15 mL 正己烷-MTBE 溶液（试剂 3），轻轻旋转使其溶解。用正己烷-MTBE 溶液（试剂 3）定容至 50 mL。盖紧瓶盖并旋转混匀。转移至经正己烷冲洗、带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖的玻璃管中，于 -20 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第2天 - 从土壤中提取脂肪酸（约40个样品需4至5小时）
<ol>
	<li>准备三个 5 到 10 mL 的分配移液管，分别用于 P 缓冲液、氯仿和甲醇。 
	注意：已有研究提出氯仿的较低危害性替代萃取剂。这些替代物可能获得相当的脂质回收率16,17，但本方案未对其进行评估。</li>
	<li>将冻干土壤称重后放入 30 mL 离心管中，并记录土壤质量。</li>
	<li>制备两个空白样，并加入一个检核查标准样（即先前已提取过的土壤）。</li>
	<li>在通风橱中，按以下顺序向离心管中的土壤加入试剂：&#160;P 缓冲液、CHCl3 和 MeOH（见表 1）。在加入 P 缓冲液后，需等待土壤充分润湿，再加入 CHCl3。盖紧离心管盖，并用遮光材料包裹以避光。</li>
	<li>将离心管水平放置于摇床上，确保固定牢固。设置摇床转速为 280 rpm，振荡 1 小时18。</li>
	<li>为每个样品准备两支 16 mm × 150 mm 玻璃试管，操作如下：标记试管，并向其中各加入等体积的 CHCl3 和等量的 P 缓冲液。</li>
	<li>将离心管从摇床上取出，于 1,430 × g 和 25 °C 条件下离心 10 分钟。玻璃试管中应可见明显的相分离。</li>
	<li>在通风橱中，将离心管中的上清液倾入步骤 2.6 中准备好的其中一支试管中。重复步骤 2.4 至 2.5，将第二次提取的上清液倾入第二支试管中。</li>
	<li>使用带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫的盖子严密封闭所有 16 mm × 150 mm 玻璃试管，倒置 10 次以充分混匀。</li>
	<li>让样品静置过夜，以完成两相的完全分离。为此，应将样品置于避光的柜子或用铝箔包裹，于室温下存放。允许提取物在周末期间进行相分离。
	<ol>
		<li>或者，若希望直接进入下一步，或次日样品受到扰动，可将样品于 1,000 × g 和 25 °C 条件下离心 10 分钟。 
		注意：同一比较组内的所有样品应采用相同的相分离静置时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第3步 第2天 - 脂质的提取（约40个样本需3至4小时）
<ol>
	<li>开启蒸发装置和溶剂捕集器。将蒸发装置温度设为 33 °C 并预热。</li>
	<li>在通风橱内安装真空抽滤装置：将侧臂烧瓶连接至真空泵，再通过一段高纯度管路连接玻璃移液管。</li>
	<li>用真空抽滤法吸除两支玻璃管中的上层及界面部分（约向下抽取三分之二），保留水相层。每个样品使用新的洁净移液管重复此操作&#160;。</li>
	<li>小心倾倒，将第二支管中的水相提取物合并至第一支管中。确保用于倾倒的试管表面无划痕或裂纹。</li>
	<li>当氯仿（CHCl3）提取液合并后，检查液体状态——应呈澄清透明。若浑浊，加入甲醇（MeOH）直至溶液变清。</li>
	<li>使用真空蒸发装置将所有样品干燥。初始设置为温度 33 °C、涡旋速度 26%、压力 400 mbar。</li>
	<li>将样品放入蒸发系统，10 分钟后缓慢将压力降至 350 mbar。</li>
	<li>持续监测蒸发进程，当管内液面降至加热块高度时，将压力进一步降至 300 mbar。</li>
	<li>继续监测剩余液体高度，当液深约为 1 cm 时，将压力降至 200 mbar。</li>
	<li>样品完全干燥后，取出样品，并继续运行真空泵 10 分钟以清除残留蒸气。</li>
	<li> tightly 封闭试管，将脂质样品于 -80 °C 超低温冰箱中保存。</li>
	<li>根据相关化学品安全法规，妥善处理已抽吸的废液。</li>
</ol>
4. 第3天——皂化与甲基化（约40个样品需6至7小时）
<ol>
	<li>打开水浴锅，将水浴锅1设定为95 °C，水浴锅2设定为80 °C。</li>
	<li>设置移液器分配装置，并确保其分配的体积准确。 
	试剂1：每份样品1 mL 
	试剂2：每份样品2 mL 
	试剂3：每份样品1.25 mL 
	试剂4：每份样品3 mL 
	注意：加热过程会在试管内产生压力。请勿使用有划痕、裂纹或缺口的试管。</li>
	<li>使用移液分配器向干燥的脂质中加入1.0 mL试剂1。盖紧管盖，涡旋振荡5秒，然后置于试管架中。</li>
	<li>将装有样品管的试管架放入95 °C水浴中加热5分钟。从水浴中取出试管架，检查各管是否有泄漏，泄漏表现为管内有气泡上升。对泄漏的管子重新拧紧或更换管盖，并再次检查是否存在裂纹或破损。继续将试管置于水浴中加热额外10分钟。</li>
	<li>将样品从浴槽1中取出，放入浴槽2（80 °C）中，继续孵育15分钟。</li>
	<li>取出离心管，将装有离心管的架子放入盛有自来水的容器中冷却样品。</li>
	<li>向每个样品中加入2 mL试剂2。盖紧盖子，涡旋5至10秒。</li>
	<li>将架子放入80 °C水浴中，孵育10分钟。</li>
	<li>从水浴中取出试管架，放入盛有自来水的容器中冷却。振荡试管架以加快冷却过程。 
	注意：切勿超过规定的时间和温度。过度加热可能导致脂肪酸甲酯（FAMEs）降解。</li>
	<li>使用移液分配器向每个样品管中加入1.25 mL试剂3，以提取脂肪酸甲酯。盖紧管盖，将试管置于摇床中振荡10分钟。</li>
	<li>振荡后，将试管架静置10分钟，使各相分层。使用玻璃移液管将有机相（上层）转移至一支16 mm × 100 mm的玻璃试管中。</li>
	<li>再次加入试剂3，振荡，静置分层后，转移上层相，重复提取。 
	注意：不要转移任何下层相。在管中残留少量上层相是允许的。</li>
	<li>使用移液分配器，向16 mm × 100 mm试管中加入3 mL试剂4。</li>
	<li>盖紧试管，涡旋振荡20-30秒。</li>
	<li>涡旋后，在1,000 × g条件下离心3分钟。</li>
	<li>使用洁净的玻璃移液管吸取上层有机相，并转移至4 mL棕色样品瓶中。</li>
	<li>打开蒸发装置和溶剂捕集器。将蒸发装置温度设为 30 °C，涡旋速度设为 26%，真空度设为 200 mbar，然后按下预热。</li>
	<li>监测实验进程。样品干燥后，取出样品，并继续运行泵 10 分钟，以清除蒸气。</li>
	<li>从试剂瓶1和4中取出移液管，并用稀酸冲洗例如 1% HCl），然后用去离子水冲洗。用去离子水抽吸冲洗用于试剂2的移液管。在通风橱内，将用于试剂3的移液管中的溶剂排入适当的容器中，并将移液管留在通风橱内，直至溶剂残留物完全挥发。</li>
	<li>将移液器倒置存放，并取下活塞，以防止止回阀粘连。</li>
	<li>使用玻璃移液管一次后，应将其丢弃至适当的容器中。</li>
	<li>在通风橱中，使玻璃器皿上的溶剂残留挥发干净。</li>
	<li>用清水和洗涤剂溶液冲洗玻璃器皿。</li>
</ol>
5. 第4天——工作溶液的配制及FAMEs转移至GC小瓶（约40个样品需2-3小时）
<ol>
	<li>收集材料：4 mL 棕色小瓶（含干燥样品）；2 mL 棕色气相色谱小瓶&#160;400 µL 平底玻璃插件及瓶盖；500 µL 玻璃注射器；50 mL 容量瓶；储备液——十九酸乙酯（19:0 EE 内标）溶于 50/50 己烷/甲基叔丁基醚（试剂 3）</li>
	<li>使用玻璃注射器，将500 µL十九酸乙酯（19:0 EE）储备液加入50 mL容量瓶中。</li>
	<li>用试剂3加至容量刻度线。</li>
	<li>盖紧瓶盖，倒置混匀5次。</li>
	<li>将3 mL转移至洁净的4 mL小瓶中，作为工作溶液储备。</li>
	<li>使用玻璃注射器，向每个含有干燥脂肪酸甲酯的4 mL小瓶中加入300 µL工作液，并盖紧瓶盖。</li>
	<li>涡旋混匀样品15秒，静置15分钟。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管，小心地将悬浮的脂肪酸甲酯转移至含有400 µL内插管的2 mL GC小瓶中。</li>
	<li>将密封的气相色谱小瓶在分析前存放于 -20 °C 冰箱中。</li>
	<li>提交样品进行气相色谱分析。 
	注意：分析必须使用补充文件中所述的特定气相色谱柱和条件进行。 S1甲基化后最好在两周内完成气相色谱分析。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

对于包含大量重复和/或实验单元的实验中多个样品的检测，研究人员可能会发现磷脂脂肪酸分析（PLFA）在时间和材料消耗方面具有较高限制性25。在PLFA方法中，通过改良的Bligh和Dyer26双相水-有机溶剂萃取法提取、纯化并鉴定细胞膜磷脂。随后采用固相硅胶色谱法按极性分离脂类，并将磷脂脂肪酸进行碱性甲酯化，转化为脂肪酸甲酯。在PLFA分析中，脂类得率可能较低，但纯度非常高。Microbial ID提出了一种替代方法，即脂肪酸甲酯法（MIDI-FA）。在MIDI-FA方法中，所有脂类直接通过皂化法从纯培养物或土壤/沉积物样品11,12,27中提取。该方法脂类损失较少，且操作快速，因其省去了PLFA方法中的浓缩和纯化步骤。然而，尽管MIDI-FA方法快速且成本较低，但由于其最初设计用于鉴定纯培养中的生物体，因此缺乏初始的提取和纯化步骤。因此，该方法可能共提取土壤有机质中的类脂化合物，从而干扰微生物群落特征信号27,28,29。由于此类干扰也可能影响生物量测定结果，MIDI-FA通常仅用于粗略的定性描述土壤脂类组成13。
本文所述方法结合了两种独立提取流程的优点：1）采用改良的 Bligh 和 Dyer26 方法进行脂质的提取与浓缩；2）采用商业化开发的脂肪酸甲酯皂化、甲基化、提取及碱洗流程。该方法旨在兼收上述两种方案的优势，同时尽量减少各自的缺点15。通过在执行 MIDI-FA 之前先进行初始提取，分离出有机溶剂可溶性组分（例如 脂质），并结合纯化步骤，本方案在速度与精确性之间实现了良好平衡。尽管该方法在需要高纯度（即 用于13C PLFA 分析）或需分别分析磷脂与中性脂质的情况下可能不适用，但在许多情况下，其检测微生物群落对环境条件响应的灵敏度高于基于 DNA 的方法30,31,32,33。细胞死亡后膜脂迅速降解，因此其可反映采样时刻存活的微生物群落状态5,7，而环境 DNA 中的大量信息则来源于已死亡或非活跃的生物体34。鉴于土壤微生物中普遍存在休眠现象35，对活体生物量的表征可用于在较精细的时间尺度上理解植物-微生物间的动态相互作用，而脂质生物标志物则可用于评估微生物群落的生理状态7。已有研究表明，在大范围野外条件下评估微生物响应需要高通量方法25。尽管本文提出的方法无法完全达到 PLFA 生物标志物分析的精确度，但其在提高通量的同时，显著降低了 MIDI-FA 流程中的变异性。该方法已被证明是研究大规模农业和生态系统中多种土壤微生物群落动态问题的有效工具36,37,38,42,43,44,45,46,47,48,49,50。
采用该方法会合并脂质类别，可能导致这些独立类别中所含信息的丢失22,39，但合并脂质类别可能增强检测来自磷脂和中性脂质的16:1 ω5c的丛枝菌根真菌来源的能力40。此外，尽管该方法检测出的未知脂肪酸（可能来源于非生命有机质）数量可能较高，但研究表明其数量仍低于MIDI-FA法，并且适用于需要处理大量样品、关注样品通量的研究中对脂质谱进行处理间的比较15。通常认为中性脂质组分主要来源于真菌合成的储存脂质，尽管也可能有少量来自土壤动物的贡献41。鉴于此，本文所述方法所得结果可能显示真菌脂质18:2 ω6,9c和18:1 ω9c的贡献高于PLFA法。在中性组分中常见的其他脂质还包括一些饱和脂肪酸，例如 16:0、18:0、20:0。
脂质数据的表达和分析有多种方式。最常见的表示方法是丰度（nmol/g）-1 土壤），摩尔分数（nmol 单个脂质 / nmol-1 总脂质）和摩尔百分比（摩尔分数×100）。以样品中总脂质为归一化基准，摩尔分数和摩尔百分比用于衡量特定脂质的相对丰度。经过适当转换后， 例如，反正弦平方根变换，摩尔分数适用于主成分分析或冗余分析排序。丰度是指每克土壤中提取的特定脂质的绝对含量。由于每个细胞的脂质含量相对恒定，且脂质提取效率高且全面，因此总丰度可良好估计总脂质量，而关键指示物种的丰度则反映了其所代表生态类群的生物量17最后，分析微生物群落组成的一个有效方法是采用多变量分析方法。16, 例如排序方法，例如非度量多维尺度分析（NMDS——无需数据转换）或主成分分析（PCA），可用于比较所有脂质生物标志物的相对丰度。

鉴于微生物在养分循环1、植物群落组成改变2、植物生产力调控3以及有机物分解4中所起的关键作用，了解土壤微生物群落对于理解陆地生态系统至关重要。
由于脂质生物标志物在土壤中相对含量较高，且具有特定的化学特征，因此可用于分析构成土壤微生物群落的主要生态类群5。通过定量不同微生物类群特有的脂质生物标志物，可以估算总脂质含量，并将这些脂质进一步划分为具有生态学意义的类群，如革兰氏阳性（Gm+）和革兰氏阴性（Gm-）细菌、丛枝菌根（AM）真菌和腐生真菌，以及放线菌5,6,7,8。
表征微生物群落特征的方法有多种。磷脂脂肪酸（PLFA）法是常用于了解微生物群落基本结构的一种方法。该方法可有效评估不同微生物类群的相对丰度以及总微生物生物量。由于脂质代谢迅速，PLFA分析还能相对较快地检测土壤微生物群落的变化，并提供可用于比较生态系统功能的信息，例如通过真菌与细菌的比例来评估养分循环速率1,9,10。然而，尽管PLFA提取方法历史悠久且广受认可，但其操作过程耗时较长，难以适用于需要大量田间重复样品的生态系统尺度研究11,12。
相比之下，脂肪酸甲酯提取法（MIDI-FA）具有实现高通量分析的潜力。该方法中，样品经过皂化、转化为脂肪酸甲酯（FAMEs）、提取，然后进行分析。MIDI-FA 方法快速，但分辨能力低于磷脂脂肪酸分析法（PLFA），后者结合了脂质提取与不同脂质类别（磷脂、中性脂质和糖脂）的分离13。
在本实验方案中，我们描述了一种结合了PLFA和MIDI-FA脂质分析方法特点的技术。该方法采用改良的Bligh和Dyer法中的初始氯仿提取步骤进行脂质提取，随后进行皂化并转化为脂肪酸甲酯（FAMEs）。这种方法能够有效检测微生物群落结构，同时排除大量非微生物来源的背景干扰5,14。本方法的开发旨在平衡PLFA与MIDI-FA两种方案的优势，即在保留大部分准确性的同时提高通量，从而使大规模、多样本研究中的脂质分析在操作和经济上更具可行性15。通过在执行MIDI-FA前先进行初始提取，分离出有机溶剂可溶性组分（e.g. 脂质），并结合纯化步骤，该方案在分析速度与精确性之间实现了良好平衡。

<table><tbody><tr><td>RapidVap</td><td>Labconco</td><td>7900000</td><td>蒸发系统</td></tr><tr><td>RapidVap</td><td>Labconco</td><td>7491400</td><td>样本块</td></tr><tr><td>耐化学腐蚀真空泵</td><td>Labconco</td><td>7584000</td><td>真空泵</td></tr><tr><td>化学捕集罐</td><td>Labconco</td><td>7815300</td><td>捕集罐</td></tr><tr><td>溶剂插入件</td><td>Labconco</td><td>7515200</td><td>溶剂捕集插件</td></tr><tr><td>隔膜泵</td><td>韦尔奇</td><td>7398000</td><td>DryFast 真空泵</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher</td><td>15-462-15Q</td><td>2孔水浴锅</td></tr><tr><td>气相色谱仪</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于样品分析</td></tr><tr><td>离心</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于样品分离</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于样品冻干</td></tr><tr><td>Repipet (6)</td><td>BrandTech</td><td>4720440</td><td>用于试剂的分装</td></tr><tr><td>涡旋混合</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td>模拟旋涡混合器</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯离心管</td><td>Thermo/Nalgene</td><td>3114-0030</td><td>聚四氟乙烯样品管</td></tr><tr><td>胶囊</td><td>Thermo/Nalgene</td><td>DS3131-0020</td><td>聚四氟乙烯管帽</td></tr><tr><td>试管</td><td>康宁</td><td>9825-16</td><td>16x100毫米试管</td></tr><tr><td>试管</td><td>康宁</td><td>9825-16xx</td><td>16x150毫米试管</td></tr><tr><td>胶囊</td><td>康宁</td><td>9998-15</td><td>15-415 螺纹黑色酚醛盖，带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher</td><td>13-678-20B</td><td>14.6厘米</td></tr><tr><td>500 uL 玻璃注射器</td><td>Fisher</td><td>13684106LC</td><td>Hamilton 81217</td></tr><tr><td>琥珀色小瓶</td><td>安捷伦</td><td>5182-0716</td><td>4 mL 棕色小瓶</td></tr><tr><td>胶囊</td><td>安捷伦</td><td>5182-0717</td><td>蓝色螺旋盖</td></tr><tr><td>插入片段</td><td>安捷伦</td><td>5181-3377</td><td>400 μL 平底玻璃插件</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;标准&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>19:0 乙基十九烷酸酯（Ethyl nonadecanoate）</td><td>VWR</td><td>TCN0459-5G</td><td>分析标准品</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾（K2HPO4 - ACS级或更高纯度）</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于配制磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH2PO4 - ACS 级或更高纯度）</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于配制磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>甲醇（CH3OH - HPLC 级或更高纯度）</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于制备试剂1 &amp;和 2</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH - ACS 级或更高纯度）</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于制备试剂1 &amp;和 4</td></tr><tr><td>盐酸（6N HCl）</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于配制试剂2</td></tr><tr><td>正己烷（HPLC 级或更高纯度）</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于配制试剂3</td></tr><tr><td>MTBE（甲基叔丁基醚 - HPLC 级或更高纯度）</td><td>各种</td><td>N/A</td><td>用于配制试剂3</td></tr></tbody></table>

一种适用于大量样本实验中表征土壤微生物的脂质提取与分析方法

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

微生物群落是生态系统过程的重要驱动者和调节者。为了理解生态系统管理如何影响微生物群落，通常采用一种相对精确但操作较为繁琐的方法——磷脂脂肪酸（PLFA）分析，来检测微生物群落组成。PLFA 方法用于分析磷脂生物标志物，这些标志物可作为微生物生物量以及真菌和细菌等主要功能类群组成状况的指示指标。该方法常被用于比较不同植物群落、生态条件及管理措施下的土壤微生物状况。研究表明，PLFA 方法能够灵敏地检测出微生物群落组成的变化。
另一种方法是脂肪酸甲酯提取与分析法（MIDI-FA），该方法用于从纯培养物中快速提取总脂质，无需分离磷脂组分，可作为微生物鉴定技术。该方法虽然快速，但不太适用于土壤样品，因为它缺少初始的土壤颗粒分离步骤，而是直接从皂化反应开始，这可能导致土壤中背景有机质产生干扰物质。
本文介绍了一种在提高通量的同时平衡工作量与准确性的方法，用于从微生物细胞膜中提取脂质，以表征总脂质及指示性脂质的相对丰度，从而在包含大量样本的研究中确定土壤微生物群落结构。该方法结合了磷脂脂肪酸（PLFA）分析的准确性，首先提取并浓缩土壤脂质；随后通过皂化所提取的有机物质，并采用MIDI-FA方法进行处理，从而减少操作步骤和工作量。

报告中的数据表可汇总至电子表格或数据库中。在对响应因子（用于校正不同碳链长度响应值的校正因子）进行校正后，可通过将各峰面积与外标或内标的峰面积进行比较，计算出提取物中的浓度。通过除以提取土壤的质量，数据可表示为每克土壤中脂肪酸甲酯（FAME）的质量；或者，利用每种FAME的分子量，更常以每克土壤中多少nmol的形式表示。微生物FAME的总量可反映总微生物生物量，并可用于不同处理间的比较（图1）。某些FAME还可与特定微生物类群相关联，例如革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌、放线菌、丛枝菌根真菌以及腐生真菌19,20,21,22,23,24。特定生物标志物质量之间的比值可反映这些类群的相对丰度（图2）。总体FAME丰度模式可形成群落水平的“指纹”特征，从而可通过排序等多元统计方法对微生物群落间的差异性进行比较（图3）。与大多数基于DNA的方法不同，群落水平的脂质数据既可采用相对丰度，也可采用绝对丰度进行分析。若样品间总生物量存在显著差异，这两种方法将得出截然不同的结果；应根据实验所针对的生态学问题来选择合适的方法。
<img alt="FAME生物量图表；玉米、施肥与未施肥草原系统的土壤肥力比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：总FAME生物量。连续玉米、施肥草原和未施肥草原系统中总FAME生物标志物生物量（nmol g-1 土壤）的比较。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="玉米与草原轮作系统中细菌和真菌的FAME生物量柱状图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：细菌和真菌的FAME生物量。 连续玉米、施肥草原和未施肥草原处理下细菌与真菌FAME生物标志物生物量（nmol g-1 土壤）的比较。真菌和细菌生物量基于绝对丰度计算，取平均值（真菌总和/细菌总和）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="非度量多维尺度分析（NMDS）图；玉米、施肥与未施肥草原。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55310/55310fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：FAME脂质生物标志物的非度量多维尺度分析。基于所有微生物FAME脂质生物标志物的绝对丰度谱，对整体微生物群落进行比较。在此示例中，连续种植玉米和未施肥草原的微生物群落彼此分离且相距较远，而部分施肥草原样品的微生物群落与玉米地的群落相似，另一些则与未施肥草原的群落相近。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55310/55310fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="土壤溶液配制表；不同土壤克数所需的P-Buffer、CHCl3、MeOH体积。" src="/files/ftp_upload/55310/55310table1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="表 1"> 
表 1：溶剂种类、添加比例（g−1土壤）及加入顺序。 此信息对于有效提取并分离有机相与水相至关重要。
补充文件 S1：<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55310/S1_GC_analysis.docx" target="_blank">请点击此处下载。</a>

本文介绍了一种方法，该方法在提高通量的同时，平衡了操作难度与准确性，可用于从微生物细胞膜中提取脂质，进而对大量样本研究中的总脂质以及指示性脂质的相对丰度进行表征，以确定土壤微生物群落结构。

微生物群落是生态系统过程的重要驱动者和调节者。了解生态系统管理如何影响微生物……

本视频旨在介绍一种方法，该方法可在提取微生物细胞膜脂质时提高通量，同时平衡工作量与准确性，适用于表征总脂质及指示性脂质的相对丰度，以分析土壤微生物群落结构，并适用于包含大量样本的研究。在野外采样时，应考虑土壤的空间异质性，采用能够代表采样地点特征的方式采集土壤样品。为保持采样时刻的微生物群落状态，样品从野外采集后应置于冰上运输。返回实验室后，去除根系和石块，并通过粗筛破碎土块。此步骤也可使样品均一化。将样品分装至合适的容器中，尽快进行冷冻干燥处理。土壤冻干后，应储存于含干燥剂的密封容器中，直至进行提取。最好将冻干土壤在 -80 °C 下保存。提取前，将冻干土壤从储存容器中取出并研磨。研磨方法包括球磨机、振荡磨或研钵与研杵。再次研磨土壤后，充分均质化土壤样品，并储存于冰箱中。所有实验器具必须彻底清洁。任何残留的洗涤剂、油脂或污垢都可能在最终的气相色谱图中产生峰，从而影响实验结果。提取在30毫升聚四氟乙烯离心管中进行，离心管必须用溶剂冲洗。向管中加入2至3毫升己烷，涡旋数秒。将己烷倾入另一管中并涡旋。可使用2至3毫升的正己烷依次冲洗六个试管。将用正己烷冲洗过的试管倒置存放于通风橱中，并将使用过的正己烷弃置于适当的废液容器中。玻璃器皿可在使用前进行灼烧处理或用溶剂冲洗。高温灼烧可使器皿上的残留物氧化，从而确保器皿清洁。将玻璃器皿用两到三层铝箔包裹后放入马弗炉中。设定温度为450摄氏度，待炉温达到设定值后，至少烘烤4.5小时。从炉中取出前，至少冷却一小时。标记并称量经正己烷冲洗过的聚四氟乙烯管。将土壤加入聚四氟乙烯离心管中，并重新称重以确定土壤质量。每批样品至少制备两个空白样，并加入一个检核标准品，最好选用先前已提取过的土壤，以验证提取过程是否正确。脂质提取：为磷酸盐缓冲液、氯仿和甲醇分别准备三支5至10毫升的重复移液管。氯仿是一种密度很高的液体，具有较低的表面张力。请小心确保所分配的液体体积准确且一致。保持瓶内液体至少半满。在通风橱中，按照以下顺序将试剂加入聚四氟乙烯管中的土壤样品：磷酸盐缓冲液、氯仿和甲醇。这是从样品材料中进行的第一次脂质物理提取。试剂溶液的配制方法详见书面实验方案。溶剂的比例及添加顺序对于有机相与水相的正确分离至关重要。在加入缓冲液后，应给予土壤充分湿润的时间，再加入氯仿。若操作方便，可将提取剂合并，在第二次及后续任何提取步骤中作为单次等分量加入。 tightly 封紧聚四氟乙烯管，并用遮光材料覆盖。将它们水平放置在摇床上，确保固定牢固。设置摇床速度为高速，振荡 1 小时。在试管振荡的同时，为每个样品准备两支长玻璃试管，步骤如下：标记试管，加入与土壤等体积的氯仿以及等体积的磷酸盐缓冲液。将Teflon试管从摇床取出后，在25 °C下以2,500 RPM离心10分钟。然后，在通风橱内关闭光源，将特氟龙管中的上清液倾入其中一根长管中。在玻璃管中应可见相分离现象。下层为有机溶剂（主要为氯仿）及脂质。重复此提取步骤。将上清液倒入之前准备好的第二个离心管中。此时，您已对土壤中的脂质进行了两次物理提取。对于大多数土壤而言，此步骤已足够。使用带聚四氟乙烯衬垫的盖子牢固密封所有长型试管，倒置10次以混匀。通过重力作用静置过夜，使各相分离。将样品静置过夜，以完成两相的分离。为此，将样品置于避光的柜子中，或用铝箔包裹后在室温下保存。允许提取物在周末期间进行分离是可行的。第二天，脂质的提取。在第二天，吸除水层，并通过真空蒸发系统去除溶剂以浓缩脂质。样品也可置于水浴或沙浴中，通入温和的氮气流进行干燥。此时，管中的液体应已充分分离且大部分澄清。如果尚未达到此状态，或两层之间的界面特别厚，则应继续静置一天。在通风橱中设置真空抽滤装置。这是一个侧臂烧瓶，通过一段莱叶泰龙管和一根巴斯德移液管连接至真空泵。开启泵后，使用移液管将水相吸入烧瓶中。抽吸上层液体及界面层。这大约位于下方三分之二处。对二至三组玻璃管重复此操作。上层可能含有少量土壤颗粒。如有可能，移除这些物质。通过小心倾倒，将第二组和/或第三组试管中的提取物合并到前两组试管中。倾倒时尽量避免倒入任何固体物质，并通过旋转冲洗试管壁。每个样品使用一支干净的移液管，并对剩余样品重复此过程。待氯仿提取液合并并静置数分钟后，检查液体表面。通常会形成一层薄薄的残留水层。如果存在此情况，应在继续操作前进行抽吸。残留的水分可能会攻击脂肪酸的双键，但少量水分应随溶剂在样品干燥过程中共蒸发。使用真空蒸发装置将所有样品完全干燥。将管子盖紧，并在 -80 °C 的冷冻器中保存。第三天，进行皂化和甲基化。首先，打开水浴锅，检查水位，并将水浴锅一设定为 95 °C，水浴锅二设定为 80 °C。使用多通道移液器，向干燥的脂质中加入 1 mL 皂化试剂（试剂 1）。盖紧盖子，短暂涡旋，然后放入试管架中。完成此步骤后，将装有试管的试管架置于95 °C水浴中，静置5分钟。从水浴中取出试管架，检查试管是否有泄漏。这将表现为管内有气泡上升，形成泡沫状。重新拧紧或更换泄漏管子的管盖。继续将管子在水浴中加热10分钟。将水浴锅的温度设置降低至80摄氏度，继续孵育15分钟。取出试管架，将其放入盛有自来水的容器中冷却。切勿使用冰水。待样品冷却后，向每个样品中加入2毫升甲基化试剂（试剂2）。再次盖紧管盖，并涡旋振荡5至10秒。溶液中可能出现颗粒状盐类沉淀，这是由于试剂过量所致，属正常现象。将试管架放入80 °C水浴中孵育10分钟。从水浴中取出试管架，放入盛有自来水的容器中冷却。振荡试管架以加快冷却过程。使用可调移液器，向每根试管中加入1.25毫升己烷和甲基叔丁基醚（试剂3），以进行相萃取。盖紧管盖，将试管置于摇床中振荡10分钟。振荡结束后，将试管架静置10分钟，使两相充分分离。使用巴斯德吸管将有机相（现为上层）转移至短玻璃管中。应尽量回收大部分液体，残留少量水相不会影响提取效果。通过加入试剂3，振荡，静置分层，然后转移上层相，重复水相提取。根据下层相的状态，可再重复此步骤一次，共进行三次转移。向短管中的提取物中加入3毫升碱洗液（试剂4），即氢氧化钠的稀溶液。将试管盖紧，涡旋振荡20至30秒，然后在2,000 RPM条件下离心3分钟。离心后，使用一支洁净的巴斯德吸管吸取上层有机相，并转移至一个4毫升的棕色小瓶中。注意切勿吸入任何水相成分。下一步是在真空蒸发装置中将溶剂完全蒸发至干燥。第四天，准备用于气相色谱分析的提取物。使用移液器，向每个含有干燥相的4毫升小瓶中加入100微升试剂3。将样品涡旋振荡，然后静置10分钟。使用第二个移液器，小心地将悬浮的脂肪酸甲酯（FAMEs）转移至气相色谱（GC）小瓶中。向4毫升小瓶中加入另一份溶剂，并短暂涡旋振荡。轻轻滚动离心管，确保管壁上残留的脂肪酸甲酯（FAMEs）完全溶解。再次使用第二个移液器，将溶剂转移至气相色谱（GC）进样瓶中。随后向离心管中加入第三份等量溶剂，涡旋混匀，再将溶剂全部转移至GC进样瓶，以完成彻底转移。盖上气相色谱小瓶盖，并置于冰箱中冷冻保存。在分析前，将密封的气相色谱小瓶存放在冰箱中冷冻。气相色谱分析。使用该系统时，必须采用特定的气相色谱柱进行分析。气相色谱仪配备分流/不分流进样口，内置内径为4 mm的玻璃衬管，并装有带去活化玻璃棉插件的衬管。进样口温度设定为250 °C，以恒定压力模式运行。载气为氢气。检测器辅助气体需要氮气和空气。使用安捷伦Ultra 2色谱柱。色谱柱长度为25米，内径为2毫米，固定相液膜厚度为33微米。该色谱柱的固定相为5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，也称为DB-5型色谱柱。分析脂质提取物时，将2微升等分试样以100:1的分流比进样，进样时烘箱温度为170°C。进样后，程序设定烘箱温度以每分钟5°C的速率升至300°C，然后保持12分钟。按照MIDI手册中的说明，进行一系列MIDI标准品的注射，并根据结果进行相应调整。通过此方式校准后，系统可能偶尔需要进行微调，但通常情况下使用这些参数即可获得良好的结果。MIDI系统会为每个样本生成一份报告，报告中包含一个表格，每条已识别的峰对应一行数据。该软件会报告峰保留时间、峰面积、峰鉴定结果，以及用于峰鉴定的参数——等效碳链长度（ECL）或估计链长度，还有用于校正保留时间相关的检测器响应差异和变异性的响应因子。ECL 表示未知脂肪酸甲酯（FAME）在一系列直链脂肪酸甲酯洗脱序列中的相对位置。例如，如果某未知物的保留时间介于 12 碳链和 13 碳链脂肪酸甲酯之间的一半位置，则其 ECL 报告为 12.5 碳链。该软件将每个峰的ECL值与数据库中FAME的ECL值进行比较，当匹配时，为未知物分配相应的名称。对于数据库中ECL值非常接近的两种FAME，软件会同时列出两个名称，其中最接近的排在首位。报告中的数据表可汇总至电子表格或数据库中。在校正响应因子后，可将峰面积与外标或内标的峰面积进行比较，从而计算出提取物的浓度。通过除以所提取土壤的质量，数据可表示为每克土壤中脂肪酸甲酯（FAME）的质量，或结合各FAME的分子量，表示为每克土壤中FAME的纳摩尔数（nmol/g）。随后可将生物标志物FAME加和，以估算微生物功能群的生物量，并对这些功能群作进一步分析。例如，此处我们观察到未施肥的草原比施肥的草原含有更多的FAME生物量。两者均比邻近玉米田的生物量更高。此外，FAME与特定的功能类群（如真菌或细菌）相关。这些关联具有生态系统特异性，因此不宜过度泛化。此类分析可用于判断某些类群在特定环境中是否更为丰富。此处显示，真菌在未施肥的草原中比在玉米田中更为丰富。最后，另一种观察整体微生物群落组成的方法是通过排序分析（如非度量多维尺度分析，NMDS，或主成分分析，PCA），同时比较所有脂肪酸甲酯（FAMEs）的相对丰度。在排序图中，相似性较高的微生物群落会彼此靠近。因此，根据我们的示例数据，玉米样地与未施肥草原样地相距很远，而部分施肥草原样品的微生物群落与玉米样地相似，另一些则与未施肥草原样地相似。微生物群落即使在同一种环境中也常常表现出高度变异性，因此它们并不总能被清晰地分离。观看本视频后，读者应能充分理解如何从土壤中提取微生物细胞膜中的脂质生物标志物。磷脂脂肪酸的提取是一种有效、快速且经济的方法，可通过鉴定独特的微生物生物标志物来评估微生物功能群和总微生物生物量。

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用于表征土壤微生物的脂质提取和分析方法在许多样品的实验中

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