使用灌胃法在新生小鼠中进行益生菌研究

使用灌胃法对新生小鼠进行益生菌研究。引言：本视频实验方案将详细介绍在出生后第二天对新生小鼠进行益生菌灌胃的操作设置与实验步骤。本方案还详细说明了用于肠道微生物组分析的无菌肠道样本采集方法。

本方案中还包含一些代表性结果，以介绍通过执行本操作流程可获得的数据类型。对出生第二天的新生小鼠进行食管内灌胃。将母鼠的笼子放置在与实验笼相同的通风橱内，实验笼置于加热垫上，加热垫设置为中等温度，约为 38 摄氏度。

从家笼中取出部分筑巢用的垫料，用手套揉搓垫料以将垫料的气味转移到手套上。这样可以减少在操作幼鼠时将外来气味传递给幼鼠，从而降低母鼠因外来气味而遗弃或食仔的风险。

在操作结束后，将幼崽放回它们的原居笼中。制作一个圆锥形的临时巢穴，放入已预热的新且无菌的实验笼内。将所有幼崽从原居笼转移到实验笼中。

将幼崽转移到实验笼中的圆锥形巢穴内。移走母鼠的笼子，并将其放置在远离灌胃区域的位置。这样可以避免母鼠听到幼崽的声音，从而减少母鼠在操作过程中的应激反应。

打开注射器包装以便取用。以无菌方式取出高压灭菌的灌胃喂养针头，并将其连接到注射器头部。针头在高压灭菌前需用70%乙醇和水清洗。

在处理组和对照组之间使用不同的喂养针头，以避免交叉污染。将益生菌染料溶液吸入注射器后，倒置并用手指轻弹以去除气泡，并排空注射器内部的空隙。回拉活塞以清除针头死腔中的液体，然后按压活塞排出空气和气泡。这一步至关重要，可确保不会将空气泡灌胃进入动物体内。

调整注射器至所需体积，对于出生两天的小鼠，灌胃体积不应超过30 µL。针头上可见的黑色标记指示了针头可插入小鼠体内的最大长度。该长度是通过体外测量从吻部至剑突之间的距离而获得的。

将注射器放置在无菌表面上，从实验笼中取出待灌胃的幼鼠，并观察其健康状况。健康状况包括呼吸规律以及皮肤呈粉红色。将幼鼠置于加热垫上的无菌观察垫上。

使用溶解益生菌所用的溶剂润滑饲喂针的外表面。此处使用葡萄糖水，这有助于针头顺利进入动物的食道。用拇指和食指捏住幼崽颈部的皮肤使其固定。

用你的惯用手握住注射器，调整位置，使你能够插入针头并按压推杆，且无需移动手指。将喂食针的球部以45度角插入，直至到达口腔后部。保持针头球部位置不动，同时将手连同针头一起向外旋转；当针头与躯干平行时，针头将开始滑入。

确保不要对注射器施加额外压力，以刺激其运动。吞咽过程会比较缓慢，耐心至关重要。随着幼崽年龄增长，吞咽针头的速度会逐渐变快，操作也会更加容易。

喂食针头已预先标记，以防止球部进入胃内。当标记接近吻部时，停止推进针头，并缓慢注入益生菌溶液。注液完成后，缓慢拔出针头。

将小鼠放置在加热垫上并观察其恢复情况。喘息反射消失，心率上升，健康粉红色的体色重新出现；若45秒后仍存在未消失的喘息反射，则表明灌胃失败，必须对小鼠实施安乐死。灌胃染料应透过浅色皮肤可见，且染料仅应在通常发现乳斑的区域可见。

染料局限于胃内，表明灌胃成功。如果在胸腔或其他非胃腔隙中发现染料，则必须对小鼠实施安乐死，因为这表明灌胃失败。抓握出生两天的小鼠时，仅需施加最小压力。

过度抓握颈部皮肤的迹象可能包括无法呼吸、明显喘息以及长时间伸舌。关于灌胃操作，建议将抓握颈部皮肤的手指背部 resting 在持注射器手的掌心上，这能确保操作过程中幼鼠体位稳定，且针头不会在动物体内移动。在灌胃过程中，针头自身的重量将有助于其滑动，使幼鼠能够自然吞咽针头，而无需施加任何外部压力。

将幼崽放回母鼠笼中，并按照您的监测计划进行后续观察。采集肠道样本用于定植分析。根据动物护理与使用方案中批准的方法，对动物实施人道安乐死。

手术台铺有无菌吸收垫。器械已使用70%乙醇进行消毒，并在250摄氏度下进行了高温灭菌。动物体表使用70%乙醇进行消毒。

使用镊子和剪刀将外部皮肤剪成四个象限，操作时需格外小心，避免划破腹膜。将皮肤向两侧翻折，充分暴露腹膜。使用不同的、新的无菌器械切开腹膜，并在此过程中格外注意，避免损伤内脏器官。

找到幼鼠的胃，并在十二指肠处夹闭。使用两把无菌镊子定位胃部，找到胃的十二指肠端。在胃与十二指肠交界处的交点位置进行夹闭。

使用两把新的无菌镊子分离肠道，用一把镊子夹住十二指肠，同时用另一把镊子剥离任何结缔组织，保持肠道完整。在展开过程中，将肠道放置在覆盖动物的无菌吸水垫上。若在展开过程中不慎撕裂肠道，需标记撕裂部位，以便保持肠道方向的完整性。

在直肠端夹闭，并在两端夹闭处进行切割。将完整的肠道以正确方向置于无菌的标记铝箔上。根据后续分析需要，标记肠道的相应区段。

采用优化的提取方法从这些肠道组织中提取DNA，并通过qPCR分析对益生菌进行定量。DNA可从新鲜肠道组织中提取，也可将肠道组织置于-80°C冰箱中使用冻存盒保存后再提取。代表性结果：植物乳杆菌定植情况，通过每日灌胃和隔日灌胃两种方式。

与每天灌胃的小鼠相比，每隔一天灌胃的小鼠肠道中观察到更高的LP信号。因此，后续实验均采用每隔一天灌胃的方案。植物乳杆菌灌胃小鼠与未灌胃小鼠同笼饲养。

在未处理的小鼠中观察到与灌胃乳酸乳球菌（LP）的小鼠同笼饲养后，LP信号存在变异。LP的定植可能在同窝幼鼠之间传播，因此在后续实验中，不同处理条件需分笼饲养。结论：该方法可用于向新生小鼠精确递送任意液体。

肠道取样可用于通过其他分析方法探究微生物组的变化。本视频旨在为研究人员提供一个平台，利用新生小鼠灌胃模型，以理解早期给予益生菌所观察到效应背后的机制。特别感谢不列颠哥伦比亚大学动物护理服务中心的Kollmann实验室团队，使本研究得以实现。