在在线 MRI 图像的指导下,对流增强将视遗传阿德诺相关病毒载体输送到 Rhesus Macaque 的皮质

非人类灵长类动物的光遗传病毒载体对流增强传递，或CED，将使研究人员能够大规模地操纵神经活动，以了解复杂的神经计算和行为。通过 CED，与传统方法相比，我们可以在短时间内只需几次注射，就可以在灵长类大脑的大面积区域实现高光遗传学表达。磁共振或 MR 兼容腔室植入是在非人类灵长类手术中采用标准做法进行的，该过程在文本协议中进行了详细描述，并在本视频中进行了简要概述。

按照文本协议中描述的动物解毒、定位和初始切口，创建圆形颅骨切除术，以覆盖使用颤管进行注射的预谋轨迹。在计划颅骨切除术的中心创建一个缩进，在头骨中足够深，使用骨管的可调中心点锚定颤量。中心完成后，将骨质利降低到头骨上，顺时针和逆时针旋转颤刺，同时施加向下压力，直到骨盖用钳子去除。

解除文本协议中详述的 dura 后，将杜拉从中心切到颅骨切除术的边缘，然后继续沿着边缘使用精细的眼科剪刀。将圆柱形定制对流增强型输送 MR 兼容室安装到颅骨切除术顶部的头骨上，在输液过程中提供管管支撑，使室法兰的曲率与头骨的曲率保持良好。使用塑料螺钉和牙科丙烯酸或几个钛螺丝将植入物固定到头骨上。

在植入 MR 兼容腔室并将管状注射网格插入腔室后不久，请用 0.9% 盐水填充栅格，通过 MR 解剖图像可视化注射位置。还要用湿的无菌可吸收凝胶泡沫填充腔腔，以保持大脑的水分。用无菌抗菌不育窗帘覆盖皮肤和气缸，以保持气瓶在运输和 MR 输液期间的无菌性。

放置维生素 E 胶囊，以标记注射网格的顶部，进行阳性识别。当动物保持插管时，将气管管从麻醉回路中分离出来，重新连接到便携式 MR 兼容异氟烃的机器上。将动物运送到 MRI 扫描仪。

获取 T1 图像以计算与喷射网格顶部和皮质表面之间的距离。维生素E胶囊在T1图像中清晰可见，应用作注射网格顶部的标记。获取 T2 图像，根据输液目标站点确定每个站点的最佳管内导轨。

管网网格中充满了盐水，在 T2 图像中最好可见。使用 MR 成像软件，滚动扫描日冕和下垂平面，以找到输注的目标位置。在室温下解冻病毒载体数小时后，通过移液器或涡流混合将病毒载体与 MR 对比剂 gadoteridol 混合。

将混合病毒加载到0.2毫升高压IV管中。使用高压 IV 管，将长延长线连接到 MR 兼容的三毫升注射器，并采用盐水素。将长延长管的另一端连接到装有病毒的 0.2 毫升 IV 管。

然后，使用夹紧式导管连接器将具有 1 毫升阶梯尖的反流管连接到该组件的端端。最后将注射器放在 MR 兼容泵中。使用获得的基线解剖 MR 图像，选择到达目标输液部位所需的注射网格位置和插入深度。

使用无菌胶带标记管上的插入深度。以每分钟一微升的速度开始输液，通过观察从管尖排出的液体，直观地验证输液管中的液体流动。通过注射网格手动将管插入到目标深度，同时保持输液管中的流量，因为这样可以防止穿透的组织在插入过程中堵塞管。

现在获取快速闪存T1加权图像，用于在线监测病毒载体输液。注入大约 10 微升的载体后，使足够的病毒注入 MR 扫描仪中检测，获取 MR 图像以验证正确的管株放置，这从观察到的病毒传播中可见一斑。如果插入的管有的深度不正确，请相应地调整深度或慢慢移除管，然后重新尝试插入。

通过在线 MR 图像的指导监控输液。将输液率提高至每分钟五微升，每分钟增加一微升，每分钟一微升。重要的是要慢慢增加输液率，不要超过每分钟五微升，因为高输液率可能会导致组织损伤。

注入约40微升病毒载体后，开始将输液率降低每分钟1微升。注射约50微升后停止输液。将管在原位放置十分钟。

慢慢从大脑取出管，然后移动到下一个位置。在动物运输前，在注射结束时用无菌窗帘盖住气缸，然后将动物运回手术室。对连续冠状体部分的组织学分析揭示了输液点周围的大规模光遗传学表达。

此处显示的是基线日冕 MR 图像和在同一 MR 日冕切片输液后对比剂的传播。冠状组织部分显示的大致相同。过氧化物酶染色反映了黄色荧光蛋白或EYFP记者的表达。

EYFP 表达区域之间，使用表面荧光和组织染色测量，观察到良好的对齐。其中包括从 MR 图像估计的矢量分布区域。白点表示注射部位，整个黑色区域表示颅骨切除术暴露的区域。

此处显示的是染有抗 GFP 抗体的日冕部分的低放大图像，显示了躯体感觉皮层中 YFP 表达的中侧侧向。黑色箭头指示管杆轨道的位置。相邻组织以更大的放大率显示，以显示 YFP 正细胞的层层分布。

YFP正细胞的密集填充区域主要位于第二层到三层和五层到六层。进一步放大揭示了第二层到三层、第五层和第六层中典型的金字塔细胞。在流量停止后，将管管留在原位 10 分钟非常重要。

这将确保病毒已经渗透到周围的靶向神经组织中。CED 是一种有效的方法，可跨哺乳动物的大型大脑区域实现均匀的高表达水平。它有可能扩大我们对神经回路和连通性的理解。

在CED进行病毒转导后，随后的光遗传学刺激实验可以与电记录和行为论文配对，揭示大脑中复杂的电路动力学。Yazdan-Shahmorad 及其同事在 2018 年曾采用此种技术，其中光遗传学神经调制用于诱导感觉运动皮层中的网络广泛连接变化。