体外黑色素减少活性的定量分析

该方法可能有助于开发具有抗黑色素生成活性的功能性化妆品和皮肤制剂。该方法易于操作，且可快速获得结果。此外，该方法可能对希望鉴定或研究化合物的作用，或探究抗黑色素生成或促黑色素生成活性的研究人员有所帮助。

为测定酪氨酸酶活性，首先在24孔板中每孔接种5 × 10⁴个B16-F10黑色素瘤细胞，使用完全培养基，在细胞培养箱中培养24小时。次日，将每孔中的上清液更换为添加了新鲜配制的待测化合物、抑制剂对照或阴性对照的DMEM培养基，然后将培养板放回培养箱继续孵育72小时。处理结束后，用每孔300 µL的冷PBS洗涤孔内细胞两次，并将培养板置于冰上。

静置5分钟后，使用细胞刮将300微升裂解缓冲液加入每个孔中，收集细胞裂解物。将所得的细胞碎片悬液转移至各自的1.5毫升微量离心管中。在冰上以14,500 rpm均质化裂解物，每次2秒，重复三次，以释放细胞内的酪氨酸酶。

通过离心沉淀细胞碎片，并将上清液转移至预冷的1.5毫升离心管中。取每种上清液70微升，分别加入透明的96孔聚苯乙烯微孔板的各个孔中，然后向每孔上清液中加入140微升酪氨酸酶底物溶液。轻轻振荡微孔板以混匀各孔内容物。

然后将培养板在37摄氏度下孵育两小时，并在酶标仪上于475纳米处测定酪氨酸酶活性。在收集经处理细胞的裂解液后，测定细胞中黑色素的含量，方法如上所示。

通过离心收集裂解液，并将上清液转移至新管中。每份沉淀物中加入300微升1 N氢氧化钠，于60摄氏度孵育1小时。随后对溶解的细胞悬液进行离心。

然后将上清液各200微升转移至96孔板的每个孔中，并在微孔板读数仪上以400纳米波长测定黑色素含量。进行Fontana-Masson染色时，用300微升冷PBS洗涤处理后的细胞两次，随后加入200微升10%甲醛，在4摄氏度条件下固定细胞1小时。

用蒸馏水冲洗浓密的细胞，向每个孔中加入 200 微升 58 至 68 摄氏度的氨性硝酸银工作液。在 37 摄氏度下孵育一小时，或直至细胞变为黄褐色。用蒸馏水冲洗染色后的细胞，随后在室温下用 0.1% 氯金酸孵育两分钟。

用蒸馏水冲洗经氯化金处理的细胞，并向细胞中加入 200 微升硫代硫酸钠溶液。两分钟后再次冲洗细胞。每孔加入 200 微升核固红溶液，标记 5 分钟。

然后在光学显微镜下成像前用自来水洗涤染色的细胞。进行阈值分析时，在ImageJ中打开图像，选择图像、调整、颜色阈值。测量Fontana-Masson染色的面积时，将亮度参数条设置为零，并调整亮度至所有黑色或棕色染色细胞均被包含的水平。

选择“分析”→“分析颗粒”，在“分析颗粒”窗口中勾选“汇总”选项，然后点击“确定”以获取结果摘要，并将数据复制粘贴到电子表格中。与对照组溶剂处理的细胞相比，熊果苷处理显著抑制了细胞酪氨酸酶活性。同样，经熊果苷刺激的细胞其黑色素含量也较对照组显著降低。

尽管不同处理组之间的细胞在形态上相似，但与对照组处理的细胞相比，熊果苷减少了黑色色素的面积。该方法适用于利用我们的化合物库进行活性筛选。需要快速测试的样品有数百个以上。

此外，该方法还可用于研究黑色素生成的相关机制。在鉴定出具有生物活性的候选化合物后，可进一步验证其在生物学机制研究或商业应用中的作用。