在小鼠模型体内生物发光成像乳腺癌脑转移的肿瘤乏氧动力学

缺氧诱导因子-1α活动的生物发光成像是用于监测在乳腺癌脑转移瘤小鼠模型的颅内肿瘤缺氧发展。

以下实验的总体目标是在小鼠模型中无创评估原位乳腺癌脑转移中的肿瘤缺氧动力学。这是通过使用缺氧报告基因构建体稳定转导乳腺癌 MDA MB 2 31 细胞来实现的。然后使用体外荧光素酶测定来确保缺氧报告基因构建体的成功转染和表达。

接下来进行体内生物发光成像以监测颅内转移肿瘤缺氧的纵向变化。结果显示，基于缺氧报告基因表达模式的生物发光成像，乳腺癌脑转移瘤缺氧的发生和进化。与现有方法（如 EOL 氧电极）相比，该技术的主要优点是该物质是完全无创的，并且允许纵向监测动态变化。

该技术的意义延伸到脑肿瘤的治疗或诊断，因为肿瘤缺氧会降低常规疗法（如放疗）的有效性。因此，检测肿瘤缺氧的程度将有助于设计治疗干预措施。首先培养，MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D荧光素酶细胞，这是一种人转移性乳腺癌细胞系，在补充的DMEM培养基中稳定转染新型HIF one α依赖性reporto基因，用于体外HIF one α生物发光测定板3次10至5 MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D荧光素酶细胞在两个六孔板的每个孔中孵育细胞过夜组织培养箱设置为 37 摄氏度和 5% 二氧化碳，以使细胞附着在培养皿上。

第二天。将六个孔板中的一个放入缺氧室中，以及一个装有 10 至 20 毫升无菌水的培养皿中，以防止培养物的 EVA 畸变。第二个板保留在 21% 氧气的组织培养箱中，用作常氧对照。

将入口管连接到含有 0.1% 氧气、5% 二氧化碳和 94.9% 氮气的气瓶。打开入口和外视端口夹，对缺氧室进行充气，以达到 0.1% 的氧气浓度。断开气源并通过关闭塑料夹密封腔室。

然后将腔室放入组织培养箱中 24 小时。24 小时后，进行生物发光测定，首先从两个 6 孔板中吸出培养基，然后用冰冷的 PBS 快速洗涤细胞两次。然后加入 1 毫升改良的冷 PBS，其中含有 100 微升荧光素，通过发光图像获取，使用曝光时间为 1 30、60 和 180 秒的卡尺 Enogen 光谱。

并在颅内注射当天使用活体成像软件测量每个孔中的生物发光强度，通过胰蛋白酶和离心以 80% 汇合度收获 MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D 荧光素酶细胞。将沉淀重新悬浮在新鲜的培养基中并进行细胞计数。将细胞悬液稀释至终浓度为 10 至 5 个细胞，体积为 4 微升，麻醉后将重悬的细胞置于冰上。

4 至 6 周龄雌性裸鼠，含 3% 氟冰与氧气。在诱导室中，将动物转移到施用 2%isof 氟的鼻锥中以维持麻醉，用 Betadine 溶液擦拭头皮，然后用 70% 酒精擦拭头皮。接下来，使用锋利的手术刀，做一个中线切口，露出颅骨的右半球。

确定冠状缝合线前 1 毫米和矢状缝外侧 2 毫米的点。使用高速钻头钻出一毫米的孔。此时，将 4 微升细胞悬液吸入 10 微升 Hamilton 注射器中。

配有 32 号汉密尔顿针。将 Hamilton 注射器放在颅骨上的孔上。小心地将针尖插入 URA 材料下方 1 毫米处。

达到此深度后，小心地按下注射器的柱塞，将细胞直接注射到右侧通道中。D 凯隆。注射细胞后，等待约 30 秒，然后小心地拔出针头。

用骨头填充钻孔，用可吸收缝合线闭合头皮，并用 70% 酒精对该区域进行消毒。注射第一次丁丙诺啡镇痛。丁丙诺啡镇痛剂每 12 小时给药一次，持续两天。

确保动物已从麻醉剂中完全恢复。然后回到家笼。颅内植入细胞两周后，使用 ivus 光谱系统开始纵向生物发光。

同时用 3% isof、氟和氧麻醉三只小鼠后。在颈背施用每公斤 120 毫克路西法溶液，总体积为 80 微升。注射后，立即将计时器设置为 5 分钟。

将小鼠放入成像室中，并以每分钟 1 立方分米的流速用 1% 异构物、氟和氧气保持麻醉。从萤光针注射时间起经过五分钟后。采集曝光时间为 1、30、60 和 180 秒的生物发光图像。

捕获最终图像后，将动物从腔室中取出并将它们放回家笼中，让它们从麻醉中恢复过来。使用 Living Imaging 软件分析数据，手动绘制感兴趣区域以勾勒出生物发光信号，然后使用每秒绝对光子计数来量化信号的强度。每周重复一次生物发光成像，持续 8 至 10 周。

然后在最后一次生物发光成像后立即施用 piol 缺氧标志物并处死小鼠。一小时后，将整个大脑的包埋物取出，放入最佳切割温度培养基中，并在零下 80 摄氏度的冰箱中冷冻。随后的组织学嵴紫染色和针对荧光素酶缺氧的免疫组织化学染色。

执行标记 OLE 和 H one alpha 以验证成像观察。该图像显示了体外 HIF one α 生物发光测定的代表性结果。右侧的比例尺从下到上显示。

色变化与生物发光增加相关。MDAM 2 3 1 5 HEDD Lucifer 细胞的上部两个孔维持在缺氧条件下。根据本视频文章中描述的程序，绿色表示响应缺氧条件，来自 HIF one α 启动子的荧光素酶报告基因转录增加。

下面的两个孔是在常氧下保持的对照孔，仅发出非常低水平的生物发光。该图像显示了肿瘤缺氧动力学的纵向体内生物发光成像结果。在颅内施用 M-D-A-M-B 2 31 5 H-R-E-O-D-D 荧光素酶细胞后 5 至 10 周每周对同一只动物进行一次成像。

首先观察到来自小鼠大脑右侧的微弱光信号。颅内植入乳腺癌细胞 5 周后，在接下来的 6 周内观察到光学信号增加，表明肿瘤缺氧增加。该图显示了成像六周内光信号定量光子计数的时程曲线。

该图像显示了冷冻小鼠大脑的 10 微米切片，带有乳腺癌免疫染色转移，缺氧标志物 pi Monosol al 缺氧瘤内异质性在这里很明显，与抗荧光素酶抗体的免疫染色切片相同。该叠加图像显示缺氧的瘤内异质性在空间上与荧光素的表达相关。看完这个视频后，你应该对如何应用生物发光成像来根据他们缺氧报告的基因 HRE 外观来监测颅内肿瘤缺氧动态有很好的了解。