低聚活性的体外定量

我们描述了三种实验方法来评估化学物质在体外的低细胞化活性: 1) 细胞酪氨酸酶活性和 2) 黑色素含量的定量, 以及 3) 细胞黑色素染色和图像分析测量黑色素。

该方法有助于开发具有抗黑色致病活动的功能性化妆品和皮肤剂。它是有执行和结果可以迅速获得。此外，这种方法可能有用的研究人员，谁希望确定或调查的影响或化合物或研究抗梅拉诺原或亲源性活动。

测量酪氨酸酶活性，首先在细胞培养箱中24小时以完整培养基箱中，以每24个井板浓度的5倍10至第四细胞播种B16-F10黑色素杀菌剂。第二天，用DMEM更换每井的上能，辅以新鲜准备的测试化合物和抑制剂控制或阴性控制，将板再返回培养箱72小时。在治疗结束时，每口井用300微升的冷 pbs 冲洗油井两次，将盘子放在冰上。

接下来，使用细胞刮刀在五分钟后收集细胞解液，将300微升的解解缓冲液添加到每井中。将产生的细胞颗粒悬浮液转移到单个 1.5 毫升微离心管中。在冰上以14，500转/小时将酸盐均质三次，两秒钟，以释放细胞间酪氨酸酶。

通过离心将细胞碎屑进行分离，将超热剂转移到冰上单个1.5毫升离心管。将每个上清液的 70 微升分配到透明 96 孔聚苯乙烯微板的单个孔中，并将 140 微升的 Tyrosinase 基板溶液添加到每口上清液孔中。轻轻摇动盘子，混合井内。

然后在37摄氏度下孵育板两小时。并在微孔板读卡器上测量 475 纳米的酪氨酸酶活性。测量细胞的黑色素含量后收集处理细胞的 lysate 显示。

通过离心收集酸盐，将中流剂转移到新管中。在每个颗粒中加入300个普通氢氧化钠的300微升，在60摄氏度下孵育一小时。其次是溶解细胞悬浮的离心。

然后将200微升的超糖转移到96井板的每个井中。以 400 纳米波长测量微孔板读取器上的黑色素含量。对于Fondna-Masson染色，用300微升的冷pbs清洗两次经过处理的细胞，用200微升10%的甲醛在4摄氏度下固定一小时。

用蒸馏水冲洗厚细胞，并在每口井中加入200微升58至68摄氏度的氨化银工作溶液。在37摄氏度下孵育一小时，或直到细胞变成黄褐色。用蒸馏水冲洗染色细胞，随后在室温下以0.1%的氯化金孵育两分钟。

用蒸馏水冲洗氯化金处理细胞，向细胞中加入200微升硫化钠溶液。两分钟后再次冲洗细胞。每井用200微升的核快红标记细胞5分钟。

然后在光显微镜下成像之前，先用自来水清洗染色的细胞。对于阈值分析，请打开图像 J 中的图像并选择图像、调整和颜色阈值。要测量沾染丰塔纳马松的区域，请将亮度参数栏设置为零，并调整亮度到包含所有黑色或棕色染色细胞的点。

选择"分析和分析粒子"并选中"分析粒子"窗口中的汇总框，然后单击"确定"以获取结果摘要，然后将数据复制并粘贴到电子表格中。与控制车辆处理的细胞相比，阿布丁治疗显著抑制细胞酪氨酸酶活性。同样，与对控组相比，使用阿布丁刺激的细胞的黑色素含量显著降低。

虽然治疗组之间的细胞在形态上相似，但与对照处理的细胞相比，Arbutin会降低黑色色素的面积。此方法可用于使用我们的复合库进行活动筛选。有数百个样品需要快速测试。

此外，此方法还可用于研究涉及黑色素发生的机制。在生物活性候选化合物被确定后，为研究生物机制或商业应用提供了证据。