用于表征土壤微生物的脂质提取和分析方法在许多样品的实验中

本视频的目标是描述一种提高通量的方法，同时平衡从微生物细胞膜中提取脂质的工作量和准确性，用于表征总脂质和指示脂质的相对丰度，以确定土壤微生物群落结构和许多样品的研究。在外业中，您应该考虑土壤异质性，以代表您的地点的方式收集土壤样本。为了在采样时保持微生物群落，样品应在冰上从田间运输。

回到实验室后，去除根和石头，并通过粗筛打碎土块。这也有助于使样品均质化。将子样品放入适当的容器中，并尽快冷冻干燥，以准备冷冻干燥。

土壤冻干后，储存在装有干燥剂的密封容器中直至提取。最好将冷冻干燥的土壤储存在 80 度 C.As 准备提取，从储存中取出冻干土壤并研磨。研磨方法包括球磨机、球磨仪或研钵和研杵。

研磨土壤后，再次将土壤样品彻底均质并存放在冰箱中。所有实验室器具必须严格清洁。任何残留的洗涤剂、油脂或污垢都会在最终的 GC 色谱图中显示为峰，从而影响结果。

提取在 30 毫升特氟龙离心管中进行，必须用溶剂冲洗。向试管中加入 2 到 3 毫升己烷，涡旋几秒钟。将己烷倒入另一根试管中并涡旋。

2 到 3 毫升己烷可用于连续冲洗六根试管。将正己烷冲洗管倒置存放在通风橱中，并将用过的己烷丢弃在适当的废液容器中。玻璃器皿可以在使用前立即用溶剂进行消音或冲洗。

消音装置通过在高温下氧化残留物来确保玻璃器皿的清洁。将玻璃器皿包裹在两到三层铝箔中，然后放入马弗炉中。设置为 450 摄氏度，一旦炉子达到设定点，烘烤至少 4 1/2 小时。

在从炉中取出之前，至少需要一小时冷却。标记并称量己烷冲洗的 Teflon 管。将土壤加入 Teflon 离心管中，并重新称重以获得土壤质量。

如果您想验证提取是否正常工作，请始终每批至少制作两个空白，并包括检查标准品，最好是先前提取的土壤。脂质提取。准备三个 5 至 10 mL 的磷酸盐缓冲液、氯仿和甲醇再移液器。

氯仿是一种非常稠密的液体，具有低表面张力。请注意，您分配的量准确且一致。保持瓶子至少装满一半的液体。

在通风橱中，按以下顺序将试剂添加到特氟龙管中的土壤中，磷酸盐缓冲液、氯仿和甲醇。这是首次从样品材料中物理提取脂质。试剂溶液的配方包含在书面方案中。

溶剂比例和添加顺序对于正确分离有机相和水相非常重要。在添加缓冲液后，在添加氯仿之前，让土壤有时间润湿。如果方便，可以将萃取剂合并并作为单个等分试样添加，用于第二次和任何后续萃取。

盖紧 Teflon 管并盖上盖子以避光。将它们水平放在摇床上，确保它们得到很好的固定。速度设置为 high，当小时摇晃。

在摇动试管时，按如下方式为每个样品准备两个长玻璃管。标记试管，加入与添加到土壤中相同体积的氯仿和等体积的磷酸盐缓冲液。从 25 °C 摇床中取出特氟龙管后，以 2， 500 RPM 的转速离心管 10 分钟。

然后，在通风橱中，在关灯的情况下，将上清液从 Teflon 管倒入其中一根长管中。在玻璃管中应可以看到相分离。下层包含有机溶剂（主要是氯仿）和脂质。

重复此提取。将上清液倒入之前制备的第二管中。现在您已经从土壤中物理提取了两次脂质。

对于大多数土壤来说，这已经足够了。用特氟龙内衬盖住所有长级管，并倒置 10 次以混合。通过重力隔夜分离相。

让样品不受干扰地放置过夜，以完成两相的分离。为此，请将样品保存在暗柜中或在室温下用铝箔覆盖。让提取物在周末分离是可以的。

第二天，分离脂质。第二天，吸出水层，并通过在真空蒸发系统中去除溶剂来浓缩脂质。样品也可以放入水浴或沙浴中，然后施加温和的氮气流进行干燥。

试管中的液体现在应该已经很好地分离并且基本透明。如果不是，或者如果两层之间的界面特别厚，请让分离继续一天。在引擎盖中设置真空吸气器。

这是一个侧臂培养瓶，连接到带有叶片 Tygon 管和牧场移液器的真空泵。在泵运行的情况下，使用移液器将水相吸出到培养瓶中。吸出顶层和接口。

这将是大约下降的 2/3。对两到三组玻璃管执行此作。顶层可能包含一些土壤颗粒。

如果可能，请删除这些。小心倾析，将第二组和/或第三组管中的提取物与前两组管中的提取物混合。尝试避免倒入任何固体材料，并通过旋转冲洗管壁。

对每个样品使用干净的移液器，然后对其余样品重复此过程。将氯仿提取物混合并静置几分钟后，检查液体表面。通常会形成一层薄薄的残余水。

如果存在这种情况，请在继续之前吸液。残留的水可能会侵蚀脂肪酸双键，但在样品干燥时，极少量的水应与溶剂共蒸发。使用真空蒸发装置干燥所有样品。

盖紧试管并储存在 80 摄氏度的冰箱中第三天，皂化和甲基化。首先，打开水浴。检查水位，将浴槽 1 设置为 95 °C，将浴槽 2 设置为 80°C.使用重新移液器，向干燥的脂质中加入 1 毫升皂化试剂，即试剂 1。

盖紧盖子，短暂涡旋，然后放在架子上。完成此步骤后，将试管架放入 95 °C 水浴中并等待 5 分钟。从浴槽中取出管架，检查管子是否泄漏。

这将通过气泡像泡沫一样在管中上升来表示。重新拧紧或更换泄漏管的盖子。继续在水浴中加热管子 10 分钟。

将水浴上的温度设置降低到 80 摄氏度，然后继续孵育 15 分钟。取出试管，将试管放入装有自来水的盘中冷却。不要使用冰水。

样品冷却后，向每个样品中加入 2 毫升甲基化试剂 Reagent 2。同样，盖紧盖子并涡旋 5 到 10 秒。颗粒盐可能会在溶液中显示为沉淀剂，这有时是由于试剂过多而发生的。

将架子放入 80 °C 水浴中，孵育 10 分钟。从水浴中取出管架，将其放入一锅自来水中冷却。搅拌机架以加速冷却过程。

使用重新移液器，向每个试管中加入 1 个 1.25 mL 己烷和甲基叔丁基醚（试剂 3）以提取固定相。密封瓶盖，将试管放在摇床上 10 分钟。摇晃后，让试管架静置 10 分钟，使各相分离。

使用牧场移液管将有机相（现在是顶层）转移到短玻璃管中。最好回收大部分液体。非常少量的水相不会影响萃取。

通过添加试剂 3、振荡、让相分离并转移顶部相来重复水相萃取。根据底部阶段的状况，您可以再重复一次，总共进行三次传输。将 3 毫升基础洗涤液 Reagent 4（氢氧化钠的稀溶液）添加到短管中的提取物中。

盖紧试管并涡旋 20 至 30 秒，然后以 2， 000 RPM 离心 3 分钟。离心后，使用干净的牧场移液器吸出顶部有机相并转移到 4 ml 琥珀色小瓶中。要非常小心，不要吸出任何水相。

下一步是在真空蒸发装置中将溶剂蒸发至干燥。第 4 天，制备用于 GC 分析的提取物。使用移液器，将 100 μL 试剂 3 添加到含有干燥相的 4 mL 样品瓶中。

涡旋样品，然后静置 10 分钟。使用第二个移液器，小心地将悬浮的 FAME 转移到 GC 样品瓶中。将另一份溶剂加入 4 mL 样品瓶中，并短暂涡旋。

滚动样品瓶以确保样品瓶壁上残留的 FAME 溶解。再次使用第二个移液器，将溶剂转移至 GC 样品瓶中。向样品瓶中加入第三份溶剂，涡旋并转移至 GC 样品瓶中，完成转移。

盖上 GC 样品瓶并储存在冰箱中。分析前，将密封的 GC 样品瓶储存在冰箱中。GC 分析。

要使用该系统，必须使用特定的 GC 色谱柱进行分析。气相色谱仪配有分体式不分流进样口，配有 4 mm 内径玻璃进样口衬垫和失活的玻璃棉塞。入口设置为 250 摄氏度，并在恒压模式下运行。

载气是氢气。需要氮气和空气作为检测器支持气体。使用 Agilent Ultra 2 色谱柱。

该色谱柱长 25 米，内径为 2 毫米，固定相膜厚度为 33 微米。该色谱柱中的固定相为 5% 苯基、95% 甲基聚硅氧烷，也称为 DB-5 型色谱柱。为了分析脂质提取物，以 100：1 的分流比注入 2 微升等分试样，注射 C.Post 烘箱温度为 170 度，将烘箱编程为以每分钟 5 度的速度升高至 300 摄氏度，然后保持 12 分钟。

对 MIDI 标准进行了一系列注入，并将结果用于根据 MIDI 手册中的说明进行调整。以这种方式校准后，系统有时可能需要进行细微调整，但使用这些参数通常应该可以获得良好的结果。MIDI 系统为每个采样生成一份报告，其中包含一个表格，每个已实现的峰值都有一行。

该软件报告峰保留时间、峰面积、峰鉴定结果，以及 ECL 或估计的链长（用于峰鉴定的参数）和响应因子（用于对保留时间的变化和检测器响应进行归一化的参数）。ECL 表示在一系列直链 FAME 中每个未知 FAME 洗脱的位置。因此，例如，如果未知物的保留时间洗脱时间介于 12 和 13 碳链的保留时间之间，则 ECL 报告为 12.5 碳链。

该软件将每个峰的 ECL 与数据库中 FAME 的 ECL 进行比较，并在出现匹配的地方为未知物分配相应的名称。如果数据库中的两个 FAME 具有非常接近的 ECL，则软件会报告两个名称，并首先列出最接近的名称。报告中的数据表可以整理到电子表格或数据库中。

调整响应因子后，可以将峰面积与外标或内标的峰面积进行比较，以得出提取物的浓度。通过除以提取的土壤质量，数据可以表示为每克土壤的 FAME 质量，或者也可以使用每个 FAME 的分子量表示为每克土壤的纳摩尔。然后可以将生物标志物 FAME 相加以产生微生物公会的生物量，并且可以进一步分析这些公会。

例如，在这里，我们看到未施肥的大草原比施肥的大草原具有更多的 FAME 生物量。这两个地区的生物量都比附近的玉米田多。此外，FAME 与真菌或细菌等特定官能团有关。

这些关联是特定于生态系统的，因此不要过度概括它们很重要。这种类型的分析显示某些群体在某些环境中是否更丰富。在这里，未施肥的大草原上的真菌比玉米田中的真菌更丰富。

最后，查看整体微生物群落组成的另一种方法是使用排序方法（如非度量多维缩放、NMDS 或主成分分析、PCA）同时查看所有 FAME 的相对丰度进行比较。在按立中，更相似的微生物群落将更紧密地联系在一起。因此，从我们的示例数据来看，玉米和未施肥的大草原相距甚远，而一些施肥的大草原样本具有类似于玉米的微生物群落，而另一些则类似于未施肥的大草原。

即使在环境中，微生物群落通常也高度可变，因此它们并不总是整齐地分开。看完这个视频后，应该对从土壤中提取微生物细胞膜脂质生物标志物的过程有很好的了解。磷脂脂肪酸的提取是通过鉴定独特的微生物生物标志物来评估微生物组会和总微生物生物量的一种有效、快速且廉价的方法。