Name: 猪全血表达编码和非编码 rna 类的鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解从猪全血样本中同时提取编码和非编码RNA的优化实验方案。该方法通过珠蛋白去除技术提高RNA测序质量，适用于宿主与病原体相互作用研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作主要由美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究计划（USDA NIFA AFRI）项目2013-67015-21236资助，部分由USDA NIFA AFRI项目2015-67015-23216资助。本研究部分得到了农业研究局科研参与项目的资助，该项目由橡树岭科学与教育研究所（ORISE）通过美国能源部（DOE）与美国农业部之间的跨部门协议管理。ORISE由橡树岭联合大学根据DOE合同编号DE-AC05-06OR2310进行管理。
我们感谢 Kay Faaberg 博士提供高致病性 PRRSV 感染性克隆，感谢 Susan Brockmeier 博士在实验所用动物方面的协助，以及 Sue Ohlendorf 在手稿准备过程中提供的秘书工作支持。

<ol><li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq%3A+challenges+and+strategies+for+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li>
<li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084(2014).</li>
<li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412(2015).</li>
<li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf">ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf</a> (2015).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+%28HP-PRRSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+World+Congress+on+Genetics+Applied+to+Livestock+Production%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).</li>
<li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly%28A%29+RNA+Library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9(2015).</li>
<li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954(2014).</li>
<li>Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf">http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf</a> (2007).</li>
<li>TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina%22">Illumina</a>. , (2018).</li>
<li>New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041(2014).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。
本文提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不构成美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。

该方案得以优化的第一个关键步骤是增加了珠蛋白耗竭步骤，这使得从全血样本中获得高质量的测序读长成为可能。在测序研究中使用全血的最大限制之一是样本中会有大量测序读长比对到珠蛋白分子上，从而减少能比对到其他目标分子上的读长数量。18因此，在优化适用于我们样本类型的实验方案时，需要加入珠蛋白耗竭步骤，以通过测序实现尽可能高的mRNA和非编码RNA捕获效率。所有样本均采用针对猪特异性的血红蛋白A和B（HBA和HBB）寡核苷酸，根据Choi所述方法进行珠蛋白耗竭处理，以消除高水平珠蛋白转录本的影响。 等, 201414另一个关键步骤是使用了核糖体耗竭提取试剂盒，该试剂盒能够去除样本中不需要的RNA分子，同时在文库中保留实验关注的聚腺苷酸化的非编码RNA和病毒RNA分子，用于后续测序19此外，我们通过去除小RNA富集和片段大小选择步骤，能够利用单个样本同时构建编码（mRNA）和非编码（小片段和长片段）RNA文库。通过这一改进，我们最大限度地增加了可用于文库合并的RNA等分量，并确保送测样本的...

下一代测序（NGS）已成为研究生物体基因组水平变化的有力工具。NGS 方法的样品制备可根据生物体种类、组织类型，以及更为重要的研究者希望解决的科学问题而有所不同。许多研究已采用 NGS 来分析不同状态个体（如健康与患病个体）之间基因表达的差异1,2,3,4。测序在全基因组范围内进行，使研究者能够在某一时间点捕获特定遗传标记的全部或绝大部分基因组信息。
最常观察到的表达标志物是信使RNA（mRNAs）。用于制备RNA-seq文库的最常用方法经过优化，通过一系列纯化、片段化和连接步骤来富集mRNA分子5,6。然而，具体实验方案的选择在很大程度上取决于样本类型以及针对该样本所提出的研究问题。在大多数情况下，首先提取总RNA；然而，并非所有RNA分子都是研究关注的对象，在mRNA表达研究等情形中，像核糖体RNA（rRNA）这类丰度过高的RNA种类需要被去除，以提高与mRNA相关转录本的可检测数量。目前最常用且广泛采用的去除高丰度rRNA的方法是去除带有polyA尾的RNA转录本，即所谓的polyA耗竭法7。该方法适用于mRNA表达分析，因为它不会影响mRNA转录本。然而，在关注非编码RNA或病毒RNA的研究中，polyA耗竭法也会同时去除这些分子。
许多研究选择专注于RNA序列文库构建，以检测mRNA表达（编码RNA）或特定类别的小分子或大分子非编码RNA。尽管已有其他类似我们的方法8可实现双样本制备，但在样本充足的情况下，多数研究仍倾向于从独立样本中分别制备文库用于不同分析。对于本研究这类项目，常规方法通常需要采集多个血液样本，从而增加实验耗时、耗材消耗以及动物应激。本研究的目标是利用动物全血，仅凭每头猪单份全血样本（2.5 mL），即可识别并定量分析健康猪与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）攻毒猪之间表达的各类mRNA和非编码RNA9,10。为实现这一目标，我们需要优化常规的RNA提取与文库构建流程，以从单一样本中获得适用于mRNA和非编码RNA（ncRNA）表达分析的高质量数据11。
这促使人们需要一种能够同时进行mRNA和非编码RNA分析的实验方案，因为现有的标准试剂盒和RNA提取及文库构建方法主要针对mRNA，通常包含poly-A富集或去除步骤12。这一步骤将导致无法从样本中回收非编码RNA或病毒转录本。因此，亟需一种优化的方法，能够在不进行poly-A去除的前提下实现总RNA的提取。本文所提出的方法已针对全血样本类型进行了优化，可用于构建适用于大小不同的mRNA和非编码RNA（ncRNA）的测序文库。该方法经过优化，可实现对所有可检测的非编码RNA进行分析，同时保留病毒RNA以供后续研究13。总体而言，我们优化后的文库制备方案使得从单份全血样本中同时研究多种RNA分子成为可能。
采用该方法的总体目标是建立一种能够从一份全血样本中同时收集非编码RNA和mRNA的技术流程。这使得我们能够在研究中为每只动物仅使用一份样本即可获得mRNA、ncRNA以及病毒RNA9。最终，这种方法可在不增加动物使用成本的前提下促进更多科学发现，并更全面地反映每个个体样本的基因表达情况。所描述的方法不仅可用于分析基因表达的调控因子，还支持利用单份全血样本开展mRNA与非编码RNA表达之间的相关性研究。本研究采用该方案检测了9周龄雄性商用猪在病毒感染后基因表达的变化及潜在的表观遗传调控因子。

<table><tbody><tr><td>PAXgene 采血管</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA 提取试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 薄壁管</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 无 RNase/DNase 管</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 孔梯度 PCR 仪</td><td>ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>珠蛋白还原寡核苷酸（&amp;alpha; 1）</td><td>任意供应商</td><td></td><td>序列 GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>珠蛋白还原寡核苷酸（&amp;alpha; 2）</td><td>任意供应商</td><td></td><td>序列 TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td></tr><tr><td>珠蛋白还原寡核苷酸（&amp;beta; 1）</td><td>任意供应商</td><td></td><td>序列 AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td></tr><tr><td>珠蛋白还原寡核苷酸（&amp;beta; 2）</td><td>任意供应商</td><td></td><td>序列 GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td></tr><tr><td>10X 寡核苷酸杂交缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-Tris-HCl，pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>-KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X RNase H 缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;-Tris-HCl，pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;-DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;-MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;-分子生物学级水</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2694</td><td>RNase 抑制剂</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;2100 电泳生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 高灵敏度 DNA&amp;nbsp;试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 链特异性总 RNA 文库构建试剂盒（含 Ribo-Zero&amp;nbsp;）</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>mRNA 试剂盒；人/小鼠/大鼠 Set A&amp;nbsp;（48 个样本，12 个索引）</td></tr><tr><td>TruSeq 链特异性总 RNA 样本制备指南</td><td>Illumina</td><td></td><td>可在线获取</td></tr><tr><td>RNAClean XP 磁珠</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 8 管条</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010580</td><td>0.2 ml 薄壁管</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 8 管条盖</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase/DNase 试剂储液槽</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶</td><td>ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 96 孔板</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>根据需要替代 0.3 mL 板使用</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学密封膜</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext 多重小 RNA 文库构建试剂盒（适用于 Illumina&amp;reg;，Set 1）&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E73005</td><td>小 RNA 试剂盒</td></tr><tr><td>NEBNext 多重小 RNA 文库构建试剂盒（适用于 Illumina&amp;reg;，Set 2）&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E75805</td><td>小 RNA 试剂盒</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96S 超强磁力板</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

猪全血中表达的编码与非编码rna类别鉴定

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

创新且日益强大的新一代测序技术的出现，为研究与特定生物学过程相关的基因表达机制开辟了新的途径。这些技术进步不仅使研究人员能够检测编码细胞功能相关蛋白的mRNA序列的表达，还能检测不翻译为蛋白质但具有调控功能的非编码RNA（ncRNA）分子。尽管研究人员具备同时检测mRNA和ncRNA表达的能力，但传统上大多数研究通常仅聚焦于其中一类。然而，当研究同时关注mRNA和ncRNA表达时，由于文库构建方法的差异，往往需要使用不同的样本分别分析编码RNA和非编码RNA。这可能导致需要更多的样本，从而增加实验时间、耗材成本以及实验动物的应激负担。此外，研究人员可能因此选择仅针对其中一类分子（通常是mRNA）进行建库，从而限制了可探索的生物学问题的数量。然而，ncRNA包含多个具有调控功能的类别，能够影响mRNA的表达。由于ncRNA在基本生物学过程中发挥重要作用，且在感染过程中这些过程的失调与疾病密切相关，因此ncRNA可能成为极具潜力的治疗靶点。本文介绍了一种改进的实验方案，可从单份全血样本中同时构建mRNA和非编码RNA（包括病毒RNA）的表达文库。该方案经过优化，提高了RNA纯度，增强了甲基化RNA的连接效率，并省略了&#160;片段大小筛选步骤，从而能够捕获更多种类的RNA分子。

本研究中的代表性样本为珠蛋白和核糖体RNA耗竭的全血样本。该实验方案的代表性结果为获得珠蛋白耗竭的文库样本，其RNA完整性指数（RIN）高于7。图1a）以及260/280 nm浓度比值达到或高于2（图1b 和 1c）。使用分光光度计对样本结果进行验证，以确定每个文库的最终浓度，同时采用基于芯片的电泳测定RIN值，并生成峰图，显示在文库样本混合与测序前根据插入片段大小所捕获的分子（mRNA或ncRNA）类型。本研究仅关注mRNA和小分子ncRNA。对于mRNA文库，代表性结果为电泳图谱中约280 bp处的峰图1d）。对于小的非编码RNA，代表性结果包括大小约为100-400 bp的多个峰图1e），其中约1...

本文介绍了一种优化的实验方案，可从单份全血样本中制备编码（mRNA）和非编码&#160;（ncRNA）珠蛋白富集的RNA测序文库。

猪全血中表达的编码与非编码RNA类别鉴定

下一代测序技术的不断进步与创新，为深入探究其潜在的……提供了新的途径

该方法可通过检测宿主氨基酸反应中涉及的编码RNA、非编码RNA和病毒RNA的表达，以及病原体如何影响宿主生物学功能，从而帮助解答宿主-病原体相互作用研究中的关键问题。该技术的主要优势在于提供了一种优化方案，可从单份全血样本的珠蛋白减少型RNA测序文库中同时处理mRNA和非编码RNA。本技术将由本实验室的技术员Sarah Anderson进行示范。首先在室温下以 50 20 × g 离心血液样本管 10 分钟。在生物安全柜中操作，移除上清液后，向沉淀中加入 8 毫升无 RNase 水。盖紧管盖，涡旋振荡直至沉淀完全溶解，随后在室温下以 50 20 × g 再次离心 10 分钟，以回收沉淀。在生物安全柜中操作，弃去上清液，保留沉淀。为提取总RNA，首先用移液器向沉淀中加入300微升裂解结合缓冲液。涡旋振荡后，将每管中的混合物转移至新标记的1.5毫升离心管中。加入30 µL miRNA提取试剂盒中的匀浆添加剂。涡旋振荡离心管，然后置于冰上10分钟。在通风橱内操作，将离心管从冰上取出，加入300 µL试剂盒中的酸性酚-氯仿试剂，再次涡旋振荡以充分混匀。在室温下以10,000 × g离心5分钟后，小心地将水相转移至新离心管中。根据上一步获得的水相体积，向每管噬菌体水相中加入1.25倍体积的100%乙醇，并用移液器吹打混匀。为每个样品准备新的收集管，其中装有滤芯。将约 675 微升裂解液-乙醇混合物移液至过滤柱中。在 10,000 ×g 条件下短暂离心，使液体通过滤膜。弃去滤过液。重复将裂解液-乙醇混合物加入滤膜并进行离心，直至完全用尽。向滤柱中加入700 µL试剂盒中的洗涤液一。短暂离心，使溶液通过滤膜。弃去穿滤液，保留相同的滤芯和收集管。向每个滤芯中加入500微升洗涤液二至三。再次离心后，弃去穿滤液，并重复洗涤步骤。为去除滤芯中的残留液体，再额外离心60秒。将滤芯转移至新的收集管中。向每个滤芯的中心加入100 µL预热至95°C的无核酸酶水。将 cartridges 在台式离心机上以最大速度离心约 20 至 30 秒。若需使用珠蛋白还原寡核苷酸进行杂交，首先通过将每个提取的样本加入 0.2 毫升无核酸酶的薄壁反应管中以变性 RNA。将反应管置于热循环仪中，70 摄氏度孵育 2 分钟。随后，立即将离心管置于冰上，以获得最佳的 RNA 质量。在离心管冷却的同时，于一个 2 毫升离心管中配制 400 微升的 10X 珠蛋白还原寡核苷酸混合液和 10X 寡核苷酸杂交缓冲液。为配制杂交混合液，向每个 0.2 毫升薄壁、无核酸酶的反应管中加入 6 微克 RNA 样品、2 微升 10X 珠蛋白还原寡核苷酸混合液、1 微升 10X 寡核苷酸杂交缓冲液，以及无核酸酶水，使最终体积达到 10 微升。将试管置于70摄氏度的PCR仪中2分钟。随后立即将试管置于冰上。进行RNase H消化时，首先用1× RNase H缓冲液将10× RNase H稀释至1× RNase H。通过混合2微升10X RNase缓冲液、1微升RNase抑制剂、2微升1X RNase H以及5微升无核酸酶水，配制总体积为10微升的RNase H反应体系。将10微升RNase H反应体系加入珠蛋白减少杂交样品中，并充分混匀。在37摄氏度下孵育反应10分钟，随后冷却至4摄氏度。向离心管中加入1 µL 0.5 M EDTA以终止消化反应，并将管内全部内容物转移至一个新的1.5 mL离心管中。随后立即向每个管中加入80 µL无RNase的水、350 µL裂解缓冲液，再加入250 µL 100%乙醇，并通过移液充分混匀。将每份700 µL样品转移至分别置于2 mL收集管中的洗脱滤柱中，以收集穿流液。在8,000 × g或更高条件下离心15秒，然后弃去滤过液。将相同的洗脱滤芯放入新的2毫升收集管中。为清洗滤芯膜，向滤芯中加入500 µL温和洗涤缓冲液，在8,000 × g或更高条件下离心15秒。弃去穿流液。然后，使用相同的收集管，向滤芯中加入 500 µL 80% 乙醇。在 8,000 × g 及以上条件下离心 2 分钟。弃去流出液和收集管，保留洗脱离心柱。将每个洗脱离心柱放入一个新的2 mL收集管中。以最大转速离心5分钟，滤筒盖子保持打开，以干燥离心柱膜并防止乙醇残留。弃去收集管后，将每个干燥的滤芯放入新的 1.5 毫升收集管中。向滤芯膜的中心直接加入 14 微升无 RNase 水。为洗脱 RNA，以最大速度离心管子 60 秒，随后继续进行后续的 RNA 检测与制备。 现在可以将珠蛋白耗竭的样本进行分装，用于制备小分子非编码RNA文库，以及核糖体RNA耗竭的mRNA和长链非编码RNA文库。采用本方案对珠蛋白耗竭和核糖体RNA耗竭的全血样本构建表达文库后，电泳文件运行汇总结果显示，珠蛋白耗竭文库样本的RNA完整性数值（RIN）介于6.3至9.2之间。与先前使用珠蛋白耗竭方法的研究相比，该结果有所改进，那些研究获得的RIN值仅达到或接近6。单个猪全血样本在珠蛋白还原前和还原后显示，260至280纳米的浓度比值达到或高于2。采用本方案，获得了全血mRNA文库样本在合并与测序前经珠蛋白去除和核糖体RNA去除处理后的芯片电泳图谱。对于mRNA文库，代表性电泳图谱在约280个碱基对处出现峰值。对于小的非编码RNA，具有代表性的基于芯片的电泳图谱包含约100至400个碱基对范围内的多个峰。约143个碱基对处的峰对应于miRNA，约153个碱基对处的峰对应于piRNA。在进行该操作步骤时，务必记住在标注处立即冰浴离心管。完成此操作后，应进行其他方法，例如下一代测序，以回答更多问题，如差异表达、表观遗传学变化及其对生物通路和生物过程的影响。请注意，使用苯酚-氯仿试剂具有极高危险性，必须采取预防措施，例如在通风橱中操作。此外，在处理全血或传染性生物体时，应在激活传染性生物体之前，在生物安全柜中进行操作。

identification-coding-non-coding-rna-classes-expressed-swine-whole

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

猪全血表达编码和非编码 rna 类的鉴定

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。...

通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

细胞适应应激的能力对其存活至关重要。mRNA 翻译的调控即为一种此类适应策略，可实现对蛋白质组的快速调控。本文提供了一种标准化的多聚体分析流程，用于鉴定在应激条件下被选择性翻译的特定...

通过多聚体图谱分析评估哺乳动物细胞中mRNA的选择性翻译

表观遗传因素可与遗传程序相互作用，从而调控基因表达并调节B细胞功能。通过结合 体外...

全基因组分析 HDAC 抑制剂对诱导 B 细胞发生类别转换 DNA 重组及浆细胞分化过程中 microRNA 和 mRNA 的调控作用

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

纳米孔测序是一种新型技术，可在偏远地区和资源匮乏的环境中实现低成本测序。本文介绍了一种适用于此类条件的全血 mRNA...

使用纳米孔测序技术对全血 mRNA 进行测序

本文介绍了利用RiboTag系统从成年雄性小鼠特定生殖细胞群体中免疫沉淀核糖体及其结合RNA的方法。通过合理的杂交育种和严谨的免疫沉淀操作，可获得纯净且可重复的结果，从而揭示生殖细胞的翻译组特征，并有助于深入理解突变表型的作用机制。...

雄性小鼠生殖细胞中的RiboTag免疫沉淀

本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。...

无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

共翻译相互作用在新生肽链的修饰、定位、折叠和组装过程中起着关键作用。本文介绍了选择性核糖体谱分析法，这是一种用于在模式真核生物Saccharomyces...

通过选择性核糖体谱分析全局鉴定共翻译相互作用网络

核糖体在翻译过程中以每密码子三个核苷酸的规律解码生成肽链。核糖体沿mRNA移动的过程通过核糖体谱型分析（ribosome...

从头合成 利用核糖体谱分析数据鉴定活跃翻译的开放阅读框

绝对定量RNA测序（AQRNA-seq）是一种用于量化生物混合物中所有小RNA分布的技术。本文展示了AQRNA-seq的文库构建和数据处理步骤，用于量化在饥饿诱导的休眠期间Mycobacterium bovis...

AQRNA-seq用于小RNA定量

了解从猪全血样本中同时提取编码和非编码RNA的优化实验方案。该方法通过珠蛋白去除技术提高RNA测序质量，适用于宿主与病原体相互作用研究。

猪全血中表达的编码与非编码RNA类别鉴定

探索更多视频