Name: 新生儿小鼠益生菌的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 了解向新生小鼠灌胃益生菌的标准化操作流程，用于研究肠道微生物组发育与神经科学机制。该方法确保精准给药并减少动物应激，适用于微生物学与动物实验研究。

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感谢不列颠哥伦比亚儿童医院研究所动物护理设施的工作人员和不列颠哥伦比亚大学的兽医团队在小鼠实验方面的培训与协助。感谢不列颠哥伦比亚大学及实验医学系为本研究提供资金支持。

所有操作均遵循不列颠哥伦比亚大学动物护理设施支持人员制定的指南，并且所有操作均经不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会批准。
1. 给予益生菌的定量
注意：建议执行此步骤以确定单次给药可施用的益生菌菌落形成单位（CFU）的确切数量。益生菌的量以及载体（FOS 和麦芽糊精）的量决定了溶液的饱和状态。根据经验，对出生后第2天（DOL 2）的小鼠，施用液体体积不应超过 30 µL（约每公斤体重 20 mL），因为更大的体积会增加误吸风险。
<ol>
	<li>准备六个1.5 mL微量离心管用于系列稀释，每管中加入180 µL无菌5%葡萄糖盐水。</li>
	<li>称取0.2 g益生菌-益生元混合物，以无菌操作方式将其溶解于1 mL 5%葡萄糖盐水中。</li>
	<li>涡旋振荡30秒，并用移液器吹打以破碎团块。重复操作直至无可见团块。 
	注意：麦芽糊精会使溶液黏稠并导致溶液饱和。</li>
	<li>使用步骤1.1中准备的试管进行系列稀释。涡旋振荡以充分混匀。</li>
	<li>将每个稀释度的40 µL样品接种至MRS琼脂平板上标记好的四分之一区域。每个稀释度设两个重复。</li>
	<li>将平板置于真空罐中，使用气体发生包在37 °C下厌氧（或微需氧）条件下培养48小时。</li>
	<li>计数每个平板上每四分之一区域内菌落数在20–70范围内的平板。对相同稀释度的平板计数取平均值，并反推计算至目标单位。</li>
</ol>
2. 灌胃用益生菌和益生元的制备
注意：正确溶解益生菌和益生元是确保灌胃过程中液体能顺利通过喂养针注射的必要条件。
<ol>
	<li>在无菌微量离心管中，将所需量的冻干益生菌与适量的益生元和载体混合。</li>
	<li>加入适量溶剂（5%葡萄糖盐水）以溶解益生菌-益生元混合物。 
	注意：溶解能力受限于所用的益生元和载体。根据经验，使用1 mL溶剂在2 mL微量离心管中溶解时，合生元组合（含FOS和麦芽糊精）的饱和浓度约为0.3 g/mL。</li>
	<li>涡旋振荡至所有固体完全溶解。使用移液器通过反复吹打来分散溶剂中聚集的固体颗粒。</li>
	<li>将溶液置于37 °C水浴中孵育20分钟。 
	注意：如果益生菌-益生元溶液来源于活菌培养物，则可省略此步骤。</li>
	<li>灌胃前，在MRS琼脂平板上进行五次十倍系列稀释，以准确量化给予幼鼠的益生菌数量。若无需精确的CFU计数，此步骤可省略。</li>
</ol>
3. 生物安全柜的准备
<ol>
	<li>使用益生菌时应在生物安全柜内操作，以维持无菌技术。将带有母鼠和幼鼠的鼠盒放置在加热毯的一侧（温度设定为约 38 °C），在加热毯的另一侧放置一个干净且空的动物笼具。</li>
	<li>在加热毯上放置一张已消毒或无菌的吸水垫，用于灌胃操作过程中安置小鼠。</li>
	<li>从原有由母鼠构建的巢穴顶部收集筑巢材料，戴好经 70% 乙醇消毒并干燥的手套，用手捏成一个新的圆锥形巢穴。将此新巢放入干净的暂存笼具中。此操作有助于将巢穴气味转移到手套上，从而在操作幼鼠时尽量减少外来气味的引入，降低母鼠同类相食的风险。</li>
	<li>将幼鼠转移至圆锥形巢穴的暂存笼具中，并将带有母鼠的笼具移出生物安全柜。此举可避免母鼠在操作过程中听到幼鼠的声音，从而减少其应激反应。 
	注意：如果该益生菌已知可定植于小鼠肠道，则不同处理组必须使用独立的笼具，甚至不同的生物安全柜进行隔离，以避免交叉定植的可能性。</li>
</ol>
4. 新生小鼠食管内灌胃
<ol>
	<li>打开注射器包装以便取用。以无菌方式打开针头包装，并将其安装到注射器头部。在操作前，用70%乙醇清洗针头并进行高压灭菌。为避免交叉污染，实验组和对照组应使用不同的针头套装。</li>
	<li>用注射器抽取略多于所需体积的益生菌-染料溶液。将注射器朝上握持，再向后拉动活塞，并用手指轻弹注射器以排除气泡，然后推动活塞排出气泡及多余液体，直至达到所需体积。此步骤可确保针头内无空气残留。对于出生后第2天的小鼠（DOL 2），灌胃体积不得超过30 µL。</li>
	<li>将幼鼠置于加热垫上方的无菌吸水垫上。使用喂食针头（24号，1&#34;针头长度，1.25 mm球端直径）在体外测量食道长度：将针头球端置于剑突（胸骨末端）下方，然后在针头与鼻尖平齐处做标记，以确定针头插入的深度极限（图1）。观察幼鼠健康状况，包括呼吸规律及皮肤呈粉红色。</li>
	<li>将针头尖端浸入浸润溶剂（5%葡萄糖盐水或用于溶解益生菌和益生元的培养基）中，以润滑喂食针头的外表面，有助于针头顺利进入小鼠食道。</li>
	<li>用拇指和食指轻轻抓握幼鼠头部和身体，或捏住其颈背部皮肤将其提起。确保头部、颈部和身体保持直线状态。捏住颈背部皮肤的时间不得超过60秒，以免压迫气管导致窒息。确保幼鼠能够正常呼吸。若捏持过紧，可能出现呼吸困难、明显喘息或舌头伸出嘴外等表现。在整个操作过程中应持续监测幼鼠的肤色和呼吸情况。</li>
	<li>将针头球端以与躯干平面呈45°角的方向插入幼鼠口腔中央，直至到达咽喉后部。</li>
	<li>以针头球端为支点，轻轻调整针头角度，将注射器向操作者相反方向（即幼鼠背侧）移动，直至针头与幼鼠脊柱平面平行。捏住颈背部皮肤有助于固定针头位置，防止幼鼠扭动。在调整角度过程中，确保针头球端不向前推进或对咽喉后壁施加压力。</li>
	<li>若幼鼠试图吞咽针头，允许其在重力作用下自然滑入，当针头上的标记与鼻尖对齐时即停止推进。注射器和针头通常足够重，可依靠重力缓慢下滑。操作时应始终托住针头重量，使其在无外加向下压力的情况下顺利滑入食道。
	<ol>
		<li>若针头在咽喉后部遇到阻力，可轻微回撤灌胃针头，使球端脱离卡阻位置，然后在口腔内缓慢向小鼠左侧（操作者右侧）调整角度，每次移动不超过1 mm。针头应能重新顺利滑入食道。</li>
		<li>若针头在标记到达鼻尖前停止前进，则不得注入液体。</li>
		<li>针头插入时间不得超过20秒。若超过此时间，应缓慢回撤针头，同时保持注射器与躯干平行，让幼鼠在纸巾上休息30秒至1分钟。重新润滑针头外表面后，可再次尝试灌胃。 
		注意：本操作不使用麻醉，因为需要依赖小鼠的反应来判断灌胃是否成功。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当喂食针头上的标记位于鼻尖上方并与鼻尖对齐时，切勿再推进或移动针头。缓慢注入所需体积的液体。若发现液体从鼻腔溢出或出现气泡，应立即停止注射并缓慢回撤针头。
	<ol>
		<li>将幼鼠直立放置在加热垫上的纸巾上，以促进其恢复。密切观察其是否持续存在呼吸困难或肤色改变，这些可能是误吸的征象。一旦确认发生误吸，应立即实施人道安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成灌胃后，沿原插入角度缓慢撤出喂食针头。将幼鼠放回加热垫上的纸巾上，等待10秒，观察其是否恢复正常的活动和呼吸节律。健康的幼鼠体表应呈现均匀粉红色，染料仅在胃部可见。随后将其放回笼中与其他幼鼠一同饲养。 
	注意：使用蓝色食用染料进行灌胃是练习上述操作的极佳方法。若灌胃成功，小鼠胃部将呈现明显的蓝色区域。若在幼鼠体外（如颈部、胸部或腋下区域）发现蓝色染料，则表明可能发生食道破裂或误吸，应依据动物护理规范立即实施人道安乐死。</li>
</ol>
5. 用于定植分析的肠道样本采集
<ol>
	<li>在后续监测或灌胃过程中，从幼崽收集粪便微生物组样本。 
	注意：幼崽在灌胃时常会排尿和排便，可利用此机会收集粪便样本用于微生物组分析。</li>
	<li>实验终止时，在幼崽安乐死后收集从十二指肠至直肠的肠道组织。将幼崽固定于手术板上，用70%乙醇消毒皮肤。使用经70%乙醇及250 °C热珠灭菌器灭菌的工具，将皮肤剪成四个象限，注意勿损伤腹膜层。</li>
	<li>使用另一套无菌工具将腹膜剪成四个象限，并向中心外侧拨开，以暴露内脏器官。</li>
	<li>定位胃部，使用夹子夹住幽门括约肌下方及直肠末端。用钝头工具或镊子沿肠道全长操作，理顺肠道并分离其与结缔组织及肠系膜组织的连接。待整段肠道完全游离后，在夹闭处剪断。</li>
	<li>用铝箔纸标记肠道的方向，妥善包裹后于-80 °C冷冻保存。 
	注意：此时也可不冷冻，直接进行DNA提取。蓝色染料在24小时内可见通过肠道，因此建议在末次灌胃后至少24小时再收集肠道样本，以进行定植分析。若早于该时间点取样，灌胃液中未黏附的 transient 细菌可能导致信号被放大。</li>
</ol>
6. 用于定植分析的肠道 DNA 提取
注意：DNA 提取使用商业试剂盒，并对肠道 DNA 提取方案进行了优化改进。确保加热设备已设定至所需温度，并正确配制需要调整或预热的溶液。
<ol>
	<li>按如下方法制备酶解裂解缓冲液（ELB）：配制含有20 mM Tris-Cl、2 mM EDTA钠盐和1.2% Triton X-100的溶液，调节pH至8.0。在使用ELB前立即加入溶菌酶，使其终浓度为20 mg/mL。</li>
	<li>将去盖的石榴石珠管置于分析天平上预先称重。 
	注意：此步骤的目的是，若称取的样品量超过所需重量，可更方便地去除肠内容物。</li>
	<li>使用无菌一次性解剖刀将肠道切成小段，并将所需肠段舀入已预称重的石榴石珠管中。 
	注意：每次处理不同样品时务必更换解剖刀，因为DNA普遍存在，可能影响PCR结果。</li>
	<li>向每根管中加入1 mL含溶菌酶的ELB（来自步骤6.1），置于涡旋珠磨仪上，以最大转速（14档）运行5分钟。</li>
	<li>组织完全破碎后，将管子转移至37°C水浴中孵育30分钟。 
	注意：此步骤旨在激活溶菌酶，促进革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖的降解。</li>
	<li>为每个样品准备含有20 µL蛋白酶K的离心管，蛋白酶K浓度为600 mAU/mL。</li>
	<li>以400 × g离心10分钟。裂解液应呈透明状，珠子上方可见少量组织残渣。</li>
	<li>将180 µL上清液（上层液体）转移至含蛋白酶K的管中，然后向该管中加入200 µL AL缓冲液，涡旋混匀15秒。</li>
	<li>将管子置于56°C金属浴中孵育10分钟。</li>
	<li>向管中加入200 µL 100%乙醇，涡旋混匀15秒。</li>
	<li>将约600 µL裂解液加入离心柱（试剂盒提供）中。</li>
	<li>以8,000 × g离心1分钟，弃去穿流液。</li>
	<li>重复步骤6.12，直至所有裂解液均通过离心柱。</li>
	<li>将离心柱转移至新的收集管中，加入500 µL AW1缓冲液，以8,000 × g离心1分钟。</li>
	<li>弃去穿流液，加入500 µL AW2缓冲液，以8,000 × g离心3分钟。</li>
	<li>弃去穿流液，将离心柱放入空的收集管中，以8,000 × g离心3分钟。</li>
	<li>将离心柱转移至DNA洗脱管中，直接向膜中央加入60 µL PCR级超纯水，在室温下孵育2分钟。</li>
	<li>使用37°C预热的洗脱水进行洗脱。可通过使用一半最终洗脱体积进行两次洗脱（重复步骤6.15两次）以提高得率。</li>
	<li>以8,000 × g离心1分钟，完成DNA洗脱。</li>
	<li>使用选定的定量方法测定洗脱DNA的浓度。提取产物的DNA得率通常在10–40 ng/µL范围内。</li>
	<li>将洗脱的DNA于-20°C保存。</li>
</ol>
7. qPCR 反应体系的建立
<ol>
	<li>PCR 反应条件
	<ol>
		<li>打开仪器，并将 表 1 中的程序载入实时荧光定量 PCR 仪中。</li>
		<li>按照 表 1 中第 3 至第 5 步循环 40 个周期，反应结束后将样品保持在 4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR 实验设置
	<ol>
		<li>使用 表 2 中列出的引物和温度条件。采用 表 3 中给出的浓度和反应条件。每个反应设三个重复，以控制操作过程中的变异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 PCR 反应管或反应板放入 qPCR 系统中，并运行步骤 7.1 中已载入系统的程序。</li>
	<li>运行结束后取出反应管，置于 4 °C 保存，并准备进行凝胶加样。</li>
</ol>
8. LP 定植的定量分析
<ol>
	<li>根据表3配制适用于10 µL或20 µL反应的qPCR反应液。</li>
	<li>LP基因组DNA标准曲线：107 至101 拷贝/µL 
	注意：由于每种稀释液将点样4 µL，起始储备液中需含有在4 µL中107 拷贝，即2.5 × 106 拷贝/µL。其余标准曲线点依此原则类推。
	<ol>
		<li>配制1:4稀释液：50 µL体系中含107 拷贝/µL。 
		3.147 µL LPDNA + 46.85 µL dH2O = 2.5 × 106 拷贝/µL</li>
		<li>进行10倍系列稀释：取5 µL加入45 µL dH2O，得到1.25 × 105 拷贝/µL。</li>
		<li>每孔每种稀释度点样4 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LP扩增产物的可视化检测
	<ol>
		<li>使用2%琼脂糖凝胶，以实现约197 bp的LP扩增片段的清晰分离。</li>
		<li>每条泳道上样9 µL PCR产物。</li>
		<li>在120 V电压下电泳运行30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

无利益冲突需披露。

灌胃给予益生菌（IE灌胃）的操作流程旨在安全地向新生小鼠给予特定剂量的益生菌。通过使用喂养针将少量液体递送至上消化道，可防止误吸，同时确保剂量准确递送。在灌胃后第2天和第6天采集小鼠肠道样本，用于定植分析。对DNA提取流程进行了优化，以确保获得较高产量的革兰氏阳性益生菌。在末次灌胃后第2天提取DNA进行qPCR分析，结果显示：在出生后第2至8天期间每两天灌胃一次的小鼠，其乳酸乳球菌（LP）的定植水平相对高于每天灌胃的小鼠。此外，在六天内LP的数量有所下降，表明该益生菌在小鼠肠道内为短暂性定植。这些实验结果确立了在此年龄段开展高严谨性研究的实验条件。
为了观察益生菌在新生小鼠中的长期作用，于出生后第2天（DOL 2）开始对新生小鼠进行给药，该时间点与人类临床试验的起始时间相似。文献中已有对新生小鼠进行经口咽喂养的描述，但该方法仅在出生后第5–8天（DOL 5–8）之后实施12,17，因为此时吞咽机制已较为成熟，误吸风险较低。然而，在DOL 2的小鼠中，经口咽喂养并不适用，因为在预实验中观察到较高的误吸发生率（数据未显示）。益生菌与益生元溶液的黏稠性质进一步增加了误吸风险。采用经食管灌胃（IE gavaging）方法可将所需体积的溶液直接送入上消化道，同时显著降低DOL 2小鼠的误吸风险。该操作的成功性首先通过添加食用染料的益生菌灌胃进行验证。食用染料可作为标记物，透过幼鼠皮肤清晰可见。在使用食用染料进行灌胃的小鼠中未观察到任何不良反应，因此建议在开展大规模实验前，以此方式验证灌胃操作的准确性。灌胃后呼吸急促反射的快速缓解也可作为操作成功的另一指标。灌胃完成后，将小鼠置于加热垫上，呼吸急促反射通常在20秒内消退，并伴随呼吸频率的增加。若呼吸急促反射持续超过30秒，则提示灌胃失败。成功的灌胃还依赖于饲喂针头的正确插入，确保针头球部位于胃贲门括约肌开口正上方。为实现这一点，可在灌胃过程中确保针头上的刻度（对应剑突至鼻尖的距离）不超过小鼠鼻尖，从而最大限度地减少对小鼠的损伤风险。灌胃频率可能对实验结果产生显著影响。频繁灌胃会因持续干扰笼具和巢穴而给幼鼠及其母鼠带来额外应激。最理想的灌胃方案是在不削弱预期生物学效应的前提下，尽可能减少灌胃次数并缩短操作持续时间。为确保操作的安全性和无菌性，灌胃针头在每次使用后必须通过清洗和高压灭菌进行消毒。高压灭菌前，需使用刷子彻底清洗针头外部，并用注射器将水强力冲过针头内部，以清除残留颗粒，否则这些颗粒可能在高压灭菌过程中在针头表面形成结痂，进而干扰后续的灌胃操作。
每隔一天灌胃的小鼠幼崽中，LP 定植水平高于每天灌胃的小鼠幼崽。这可能是由于每隔一天灌胃减轻了幼崽的应激反应，同时这些幼崽摄入的乳汁相对较多，可能为益生菌提供了更多的营养物质。益生菌治疗的剂量依赖性已在小鼠模型中被先前研究报道18,19，因此正确剂量的给药至关重要。每次灌胃前均对制备的益生菌溶液进行平板培养，以准确测定所给予的 CFU 数量。如果益生菌为厌氧菌，则需注意在有氧和无氧条件下培养时 CFU 是否存在差异。由于 LP 属于兼性厌氧菌，本研究采用两种方法进行培养，结果未观察到 CFU 存在差异。
采用qPCR和高质量DNA样本对灌胃后肠道固有层（LP）的菌载量进行了分析。为尽量减少处理组与对照组之间LP DNA的交叉污染，使用了不同的饲喂针头、生物安全柜和手术器械，以确保获得最高质量的样本。准确测定肠道内益生菌含量需要优化DNA提取方法。目前从粪便中提取DNA的最有效方法通常包括多次珠磨步骤20,21,22。本研究采用珠磨法提取肠道细菌DNA，但发现该方法在全肠道DNA提取物中LP的检出量较低（&#60;102 拷贝被回收）。由于LP为革兰氏阳性菌，其细胞壁含有大量肽聚糖，因此在酶解裂解缓冲液中加入溶菌酶以溶解肽聚糖，对提取方案进行了优化23,24。该改进使同一肠道样本中LP的检出量提高了两倍以上。溶菌酶处理可有效溶解细胞外层结构，而珠磨步骤则促进微生物细胞的裂解。为获得适用于PCR分析的最佳DNA产物，必须对组织用量、石英砂珠类型以及珠磨破碎时间等参数进行优化。
近期研究表明，益生菌作为早产儿和足月新生儿的预防或治疗手段具有积极影响25,26,27,28。建立合适的新生小鼠益生菌模型，有助于深入解析益生菌的保护作用。本文所述方案为不熟悉新生小鼠益生菌实验的研究人员提供了操作指南。尽管在研究人类健康与疾病时，啮齿类动物的微生物群存在一定的局限性，但该方法仍可拓展应用于探究益生菌引起微生物组变化的相关研究。此外，该模型还为研究宿主-微生物相互作用以及不同发育阶段的免疫应答提供了平台。

在婴儿中，早期益生菌暴露与免疫调节作用相关，可降低坏死性小肠结肠炎、特应性皮炎和败血症等疾病的发病率1,2,3,4,5。然而，由于新生儿人体试验中采样受限（例如连续采血和组织活检），探索这种免疫调节反应背后的机制具有挑战性。新生小鼠模型有助于研究与益生菌使用及肠道微生物群变化相关的新生儿免疫调节作用机制。遗憾的是，目前大多数益生菌的小鼠模型主要集中于成年小鼠；然而，益生菌的影响可能在生命早期最为显著，因此针对这一年龄段建立特异性模型将具有重要意义3,6。此外，新生小鼠模型更适合研究拟用于人类婴儿生命早期的疾病和干预措施，因为其更接近模拟发育中的免疫系统和微生物系统7,8,9,10。本研究旨在探讨益生菌在新生小鼠体内的定植程度和定植模式，重点关注宿主与其微生物组之间的机制性相互作用。文献中未见合适的新生模型描述，因此有必要建立一种稳健且标准化的方法。
向新生小鼠口服给予各种化合物的既定方法包括：通过处理怀孕母鼠的饮用水，使目标化合物经乳汁传递给幼鼠11，或使用喂养针将目标化合物直接注入幼鼠的口咽部12。这些方法适用于对剂量要求不精确、且受体小鼠能够顺利摄入处理物的实验。益生菌通常需与低聚半乳糖和低聚果糖（FOS）等益生元联合使用，后者可为益生菌提供营养来源；然而，这些添加成分会使溶液变得黏稠，难以通过上述方法进行给药。因此，有必要建立一种可在出生后第一天（DOL）即开始精确给予新生小鼠益生菌和益生元的方法。在开发灌胃技术的过程中，我们检验了益生菌在处理组与对照组之间可能发生的定植扩散现象（此前其他益生菌研究中曾观察到此类现象13,14,15,16），并评估了不同灌胃时间表下幼鼠肠道内定植的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）的相对丰度。实验中使用的益生菌制剂包含每剂量109菌落形成单位（CFU）的LP（ATCC-202195菌株），并与FOS（益生元）和麦芽糊精（辅料）混合，配制方式参照近期一项人体临床试验3。益生菌通过IE灌胃法递送，具体操作流程如下所述。通过使用针对LP的特异性引物对从小鼠完整肠道提取的DNA进行实时扩增，评估益生菌的肠道定植情况。

<table><tbody><tr><td>1 mL 带滑动接头的结核菌素注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1.2% Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>2 mM 柠檬酸钠 EDTA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>20 mM Tris&amp;middot;Cl&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>5% 葡萄糖和 0.9% NaCl 注射液</td><td>Baxter Corp.</td><td>JB1064</td><td></td></tr><tr><td>Alphaimager</td><td>Alpha Innotech</td><td>N/A</td><td>凝胶成像系统</td></tr><tr><td>厌氧罐</td><td>Millipore-Sigma</td><td>28029-1EA-F</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>BD GasPak EZ 厌氧容器系统小袋</td><td>BD</td><td>260678</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Difco 植物乳杆菌 MRS 肉汤</td><td>BD</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>Disruptor Genie</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-D236</td><td></td></tr><tr><td>新生小鼠和大鼠饲喂/口服灌胃针&amp;nbsp;</td><td>Cadence Science Inc.</td><td>01-290-1</td><td>24 号针头，1&amp;rdquo; 针长，1.25 mm 球端直径</td></tr><tr><td>低聚果糖</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F8052</td><td>&amp;nbsp;来自菊苣</td></tr><tr><td>0.70 mm 石榴石珠管&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>13123-50</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>植物乳杆菌 (Orla-Jensen) Bergey 等&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>BAA-793</td><td>用于 qPCR 标准曲线</td></tr><tr><td>冻干益生菌</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89833</td><td></td></tr><tr><td>麦芽糊精</td><td>Millipore-Sigma</td><td>419672&amp;nbsp;</td><td>葡萄糖当量 4.0–7.0</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>BioRad</td><td>1704406</td><td>凝胶电泳槽</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp 血液和组织试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51504</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr></tbody></table>

使用灌胃法在新生小鼠中进行益生菌研究

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

成年小鼠模型已被广泛用于研究人类疾病进展的机制。然而，成年小鼠模型在新生儿疾病研究中的适用性有限。为了更好地理解新生儿中疾病的发展过程、宿主反应以及干预措施的长期影响，新生小鼠模型可能是更合适的选择。新生小鼠模型应用较少，部分原因在于操作这些体型微小动物所面临的技术困难。本研究建立了一种新生小鼠模型，用于确定生命早期给予益生菌的影响，并特别评估益生菌在新生小鼠肠道中定植的能力。具体而言，为评估益生菌在新生小鼠体内的定植情况，将Lactobacillus plantarum (LP) 直接递送至新生小鼠的胃肠道。为此，通过经食管（IE）灌胃法将LP喂饲给小鼠。本研究开发了一种高度可重复的方法，以标准化IE灌胃操作流程，能够在最小化创伤的同时精确给予益生菌剂量，这一点在新生小鼠极为脆弱的情况下尤为重要。该操作的局限性包括可能引起食管刺激或损伤，以及错误灌胃导致误吸的风险。本方法相较于现有实践有所改进，因为将液体灌入食管远端可降低误吸的可能性。灌胃后，通过使用针对LP的特异性引物对提取的肠道DNA进行定量聚合酶链式反应（qPCR），追踪益生菌的定植情况。此外，采用不同的同窝设置和笼具管理技术，评估益生菌定植扩散的潜在可能性。本实验方案详细描述了新生小鼠IE灌胃操作的复杂步骤以及后续使用LP进行定植定量的分析流程。

该方法的独特之处在于其将灌胃技术针对新生小鼠的体型和脆弱性进行了适应性改进。前文已描述了对出生后第2天（DOL 2）小鼠成功实施灌胃操作的关键步骤。为建立良好的定量标准，使用纯乳酸菌（LP）DNA 进行三份技术重复实验，绘制出标准曲线（图2）。该标准曲线确定了使用引物检测LP DNA的动态范围，其动态范围为7至28个循环，可检测到101至107拷贝的LP DNA。标准曲线稳定的斜率反映了该反应的扩增效率和可扩展性。
IE灌胃操作在成年小鼠中已相对容易地得到应用。然而，新生小鼠的上消化道较为脆弱，在操作过程中需要精确控制灌胃针的移动。反复灌胃可能增加食管内刺激、损伤的风险，并因操作干扰而引起母鼠排斥幼鼠。因此，本研究测试了两种不同的灌胃方案，并利用整个肠道匀浆提取的DNA定量分析肠道定植情况。小鼠从出生后第2天（DOL 2）至第8天（DOL 8）接受每日一次或每两天一次的益生菌灌胃处理（图3）。每个样本包含一个技术重复，每种条件至少有两个生物学重复。每日灌胃7次的幼鼠肠道中约有103拷贝的LP，而每两天灌胃一次、共4次的幼鼠肠道中约有105拷贝。重复样本间结果的一致性进一步证明了该技术的精确性。与每日灌胃的幼鼠相比，每两天灌胃一次的幼鼠肠道中检测到更多的LP。基于此，后续实验采用每隔一天灌胃一次的方案，该方案还可减少对幼鼠的应激刺激。
在使用益生菌时，必须避免同窝幼鼠之间的益生菌交叉污染。由于同窝幼鼠共享相同的母体和巢穴环境，其微生物组预期较为相似。如果在同一窝幼鼠中同时设置处理组和对照组，这将对益生菌研究造成问题，因为益生菌有可能成为微生物群的一部分（“定植扩散”）。为确定益生菌是否会污染并定植于未经处理的同窝幼鼠，实验中对一窝幼鼠中的一半按前述方法进行灌胃，随后收集肠道组织进行qPCR检测。对出生第10天（DOL 10）小鼠的肠道qPCR分析显示，灌胃小鼠中可检测到预期的LP DNA扩增信号，而在未灌胃的同窝幼鼠中也检测到较弱程度的扩增信号（图4）。来自未经处理笼具中相同DOL小鼠的肠道样本则未见扩增，或仅在超过32个循环后出现极微弱扩增。该结果证明了在同一笼具内的同窝幼鼠之间存在微生物组的共用现象。因此，在进行益生菌实验时，应将处理组分置于不同笼具中饲养，以控制因交叉污染导致的实验变异性。若实验需在同窝设置中开展，可考虑使用代孕母鼠，但应评估并优化由此可能带来的混杂因素，例如代孕母鼠护理减少或幼鼠被排斥等问题。当对持续灌胃至出生第8天（DOL 8）的小鼠停止处理并继续饲养六天后，在出生第14天（DOL 14）检测其肠道DNA，发现约存在10个拷贝的LP（图5）。因此，LP的定植表现为短暂性，其可检测到的种群数量随时间推移而减少。
<img alt="啮齿类动物解剖过程；解剖方法；实验室操作分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1．测量剑突（胸骨下端）与吻部之间的长度，以确定针头最大插入深度的标记位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="标准曲线图，LP DNA 定量，平均 Ct 值与 DNA 拷贝数的关系，线性回归分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图 2．使用 LP 引物和 ATCC LP DNA 建立的标准曲线。 对 ATCC LP DNA 进行系列稀释，以确定本研究中所用引物的动态可检测范围。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SYBR 法检测中显示循环阈值（Ct 值）的 qPCR 扩增曲线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3。对出生后第 2 天至第 8 天期间每天定时灌胃（7 次剂量）或隔天灌胃（4 次剂量）的出生后第 10 天幼鼠肠道 DNA 进行乳酸菌（LP）扩增。 隔天灌胃组的肠道乳酸菌水平高于每天灌胃组。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同条件下的Ct值、扩增曲线和基因表达分析的SYBR qPCR图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4。对出生后第10天（DOL 10）的幼鼠肠道DNA进行LP扩增，每窝4只幼鼠中有2只接受处理，2只未接受处理。灌胃处理在出生后第2天至第8天之间进行，每天定时灌胃一次（共7次剂量）。 两只接受益生菌处理的幼鼠显示出预期的扩增曲线。未处理的幼鼠则表现出LP的可变性扩增，表明益生菌微生物在同窝幼鼠之间存在共用现象。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SYBR qPCR 扩增曲线图、Ct 值、荧光强度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5。对出生后第 2 天至第 8 天期间每天定时灌胃（7 次剂量）或隔天灌胃（4 次剂量）的出生后第 14 天幼鼠肠道 DNA 进行 LP 扩增。 LP 载量在第 28 个循环以下，表明在最后一次益生菌灌胃后的 6 天内 LP 已被清除。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>步骤</td>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>50 °C</td>
			<td>2 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>3 分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>58 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 秒</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. qPCR扩增条件。 PCR反应的温度和循环次数条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶标</td>
			<td>16S-23S 基因间间隔区</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>预期片段大小</td>
			<td>144 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>引物退火温度（Tm）</td>
			<td>58˚C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正向引物（FP）</td>
			<td>Lpn-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反向引物（RP）</td>
			<td>Lpn-2: TGT TCT CGG TTT CAT TAT GAA AAA ATA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. qPCR反应组分的详细信息。 有关引物、引物退火温度以及PCR反应中预期片段大小的详细信息。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>浓度</td>
			<td>10 µL 反应体系</td>
			<td>20 µL 反应体系</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板 DNA</td>
			<td>200 pg/µL</td>
			<td>1 µL</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Master Mix</td>
			<td>-</td>
			<td>5 µL</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FP</td>
			<td>10 µM</td>
			<td>0.3 µL</td>
			<td>0.6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RP</td>
			<td>10 µM</td>
			<td>0.3 µL</td>
			<td>0.6 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>3.4 µL</td>
			<td>8.8 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 每次反应的体积和浓度。 反应中试剂的浓度和体积。

本研究详细阐述了向新生小鼠灌胃精确剂量益生菌的操作过程。实验方案经过优化，包括但不限于益生菌给药、给药方法以及肠道内细菌的定量分析。

成年小鼠模型已被广泛用于理解人类疾病进展背后的机制。在成年动物中开展的研究具有较高的适用性……

使用灌胃法对新生小鼠进行益生菌研究。引言：本视频实验方案将详细介绍在出生后第二天对新生小鼠进行益生菌灌胃的操作设置与实验步骤。本方案还详细说明了用于肠道微生物组分析的无菌肠道样本采集方法。本方案中还包含一些代表性结果，以介绍通过执行本操作流程可获得的数据类型。对出生第二天的新生小鼠进行食管内灌胃。将母鼠的笼子放置在与实验笼相同的通风橱内，实验笼置于加热垫上，加热垫设置为中等温度，约为 38 摄氏度。从家笼中取出部分筑巢用的垫料，用手套揉搓垫料以将垫料的气味转移到手套上。这样可以减少在操作幼鼠时将外来气味传递给幼鼠，从而降低母鼠因外来气味而遗弃或食仔的风险。在操作结束后，将幼崽放回它们的原居笼中。制作一个圆锥形的临时巢穴，放入已预热的新且无菌的实验笼内。将所有幼崽从原居笼转移到实验笼中。将幼崽转移到实验笼中的圆锥形巢穴内。移走母鼠的笼子，并将其放置在远离灌胃区域的位置。这样可以避免母鼠听到幼崽的声音，从而减少母鼠在操作过程中的应激反应。打开注射器包装以便取用。以无菌方式取出高压灭菌的灌胃喂养针头，并将其连接到注射器头部。针头在高压灭菌前需用70%乙醇和水清洗。在处理组和对照组之间使用不同的喂养针头，以避免交叉污染。将益生菌染料溶液吸入注射器后，倒置并用手指轻弹以去除气泡，并排空注射器内部的空隙。回拉活塞以清除针头死腔中的液体，然后按压活塞排出空气和气泡。这一步至关重要，可确保不会将空气泡灌胃进入动物体内。调整注射器至所需体积，对于出生两天的小鼠，灌胃体积不应超过30 µL。针头上可见的黑色标记指示了针头可插入小鼠体内的最大长度。该长度是通过体外测量从吻部至剑突之间的距离而获得的。将注射器放置在无菌表面上，从实验笼中取出待灌胃的幼鼠，并观察其健康状况。健康状况包括呼吸规律以及皮肤呈粉红色。将幼鼠置于加热垫上的无菌观察垫上。使用溶解益生菌所用的溶剂润滑饲喂针的外表面。此处使用葡萄糖水，这有助于针头顺利进入动物的食道。用拇指和食指捏住幼崽颈部的皮肤使其固定。用你的惯用手握住注射器，调整位置，使你能够插入针头并按压推杆，且无需移动手指。将喂食针的球部以45度角插入，直至到达口腔后部。保持针头球部位置不动，同时将手连同针头一起向外旋转；当针头与躯干平行时，针头将开始滑入。确保不要对注射器施加额外压力，以刺激其运动。吞咽过程会比较缓慢，耐心至关重要。随着幼崽年龄增长，吞咽针头的速度会逐渐变快，操作也会更加容易。喂食针头已预先标记，以防止球部进入胃内。当标记接近吻部时，停止推进针头，并缓慢注入益生菌溶液。注液完成后，缓慢拔出针头。将小鼠放置在加热垫上并观察其恢复情况。喘息反射消失，心率上升，健康粉红色的体色重新出现；若45秒后仍存在未消失的喘息反射，则表明灌胃失败，必须对小鼠实施安乐死。灌胃染料应透过浅色皮肤可见，且染料仅应在通常发现乳斑的区域可见。染料局限于胃内，表明灌胃成功。如果在胸腔或其他非胃腔隙中发现染料，则必须对小鼠实施安乐死，因为这表明灌胃失败。抓握出生两天的小鼠时，仅需施加最小压力。过度抓握颈部皮肤的迹象可能包括无法呼吸、明显喘息以及长时间伸舌。关于灌胃操作，建议将抓握颈部皮肤的手指背部 resting 在持注射器手的掌心上，这能确保操作过程中幼鼠体位稳定，且针头不会在动物体内移动。在灌胃过程中，针头自身的重量将有助于其滑动，使幼鼠能够自然吞咽针头，而无需施加任何外部压力。将幼崽放回母鼠笼中，并按照您的监测计划进行后续观察。采集肠道样本用于定植分析。根据动物护理与使用方案中批准的方法，对动物实施人道安乐死。手术台铺有无菌吸收垫。器械已使用70%乙醇进行消毒，并在250摄氏度下进行了高温灭菌。动物体表使用70%乙醇进行消毒。使用镊子和剪刀将外部皮肤剪成四个象限，操作时需格外小心，避免划破腹膜。将皮肤向两侧翻折，充分暴露腹膜。使用不同的、新的无菌器械切开腹膜，并在此过程中格外注意，避免损伤内脏器官。找到幼鼠的胃，并在十二指肠处夹闭。使用两把无菌镊子定位胃部，找到胃的十二指肠端。在胃与十二指肠交界处的交点位置进行夹闭。使用两把新的无菌镊子分离肠道，用一把镊子夹住十二指肠，同时用另一把镊子剥离任何结缔组织，保持肠道完整。在展开过程中，将肠道放置在覆盖动物的无菌吸水垫上。若在展开过程中不慎撕裂肠道，需标记撕裂部位，以便保持肠道方向的完整性。在直肠端夹闭，并在两端夹闭处进行切割。将完整的肠道以正确方向置于无菌的标记铝箔上。根据后续分析需要，标记肠道的相应区段。采用优化的提取方法从这些肠道组织中提取DNA，并通过qPCR分析对益生菌进行定量。DNA可从新鲜肠道组织中提取，也可将肠道组织置于-80°C冰箱中使用冻存盒保存后再提取。代表性结果：植物乳杆菌定植情况，通过每日灌胃和隔日灌胃两种方式。与每天灌胃的小鼠相比，每隔一天灌胃的小鼠肠道中观察到更高的LP信号。因此，后续实验均采用每隔一天灌胃的方案。植物乳杆菌灌胃小鼠与未灌胃小鼠同笼饲养。在未处理的小鼠中观察到与灌胃乳酸乳球菌（LP）的小鼠同笼饲养后，LP信号存在变异。LP的定植可能在同窝幼鼠之间传播，因此在后续实验中，不同处理条件需分笼饲养。结论：该方法可用于向新生小鼠精确递送任意液体。肠道取样可用于通过其他分析方法探究微生物组的变化。本视频旨在为研究人员提供一个平台，利用新生小鼠灌胃模型，以理解早期给予益生菌所观察到效应背后的机制。特别感谢不列颠哥伦比亚大学动物护理服务中心的Kollmann实验室团队，使本研究得以实现。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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使用灌胃法在新生小鼠中进行益生菌研究

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