Name: 在在线 MRI 图像的指导下,对流增强将视遗传阿德诺相关病毒载体输送到 Rhesus Macaque 的皮质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习磁共振引导对流增强递送技术，用于在猕猴大脑皮层中高效输送光遗传病毒载体，实现大规模神经活动调控。该方法结合实时MRI监测，可快速获得广泛的光遗传表达，助力神经环路研究。

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本工作得到了美国心脏协会博士后奖学金（AY）、国防高级研究计划局（DARPA）损伤恢复加速重组与可塑性项目（REPAIR；N66001-10-C-2010）、R01.NS073940 以及加州大学旧金山分校神经科学影像中心的支持。本工作还得到了尤妮斯·肯尼迪·施赖弗国家儿童健康与人类发展研究所的支持 &amp;美国国立卫生研究院人类发展研究所（资助号：K12HD073945）、华盛顿国家灵长类研究中心（WaNPCR，P51 OD010425）以及神经技术中心（CNT，美国国家科学基金会工程研究中心，资助号：EEC-1028725）提供支持。我们感谢 Camilo Diaz-Botia、Tim Hanson、Viktor Kharazia、Daniel Silversmith、Karen J. MacLeod、Juliana Milani 和 Blakely Andrews 在实验方面提供的帮助，感谢 Nan Tian、Jiwei He、Peter Ledochowitsch、Michel Maharbiz 和 Toni Haun 提供的技术支持。

所有操作均经加州大学旧金山分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，符合《实验动物照护与使用指南》的要求。以下操作使用两只成年雄性猕猴进行，年龄分别为8岁和7岁，体重分别为17.5 kg和16.5 kg（猴G和猴J）。
注意：所有外科手术均需采用标准的无菌技术。
1. 基线成像
<ol>
	<li>对动物进行镇静和插管，并在异氟烷（根据呼吸频率、心率等生命体征需要，浓度在0%至5%之间调整）下维持全身麻醉。监测动物的体温、心率、血氧饱和度、心电图反应以及呼气末二氧化碳分压2 在整个过程中。</li>
	<li>将动物置于磁共振兼容的立体定位仪中（参见 材料表) 并在整个操作过程中保持此状态。将动物连接至便携式磁共振兼容的异氟烷麻醉机，并运送至磁共振成像扫描仪（3 T）。</li>
	<li>获取标准T1加权像（翻转角 = 9°，重复时间/回波时间 = 668.6，矩阵大小 = 192 × 192 × 80，层厚 = 1 mm）和T2加权像（翻转角 = 130°，重复时间/回波时间 = 52.5，矩阵大小 = 256 × 256 × 45，层厚 = 1 mm）解剖MRI图像，作为基线参考及手术规划依据。</li>
	<li>将动物从麻醉状态中复苏，并转移至动物饲养区域。</li>
	<li>利用获取的T1和T2图像确定开颅位置。通过将MR图像中的目标皮层区域与猕猴脑图谱（Paxinos, Huang, Petride, Toga）进行比对，可精确定位开颅区域。nd 版）。此外，这些基线图像还可用于估计病毒注射的位置。本文展示的兴趣皮层区域为M1和S1。</li>
</ol>
2. 磁共振兼容腔室植入
<ol>
	<li>使动物镇静并进行气管插管，采用与1.1节相同的标准麻醉监护维持全身麻醉。</li>
	<li>将动物置于磁共振兼容的立体定位仪中，并在整个脑室植入和病毒载体递送过程中保持该位置。将动物连接至便携式磁共振兼容的异氟烷麻醉机。</li>
	<li>用手术刀在距中线约2 cm处做一条长约5 cm的矢状切口。</li>
	<li>使用骨膜剥离器去除颅骨下方的软组织（参见 材料表).</li>
	<li>使用环钻创建一个直径为2.5 cm的环形颅骨开窗，以覆盖预先规划的注射路径（参见 材料表).
	<ol>
		<li>将环钻的定心点降至环钻边缘以下。在计划开颅的位置中心，在颅骨上制作一个足够深的凹痕，以利用环钻的可调节定心点固定环钻。操作时需谨慎，避免完全穿透颅骨厚度，以免损伤下方的神经组织。</li>
		<li>根据需要定期用生理盐水冲洗术区，以在整个开颅过程中保持组织湿润。</li>
		<li>中心定位完成后，将环钻下压至颅骨，同时施加向下的压力，顺时针和逆时针交替旋转环钻，直至骨瓣可用镊子取出。操作时需谨慎，避免环钻损伤下方组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细缝合线（6-0 规格）穿入&#160;在颅骨开窗的中心位置提起硬脑膜，通过轻柔地从脑表面牵拉缝线，使硬脑膜在颅骨开窗中央形成帐篷状隆起。</li>
	<li>接下来，使用精细的眼科剪在帐篷状结构中心附近刺穿硬脑膜，注意避免损伤脑组织。然后从中心向颅骨开孔边缘剪开硬脑膜，并继续沿开孔边缘用精细眼科剪进行剪切。</li>
	<li>安装圆柱形自制CED MR兼容腔室（图1；有关制备说明，参见第4节）固定于颅骨开颅部位上方，以在CED输注期间为套管提供支撑，确保腔室法兰的曲率与颅骨曲率良好贴合。</li>
	<li>使用塑料螺钉和牙科丙烯酸树脂或少量钛螺钉将植入物固定在颅骨上。</li>
</ol>
3. 病毒载体递送
<ol>
	<li>植入磁共振兼容腔室并将套管注射网格（图 1A-B，补充图 1）插入腔室后，立即用生理盐水（0.9% NaCl）填充网格，以便通过磁共振解剖图像观察注射位置，并用湿润的无菌可吸收明胶填充腔室空隙，以保持脑组织湿润（图 1F）。</li>
	<li>用无菌抗菌切口巾覆盖皮肤和圆筒，以在运输和磁共振输注期间维持圆筒的无菌状态。放置一粒维生素E胶囊以标记注射网格的顶部，便于正确定位。</li>
	<li>动物保持插管状态下，将气管插管从麻醉回路断开，并重新连接至便携式磁共振兼容异氟烷麻醉机，随后将动物转运至磁共振成像扫描仪。</li>
	<li>采集T1加权图像（翻转角 = 9°，重复时间/回波时间 = 668.6，矩阵大小 = 192 × 192，层厚 = 1 mm，共80层），用于计算注射网格顶部与皮层表面之间的距离。维生素E胶囊在T1图像中清晰可见，应作为注射网格顶部的标记（图 2A）。使用磁共振成像软件中的标尺工具测量注射网格顶部与皮层表面之间的距离。</li>
	<li>采集T2加权图像（翻转角 = 130°，重复时间/回波时间 = 52.5，矩阵大小 = 256 × 256，层厚 = 1 mm，共45层），根据目标输注部位确定每个位点的最佳套管引导位置（图 2B-C）。如前所述，套管网格已填充生理盐水，在T2图像中显示效果最佳。使用磁共振成像软件，浏览冠状面和矢状面图像，以定位目标输注区域。</li>
	<li>将病毒载体在室温下解冻数小时后，用移液器或涡旋混合器将病毒载体与磁共振对比剂钆特醇（比例为250:1；2 mM Gd-DTPA，参见材料表）混合。 
	注意：本方法已针对携带CamKIIa启动子驱动C1V1与EYFP融合蛋白表达的AAV载体进行测试（AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP，滴度：2.5 × 1012 病毒分子/mL；参见材料表）。</li>
	<li>将混合后的病毒溶液装入0.2 mL高压静脉输液管（参见材料表）。</li>
	<li>在磁共振扫描仪外部建立无菌操作区域，用于准备病毒输注管路。</li>
	<li>使用高压静脉输液管，将一根长延长管（约3–5米，长度取决于输液泵相对于磁共振孔的位置）连接至磁共振兼容的3 mL注射器，并用生理盐水预充管路。</li>
	<li>将长延长管的远端连接至装有病毒的0.2 mL静脉输液管近端，并使用夹式导管连接器（参见材料表）将带1 mm阶梯尖端的防反流套管（图 2D；套管制备方法见第5节）连接至该组件的远端（图 2E）。</li>
	<li>最后，将注射器安装至磁共振兼容泵（参见材料表），并将泵控制器置于扫描室控制室内，因其不具备磁共振兼容性。</li>
	<li>利用此前获取的基线解剖磁共振图像，选择达到目标输注位点所需的套管注射网格位置及插入深度，并使用无菌胶带在套管上标记插入深度。</li>
	<li>以1 μL/min的速率开始输注，并通过观察套管尖端液体喷出情况，目视验证输注管路中的液体流动。</li>
	<li>在维持输注流动的同时，手动将套管穿过注射网格插入至目标深度，此举可防止穿刺组织在插入过程中堵塞套管。</li>
	<li>采集快速（2分钟）FLASH T1加权图像（翻转角 = 30°，重复时间/回波时间 = 3.05，矩阵大小 = 128 × 128，层厚 = 1 mm，共64层），用于在线监测病毒载体的输注过程。</li>
	<li>当输注约10 μL载体，确保已有足够病毒量可在磁共振扫描中检测到时，获取磁共振图像以验证套管位置是否正确，表现为病毒扩散范围清晰可见。若插入套管深度不正确，应相应调整深度，或缓慢撤出套管并按照步骤3.12重新尝试插入。</li>
	<li>通过在线磁共振图像（FLASH T1加权）引导监测输注过程，并每隔几分钟以1 μL/min的幅度逐步将输注速率提高至5 µL/min（图 3A）。</li>
	<li>当病毒载体输注量达到约40 μL后，开始以1 μL/min的幅度逐步降低输注速率，在总注射量达约50 μL时停止输注，并保持套管原位留置10分钟。</li>
	<li>缓慢将套管从脑组织中撤出，然后转移至下一个目标位置。对每个位置重复执行步骤3.9至3.19&#160;。</li>
	<li>注射完成后，在动物转运前用无菌巾覆盖圆筒，随后将动物转运回手术室。</li>
	<li>可选择取出磁共振兼容腔室，并采用标准无菌技术将骨瓣和覆盖肌肉复位，缝合皮肤；或更换为钛合金圆筒和人工硬脑膜（参见Yazdan-Shahmorad等，20169），用于后续神经记录与刺激。</li>
</ol>
4. 磁共振兼容腔室的制备
<ol>
	<li>根据指定尺寸加工制造尼龙套管注射网格（图1A-B）（参见补充图1）。</li>
	<li>使用丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS0）塑料通过3D打印技术制作磁共振兼容圆筒（图1C-E）（参见补充文件1–3；3D打印机及材料信息见材料表）。 
	注意：一种设计将套管注射网格固定于磁共振兼容圆筒内部（图1C），另一种设计则允许网格旋转，从而扩展注射区域（图1D-E）。</li>
	<li>对套管注射网格进行螺纹加工，并对磁共振兼容腔体的相应空腔进行攻丝，使两个部件具有相同的螺纹规格。 
	注意：可采用任意类型的螺纹，只要两个组件的螺纹匹配即可。</li>
	<li>通过将尼龙套管注射网格旋入磁共振兼容圆筒的攻丝孔中完成安装。</li>
</ol>
5. 耐反流导管的制备13
<ol>
	<li>使用剃刀切割一段长30 cm、内径0.32 mm、外径0.43 mm的石英管，作为内层石英管（见材料表）。</li>
	<li>切割一段长7.5 cm和一段长5 cm、内径0.45 mm、外径0.76 mm的石英管，作为外层石英管（见材料表）。</li>
	<li>用氰基丙烯酸酯将7.5 cm长的外层管粘接到30 cm长的内层管上，使内层管比外层管多伸出1 mm，形成耐回流台阶结构（图2D）。为防止氰基丙烯酸酯进入内层管内部，应将胶水涂在内层管外壁远离套管尖端的位置。</li>
	<li>将5 cm长的石英管粘接到内层管的另一端，用于连接夹式导管接头（见步骤3.10）。</li>
</ol>

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</ol>

PNS 对 Neuralink Corp. 拥有财务利益，这是一家正在利用脑刺激开发临床疗法的公司。

本文介绍了一种通过磁共振引导下的对流增强输送（CED）在非人灵长类动物（NHP）初级体感皮层和运动皮层中实现大规模光遗传学表达的可行且高效的技术。与传统的病毒载体脑内输注方法相比，磁共振引导的CED具有显著优势。其中一项优势是能够通过较少的输注次数实现大范围的表达。例如，传统方法中，每次注射1–2 µL载体，通常只能在直径2–3 mm的区域内实现表达1,2,5,17。尽管此前已有尝试通过多次注射实现较大范围的载体扩散，获得约10 mm3的表达体积18，但本文提出的方法仅需少数几次输注即可实现超过200 mm3的表达体积。&#160;通过CED单次注射50 µL，可在皮层CED中实现载体从注射点扩散至最远10 mm的范围9，而在丘脑CED中可实现对...

光遗传学是一种强大的工具，可用于调控神经活动并研究大脑中的神经网络连接。近年来，尽管光遗传学技术已在非人灵长类动物（NHP）中成功应用1,2,3,4,5,6,7，但在这些动物的大脑广泛区域实现高水平的基因表达仍是研究人员面临的一项挑战。本文提出一种高效且简化的技术方案，可在猕猴大脑皮层的大范围区域内实现高水平的光遗传学表达。该方法结合先进的记录技术8,9和光学刺激技术10，有望显著提升当前在这些动物中开展的光遗传学研究水平。
对流增强递送（Convection enhanced delivery, CED）是一种已确立的将药理学制剂及其他大分子（包括病毒载体）递送至中枢神经系统的递送方法。11,12,13与传统的给药方法（通过脑内多个小区域进行多次低体积输注）不同，对流增强型输送（CED）能够以更少的输注次数实现更广泛且更均匀的药物分布。在输注过程中，由压力驱动的容积性液体流动（对流）可促进病毒载体在靶组织中更广泛且更均匀地转导。在近期的研究中，我们证实了利用CED可实现对初级运动皮层（M1）和体感皮层（S1）大范围区域的有效转导及后续的光遗传学表达。9 和丘脑14 使用磁共振（MR）引导的CED。
本文概述了利用CED技术，仅通过少数几次皮层注射即可实现大面积皮层区域光遗传学表达的方法。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 高压静脉输液管</td><td>Smiths Medical Inc.，美国俄亥俄州都柏林</td><td>533640</td><td></td></tr><tr><td>内径0.32 mm、外径0.43 mm的石英毛细管</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>内径0.45 mm、外径0.76 mm的石英毛细管</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>宾夕法尼亚大学宾夕法尼亚载体中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABS塑料</td><td>美国明尼苏达州斯特拉塔西斯公司</td><td>ABSplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>抗菌切口巾</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>Ioban 无菌铺巾</td></tr><tr><td>牙科丙烯酸树脂</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td>1013117</td><td>丙烯酸粘合剂</td></tr><tr><td>电梯</td><td>VWR International, LLC</td><td>10196-564</td><td>朗根贝克拉钩，宽头</td></tr><tr><td>细缝合线</td><td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td>1034505</td><td></td></tr><tr><td>钆特醇</td><td>Prohance，Bracco 诊断公司，美国新泽西州普林斯顿</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>用于光刺激的激光器</td><td>Omicron-Laserage，德国</td><td>PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>磁共振兼容的3 cc注射器</td><td>哈佛仪器公司，霍利斯顿，马萨诸塞州，美国</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>磁共振成像软件</td><td>Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>磁共振兼容泵</td><td>Harvard apparatus，Holliston，MA，USA</td><td>哈佛大学博士，2000年</td><td></td></tr><tr><td>磁共振兼容立体定位仪</td><td>KOPF</td><td>1430M MRI</td><td></td></tr><tr><td>Perifix 夹式导管连接器</td><td>B-Braun，美国宾夕法尼亚州伯利恒</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>塑料螺钉</td><td>塑料 1</td><td>0-80 × 1/8N</td><td>尼龙螺丝</td></tr><tr><td>钛螺钉</td><td>Crist Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>自攻型骨螺钉</td></tr><tr><td>骨髓穿刺活检针</td><td>GerMedUSA 公司</td><td>SKU：GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>uPrinter SE 3D 打印机</td><td>美国明尼苏达州斯特拉塔西斯公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>维生素E胶囊</td><td>Pure Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>湿的无菌可吸收明胶</td><td>辉瑞公司</td><td>AZL0009034201</td><td>明胶海绵</td></tr></tbody></table>

在在线磁共振成像引导下向恒河猴大脑皮层进行对流增强递送光遗传学腺相关病毒载体

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

在非人灵长类动物（NHP）光遗传学研究中，利用病毒载体感染大面积皮层通常是一项困难且耗时的任务。本文中，我们展示了在磁共振（MR）引导下，通过对流增强递送（CED）技术将光遗传病毒载体递送至猕猴的初级体感皮层（S1）和初级运动皮层（M1），从而实现光敏感离子通道在皮层中高效且广泛表达的方法。在磁共振引导的CED下，将编码红移视蛋白C1V1与黄色荧光蛋白（EYFP）融合的腺相关病毒（AAV）载体注射至恒河猴皮层。灌注三个月后，表层荧光成像证实，在两只猕猴的M1和S1区域均存在大范围的光遗传表达（&#62;130 mm2）。此外，我们利用微电皮层记录阵列成功记录到来自表达区域的可靠光诱发电生理反应。后续组织学分析及针对报告基因的免疫染色显示，M1和S1区域存在广泛且密集的光遗传表达，其分布与表层荧光成像结果一致。该技术使我们能够在较短时间内以最小损伤实现皮层大范围的基因表达，相较于传统方法更具优势，是大型动物（如NHP）中光遗传病毒递送的一种理想策略。该方法在进化上接近人类的动物模型中，展现出以细胞类型特异性方式进行神经环路网络水平操控的巨大潜力。&#160;

在 MRI 引导下的对流增强递送（CED）
在在线磁共振成像的引导下，监测病毒载体在CED输注过程中的扩散情况（图3A）。在本研究中，针对了两只猴子的S1和M1区（图3B）。在对 MR 图像进行的事后分析中估算了三维分布容积（图3C如 Yazdan-Shahmorad 等人 2016 年所述9，证实了大脑皮层大范围区域的覆盖。由于时间限制，猴子G的M1注射未在磁共振（MR）引导下进行。
病毒表达的验证
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本文展示了一种利用磁共振（MR）引导对流增强递送（CED）将病毒载体注入猕猴大脑皮层的方法，该方法可高效、简便地实现光遗传学表达在大脑皮层大范围区域的分布。

在非人灵长类动物（NHP）光遗传学研究中，利用病毒载体感染大面积皮层区域通常是一项困难且耗时的任务。本文中，我们……

在非人灵长类动物中通过对流增强递送（CED）导入光遗传病毒载体，将使研究人员能够大规模操控神经活动，以理解复杂的神经计算和行为。与传统方法相比，使用 CED 可在短时间内通过少数几次注射，实现灵长类动物大脑大范围区域内的高效光遗传表达。磁共振（MR）兼容腔室的植入采用非人灵长类手术中的标准操作流程，该操作在文本方案中有详细描述，并在本视频中简要概述。在按照文本方案完成动物镇静、体位固定和初步切口后，使用环钻创建一个圆形颅骨开窗，以覆盖预设的注射路径。在计划开窗区域的中心位置，在颅骨上刻出一个足够深的凹痕，以便利用环钻的可调节中心定位点固定环钻。完成中心定位后，将环钻 lowered 放置到颅骨上，并在施加向下压力的同时顺时针和逆时针交替旋转环钻，直至骨瓣可用镊子取出。按照文本方案所述抬起硬脑膜后，使用精细的眼科剪刀从颅骨开窗的中心向边缘剪开硬脑膜，并继续沿边缘剪切。将圆柱形自制对流增强给药磁共振兼容腔室固定于颅骨开窗上方的颅骨上，以在输注过程中为导管提供支撑，确保腔室法兰的曲率与颅骨曲率良好贴合。使用塑料螺钉和牙科丙烯酸树脂或少量钛螺钉将植入物固定在颅骨上。在植入磁共振兼容腔室并将套管注射网格插入腔室后不久，用0.9%生理盐水填充网格，以便通过磁共振解剖图像观察注射位置。同时，用湿润的无菌可吸收明胶海绵填充腔室空隙，以保持脑组织的湿润。用无菌抗菌切口巾覆盖皮肤和圆筒，以在运输和磁共振灌注期间维持腔室的无菌状态。放置一粒维生素E胶囊以标记注射网格的顶部，便于正确定位。在动物仍处于插管状态时，将气管插管从麻醉回路断开，并重新连接至便携式磁共振兼容的异氟烷麻醉机。将动物转运至磁共振成像（MRI）扫描仪。采集T1图像以计算注射网格顶部与皮层表面之间的距离。维生素E胶囊在T1图像中清晰可见，应作为注射网格顶部的标记。采集T2图像，根据目标灌注部位确定每个位点的最佳套管引导针位置。导管网格中充满生理盐水，在T2加权图像中最为清晰可见。使用MR成像软件，逐层浏览冠状面和矢状面，以确定灌注的目标位置。将病毒载体在室温下解冻数小时后，用移液器或涡旋混匀的方式将病毒载体与MR对比剂钆特醇混合。将混合病毒加入0.2毫升高压静脉输液管中。使用高压静脉输液管，将一根长延长管连接至与磁共振兼容的3毫升注射器，并用生理盐水预冲。将长延长管的另一端连接至装有病毒的0.2毫升静脉输液管。然后使用夹式导管连接器将带有1毫升分级尖端的耐回流套管连接到该组件的远端。最后将注射器置于与磁共振兼容的泵中。根据获得的基线解剖磁共振图像，选择套管注射网格位置及插入深度，以到达目标灌注部位。使用无菌胶带在套管上标记插入深度。以每分钟1微升的速率开始输注，并通过观察套管尖端液体的喷出情况，目视验证输注管路中液体的流动。在保持输注管路液体流动的同时，手动将套管穿过注射网格插入至目标深度，此举可防止穿刺组织在插入过程中堵塞套管。现在获取快速闪光T1加权图像，以在线监测病毒载体的灌注情况。在灌注约10微升载体后，确保注入足够的病毒以便在磁共振扫描仪中检测到信号，随后获取磁共振图像，通过观察病毒扩散情况来验证导管位置是否正确。如果插入导管的深度不正确，应相应调整深度，或缓慢撤出导管并重新尝试插入。通过在线磁共振图像引导监测输注过程。每隔几分钟以每分钟1微升的幅度逐步将输注速率增加至每分钟5微升。重要的是，输注速率应缓慢增加，且不得超过每分钟5微升，因为过高的输注速率可能导致组织损伤。注入约 40 微升病毒载体后，开始以每分钟 1 微升的幅度逐步降低输注速率。当注入量达到约 50 微升时，停止输注。留置套管针 10 分钟。缓慢将套管从脑组织中取出，然后移至下一个注射位点。在动物转运前，注射结束后用无菌敷料覆盖套管套筒，并将动物送回手术室。对连续冠状切片进行组织学分析，显示在灌注位点周围存在大范围的光遗传学表达。此处显示的是基线冠状面磁共振图像以及在同一磁共振冠状面切片上灌注后对比剂的扩散情况。还展示了一个大致相同位置的冠状面组织切片。过氧化物酶染色反映了黄色荧光蛋白（EYFP）报告基因的表达。通过表面落射荧光和组织学染色检测到的EYFP表达区域之间显示出良好的一致性，这些区域也包括根据MR图像估算的载体扩散范围。白点表示注射位点，整个黑色区域代表开颅手术暴露的范围。图中显示的是用抗GFP抗体染色的冠状切片低倍镜图像，展示了体感皮层中YFP表达的内侧-外侧分布情况。黑色箭头指示导管穿过的轨迹位置。相邻组织以更高倍数放大显示，以展示YFP阳性细胞的层状分布。YFP阳性细胞密集分布的区域主要位于第二至第三层以及第五至第六层。进一步放大可见第二至第三层、第五层和第六层中典型的锥体细胞。在灌注停止后，须将套管保留在原位10分钟。这将确保病毒已渗透到周围的靶向神经组织中。对流增强输送（CED）是一种在哺乳动物大脑大范围区域内实现均匀高表达水平的有效方法。该技术有望拓展我们对神经环路及连接性的理解。通过CED进行病毒转导后，可将后续的光遗传学刺激实验与电生理记录和行为学实验相结合，以揭示大脑内复杂的神经环路动态。该技术此前已被Yazdan-Shahmorad及其同事于2018年应用于研究，其中利用光遗传学神经调控诱导了感觉运动皮层中全网络范围的连接性改变。

convection-enhanced-delivery-optogenetic-adeno-associated-viral

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在在线 MRI 图像的指导下,对流增强将视遗传阿德诺相关病毒载体输送到 Rhesus Macaque 的皮质

本文介绍了在视觉皮层中通过颅内注射腺相关病毒（AAV）载体对神经元和胶质细胞进行荧光标记的方法。...

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一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

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目前在非人灵长类动物中实施的光遗传学技术需要向大脑内注射病毒载体。理想的注射方法应具有可靠性，并且对于许多应用而言，能够靶向任意深度的单个位点，且这些位点可在死后组织学分析中被清晰、明确地识别。本文介绍了一种具备上述特性的注射方法。...

在麻醉及清醒非人灵长类动物脑内进行光遗传学AAV载体注射

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

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通过蛛网膜下腔注射 AAV2 实现小鼠新皮层神经元的广泛转导

本方案提供了一种整合性方法，包括病毒递送、光探针植入、光血栓诱导、星形胶质细胞与神经元活动的同步记录，以及星形胶质细胞的光遗传学刺激。该整合性方法旨在对缺血性脑卒中从急性期到慢性期各个阶段的星形胶质细胞-神经元相互关系进行同步研究。...

一种用于光栓法脑卒中建模的整合方法 在体 内 行为小鼠中神经元和星形胶质细胞活动的光探针记录

本文描述了一种在监测脑电图、肌电图和脑乳酸浓度的同时，利用光遗传学方法调控大脑皮层锥体神经元活性的实验方案。实验记录在带有电缆束缚的小鼠上进行，小鼠处于自然的睡眠/觉醒周期过程中。光遗传学设备由本实验室自行组装，记录设备为 commercially...

同步进行啮齿类动物大脑皮层的脑电图记录、乳酸浓度实时测量与光遗传学神经元活动操控

学习磁共振引导对流增强递送技术，用于在猕猴大脑皮层中高效输送光遗传病毒载体，实现大规模神经活动调控。该方法结合实时MRI监测，可快速获得广泛的光遗传表达，助力神经环路研究。

在在线磁共振成像引导下向恒河猴大脑皮层进行对流增强递送光遗传学腺相关病毒载体

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