在胶原蛋白诱发关节炎模型中，用于处理小鼠爪的冷冻粉碎协议，用于评估组织炎症的分子通路
October 30th, 2019
开发了一种使用液氮冷冻机加工鼠爪的低温粉碎方法，以提高从组织中提取的RNA或蛋白质的产量和质量，并分析与炎症相关的分子图谱反应。
局部组织分子特征的评价是了解活性药物在疾病相关临床模型中评估时作用机制的关键一步。在关节炎研究领域，感兴趣的局部组织环境是由骨骼、软骨、肌肉和免疫细胞组成的小型承重关节。在这里，我们描述了一种可靠的可靠方法，用于在低温控制环境中这种复杂组织环境的机械破坏和/或粉碎。
然后，此方法可用于生成下游蛋白质和转录分析工作，以从单个统一的样本源建立疾病的分子特征。这种方法产生一种同质粉末，与许多其他旧技术不同。此外，旧的温度隔离程序允许分离高质量的RNA。
然后，此方法可用于生成下游蛋白质组和转录分析，从而能够对感兴趣的相关疾病途径进行分子表征。这种方法可以为从组织中获取分子特征的任何研究领域提供见解。该方法可以扩展到任何复杂的组织系统，具有密集和难以分离的成分。
虽然我们尚未评估到这一点，我们可以看到潜在的应用到密集的软骨组织，如耳朵或骨骼。将粉末转移到用于称重的管子的时间关键性是需要实践的。如果花了太多的时间，粉末将开始解冻，变得无定形。
将样品数量限制为 10 到 15 非常重要，直到您熟悉该过程。在组织加工当天，在干冰上预冷所有所需的仪器至少10分钟。戴上热手套，避免受到严寒的伤害。
接下来，将每个准备好的鼠标爪转移到一个单独的1.5毫升微离心管中，并立即在液氮中捕捉冻结。将冷冻的爪子存放在负 80 摄氏度。准备好继续时，将冷冻机充满液氮，并让它平衡至少 10 分钟。
将未处理的样品放在干冰上，并保留在那里，以避免冻结/解冻循环。然后将一只后爪转移到带底部钢塞的预冷大型聚碳酸酯研磨瓶中。插入预冷钢冲击器，然后用预冷顶部钢塞关闭聚碳酸酯研磨瓶。
将带样品的大型聚碳酸酯研磨瓶转移到预加注的冷冻机中，然后用仪器前部的橡胶扣合合盖子。让样品在液氮中冷却一分钟。接下来，将冷冻机设置为一分钟程序，以 10 个周期/秒。
按下运行按钮，等待冷冻机完成循环。在此之后，打开冷冻机盖，中取出大型聚碳酸酯研磨瓶。将磨削小瓶放入萃取器中，通过向黑色手柄施加向下压力来拆下顶部钢塞，直到钢塞从聚碳酸酯管中滑出。
将打开的磨削小瓶转移到干冰上，并使用预冷却钳来拆下钢冲击器。将冷冻粉末转移到预冷却的 50 毫升锥形管中。将30至50毫克的冷冻粉末称入1.5毫升微离心管中，用于RNA提取，100至200毫克用于蛋白质提取。
将粉碎的样品储存在负80摄氏度，并在24小时内进行RNA和蛋白质分离。首先，每毫升RLT缓冲液添加10微升β-甲醇。计算与每毫克组织23.3毫升的比例对应的RLT缓冲液的体积，用冷冻粉末将适当的RLT缓冲液与β-默卡托乙醇添加到管中。
以 3，000 RPM 的转速旋转样品 10 秒。使用一毫升管道器，用力上下移液 10 次，以 3，000 RPM 再次旋转样品 20 秒。以13，000次g离心两分钟，将700微升的上光液转移到一个新鲜的管子上。
将700微升70%乙醇加入该管，并将700微升样品加载到RNA纯化柱上。以至少10，000倍g的速度离心管30秒。丢弃流经，将样品的剩余部分装载到 RNeasy 柱上，然后以至少 10，000 倍 g 的速度再次离心管，30 秒。
通过添加 700 微升的 RW1 缓冲液和离心速度至少为 10，000 倍 g 的离心，在 30 秒内，丢弃流经并清洗柱。如果执行选项DNAse消化，在DNAse治疗之前添加350微升RW1。在DNAse治疗后，又增加了350微升的RW1。
然后，通过添加 500 微升的 RPE 缓冲液和离心机，以至少 10，000 次 g 的速度清洗柱子两次，30 秒，确保每次丢弃流经。在此之后，通过以至少10，000次g的速度离心柱子两分钟。通过加入50微升水，以至少10，000倍g的速度离心两分钟来消除RNA。
收集流经，并转移到一个新的1.5毫升管。在进一步分析之前，使用研究人员的选择方法确定RNA的数量，并将其储存在负80摄氏度。使用细胞培养级水将 10X 细胞解液存量溶液稀释为 1X 细胞解液存量溶液。
用一毫升水重新制作蛋白酶抑制剂鸡尾酒，使蛋白酶抑制剂存量为100倍。在 1X 细胞解液缓冲液的 9.9 毫升中加入 100 毫升蛋白酶抑制剂，获得 1X 最终库存溶液。每毫克组织粉添加四微升冰冷细胞解液缓冲液，并在管中加入一个五毫米不锈钢珠。
以 3，000 RPM 左右旋转管，持续 60 秒。将管子转移到湿冰上，继续下一个样品。此外，研究人员可能会发现，将盒子垂直放置有助于更好地与珠子混合。
一小时后，将管子以1万倍g和4摄氏度离心15分钟。将超自然剂转移到新鲜管中，确保避免顶部的脂肪层。确定总蛋白质浓度。
将每个样品放入 1.5 毫升微离心管中，并将其储存在负 80 摄氏度，直到准备进行进一步分析。在这项研究中，使用低温粉碎法处理穆林爪，以提高从组织中提取的RNA或蛋白质的产量和质量，并能够分析与炎症反应相关的分子特征。具有代表性的凝胶图像可视化显示从CIA小鼠的前爪中提取的RNA。
28S rRNA 和 18S rRNA 波段表明所有样品都有足够的完整RNA量。此处显示了基于蛋白质 BCA 分析的总蛋白质浓度的代表性散射图。来自天真小鼠、CIA小鼠或中情局小鼠接受各种治疗的总蛋白质浓度在各组之间是可比的。
然后进行 Luminex 分析，以确定蛋白质提取物中炎症细胞因子和化疗素的浓度。规范化细胞因子和化疗物浓度的代表性散射图显示，与天真小鼠相比，CIA小鼠中升高了几种细胞因子，抗IL17A抗体的治疗显著抑制了几种细胞因子的产生。进行微阵列分析，以评估中情局的转录组变化和治疗相关影响。
与天真的小鼠相比，CIA小鼠的基因具有代表性的热图图显著增加。执行此程序时，研究人员必须尽量减少管子和粉末远离干冰的时间。这有助于防止粉末解冻和随后的降解RNA和蛋白质的问题。
这种技术产生的分子特征的高质量使研究人员能够询问治疗手段将赋予的独特轮廓，进一步允许用于治疗关节炎状况的机制的分化。这种技术可用于提取一些密集的组织，如耳朵和骨骼，以进一步评估这些感兴趣的组织的分子特征。了解治疗如何调节疾病的分子特征使我们能够更好地评估哪些特定的信号通路被调制。
也许更重要的是，哪些途径不受治疗机制评估的调节。使用液氮和干冰时，必须使用个人防护设备，包括正确评级的手套和面罩。皮肤暴露超过几秒钟可能会导致严重烧伤。
当处理大量干冰时，在通风良好的区域工作非常重要，因为干冰会释放二氧化碳。
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概述
本文介绍了一种用于处理小鼠爪的低温粉碎方法，可提高RNA和蛋白质提取质量。该技术有助于分析与炎症反应相关的分子谱。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 药物研究
背景
- 了解组织中的分子谱对于评估药物至关重要。
- 关注关节炎研究中的小负重关节。
- 复杂的组织环境包括骨骼、软骨、肌肉和免疫细胞。
- 需要可靠的方法来分析这些组织。
研究目的
- 开发复杂组织机械破碎的方法。
- 生成高质量RNA用于下游分析。
- 从均匀样品中建立疾病的分子特征。
使用的方法
- 使用液氮冷冻研磨机进行低温粉碎。
- 机械破碎小鼠爪组织。
- 从粉碎样品中分离RNA和蛋白质。
- 促进蛋白质组学和转录组学分析。
主要结果
- 从复杂组织中生成均匀粉末。
- 提高提取RNA和蛋白质的产量和质量。
- 提高分析与炎症相关的分子谱的能力。
- 为临床前模型的下游分析提供可靠的方法。
结论
- 低温方法显著改善了组织处理。
- 它允许进行高质量的分子分析。
- 该技术可以推进对关节炎炎症反应的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This cryo-pulverization method enables high-fidelity molecular profiling of complex inflamed tissues, supporting target validation and mechanistic de-risking in arthritis drug discovery. By generating uniform, high-quality RNA and protein lysates from murine paws, it improves predictive confidence in preclinical efficacy and pathway analysis. The technique addresses a key bottleneck in tissue processing for inflammatory disease models, enhancing reproducibility across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic mechanisms by providing homogeneous samples for proteomic and transcriptional profiling of inflammatory pathways.
- Operational Value: Reduces sample variability from heterogeneous tissue dissection, improving consistency in target engagement and biomarker readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized tissue lysates suitable for downstream assays such as Luminex cytokine analysis and microarray transcriptomics.
- Operational Value: Supports assay scalability by generating uniform powder samples compatible with high-throughput extraction protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by enabling molecular characterization of disease-relevant tissues in collagen-induced arthritis models.
- Operational Value: Allows risk-adjusted advancement decisions through reliable detection of cytokine and gene expression changes in response to therapeutics like anti-IL17A antibody.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical profiling, enabling consistent molecular readouts that inform lead identification and mechanism-of-action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing high-yield nucleic acid and protein extracts for omics-based target de-risking.
- Screening: Enhances assay readiness and reproducibility through cryogenically controlled homogenization of complex joint tissues.
- Analytics: Generates quantitative outputs such as cytokine concentrations and gene expression profiles that allow cross-condition comparison and therapeutic ranking.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation by enabling consistent analysis of inflammatory signaling pathways in disease-relevant tissue.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing capability applicable to other dense, difficult-to-dissociate systems such as cartilage or bone.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through improved molecular signature fidelity and reduced mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility in sample preparation, minimizing pre-analytical variability in omics workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions via reliable detection of pathway modulation, reducing late-stage biological risk in inflammatory programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on robust molecular profiling of target tissue response to therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic handling and tissue homogenization techniques.
- Dependent on access to liquid nitrogen-equipped freezer mills and cold-chain maintenance tools.
- Necessitates standardized timing protocols to prevent sample thawing and degradation of RNA/protein integrity.
- Involves adaptation considerations when extending to other dense tissues like ear or bone, as noted in source material.
- Limited by practical time sensitivity in powder transfer, requiring trained personnel to maintain sample quality.
