研究受体与酶之间功能相互作用的共免疫沉淀实验

该方法有助于解答细胞信号传导领域中的关键问题，例如不同蛋白质结构域在受体与酶相互作用及酶活化过程中的重要性。该技术的主要优势在于能够同时检测受体与酶的相互作用及其对酶活性的功能影响。每块培养板使用10毫升添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。

转染前一天，使用血细胞计数板对人胚胎肾293-T细胞进行计数，并将其接种至12个10厘米培养皿中。在37°C、5% CO2条件下培养。待细胞融合度达到80%至90%时，使用基于脂质的转染试剂对其中5个培养皿进行转染。

按照制造商提供的针对贴壁细胞在10厘米培养皿中的转染说明进行转染。随后，同时转染另一组相同的五个培养皿，并额外设置一个未转染的对照培养皿，用于免疫沉淀前目标蛋白表达量的测定。将转染后的培养皿置于37摄氏度、5% CO2的组织培养孵箱中孵育48小时。

使用荧光显微镜观察细胞中GFP的表达，以确认转染已成功进行。将15微升100毫摩尔的原钒酸钠与50微升30%过氧化氢混合，配制新鲜的过钒酸盐混合液。为了磷酸化PD-1的标签蛋白，需从转染了PD-1-GFP的细胞中移除培养基。

每孔加入10毫升普通DMEM和10微升过钒酸盐。室温避光孵育15分钟。随后用5毫升冰冻PBS洗涤细胞三次，每次洗涤使用5毫升PBS。

进行免疫沉淀时，所有步骤均应在冰上或4摄氏度条件下操作。通过将一片蛋白酶抑制剂溶解于10毫升裂解缓冲液中，以补充蛋白酶抑制剂。此外，在用于PD-1-GFP转染平板的缓冲液中，还需添加1毫摩尔的正钒酸钠。

向细胞中加入 500 微升预冷的裂解缓冲液，注意仅将含有正钒酸钠的裂解缓冲液加入转染了 PD-1-GFP 的细胞培养板中。使用细胞刮立即刮下并收集培养板中的细胞。将裂解液转移至 1.5 毫升预冷离心管中，并在 4 摄氏度、0.005 × g 条件下旋转孵育 30 分钟。

为从裂解物中收集去核上清液，在 10,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。将上清液转移至新的离心管中，并弃去沉淀。将六块板的第二组上清液置于冰上保存，用于后续的全细胞裂解液（WCL）分析。

开始制备抗GFP磁珠时，打开瓶盖前请轻轻摇动瓶子，以防止磁珠沉降。每种条件取40 µL抗GFP磁珠悬液。在4°C下以500 × g离心3分钟。

去除上清液以洗涤磁珠，注意尽量减少移液器与磁珠的接触，以防磁珠损失。每份样品用 80 µL 裂解缓冲液重悬磁珠。将洗涤后的磁珠直接加入第一组四块培养板中表达 PD-1-GFP 的细胞裂解液中。

在4°C条件下，以0.005 × g离心30分钟，以免疫沉淀GFP标签蛋白。每次使用1毫升不含正钒酸盐的冷裂解缓冲液洗涤磁珠，共洗涤三次。然后以2,500 × g离心10秒。

将第一组培养板中具有活性的SHP2裂解液均分为三等份，每份加入含有经洗涤的PD-1-GFP珠粒的三个离心管中。将未转染细胞裂解液体积的1/3加入另一管野生型PD-1-GFP珠粒中。弃去剩余的2/3裂解液。

将珠子在4°C下孵育4小时，同时以0.005 × g的转速轻轻旋转。孵育结束后，每次用1毫升冷裂解缓冲液洗涤珠子，共洗涤两次。向每个样品中加入80微升裂解缓冲液，确保每管中的总体积为100微升。

使用剪去尖端的移液枪头，轻轻吹打混匀。然后从每个离心管中转移 50 微升至两个新的 1.5 毫升离心管中。用磷酸酶洗涤缓冲液洗涤磁珠一次。

然后完全移除上清液。向珠子中加入100微升检测缓冲液，在30摄氏度下轻轻振荡孵育30分钟。当缓冲液变为黄色时，加入50微升1摩尔的氢氧化钠溶液以终止反应。

在2,500 × g条件下离心10秒。随后，将上清液转移至96孔板的两个半面积孔中。在405纳米处读取吸光度，并将结果表示为相对于PD-1-GFP野生型对照的相对光密度。

首先在2,000 × g、4°C条件下离心30秒使磁珠沉淀，弃去上清液。加入20 µL的2× Laemmli缓冲液，在95°C下煮沸5分钟。使用BCA试剂盒测定输入对照样品的蛋白浓度。

取30微升最稀释的样品转移至新管中。使用裂解缓冲液将其他输入对照品稀释至与最稀释样品相同的浓度，然后分别取30微升稀释后的各输入对照品转移至新管中。

向裂解液中加入等体积的2倍Laemmli缓冲液，在95°C下煮沸5分钟。随后在4°C条件下以2,000 × g离心30秒，沉淀磁珠，然后按照文本方案进行Western Blot分析。本研究建立了一种结合免疫共沉淀与酶活性检测的方法，用于并行评估受体酶相互作用及其激活状态。

不出所料，当ITSM发生突变时，SHP2无法与PD-1结合。值得注意的是，ITIM的突变体仅在有限程度上抑制了SHP2的结合。然而，SHP2磷酸酶活性实验表明，ITIM和ITSM对于该酶的活性均同样不可或缺。

这揭示了一种两步激活模型：在静息状态下，SHP2 折叠成自抑制构象。当 PD-1 被激活后，SHP2 被招募至磷酸化的 ITSM。然而，ITIM 也必须被磷酸化，才能使 SHP2 解折叠为活性构象。

该技术开发完成后，可为细胞信号传导领域的研究人员探索蛋白结构域在受体-酶相互作用中的功能提供新的途径。