Name: 在胶原蛋白诱发关节炎模型中，用于处理小鼠爪的冷冻粉碎协议，用于评估组织炎症的分子通路 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 学习冷冻粉碎技术处理小鼠爪部组织，用于关节炎研究中的RNA和蛋白质提取。该方法可生成均质粉末，提高分子分析质量，助力炎症信号通路的临床前研究。

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作者感谢 Edith Janssen 对手稿的审阅，以及 Navin Rao 和 Jennifer Towne 对本手稿发表的支持。

所有动物实验均按照强生公司机构动物照护与使用委员会（IACUC）的政策进行。&amp;#38;D.
1. 基于低温冷冻研磨机的粉碎方法
<ol>
	<li>在CIA研究结束时，使用1.5%异氟烷麻醉小鼠后实施颈椎脱位处死。</li>
	<li>组织处理当天，将所有器械（刮匙、研磨管等）置于干冰上预冷至少10分钟。佩戴防冻手套以避免冻伤。</li>
	<li>用剪刀在毛发分界线处剪下后肢足部，如图1A所示。</li>
	<li>将每只足部立即转移至一个1.5 mL微量离心管中，迅速在液氮中速冻，并将冷冻的足部储存在-80 °C。样品冷冻保存时间不得超过一周。</li>
	<li>按照图1B所示，向冷冻研磨机中加入液氮，并使其平衡至少10分钟。</li>
	<li>未处理的样品应始终保持在干冰上，避免经历冻融循环。</li>
	<li>将一只后肢足部转移至已预冷的大型聚碳酸酯研磨管中（底部配有钢制塞），插入已预冷的钢制撞击子，并用已预冷的顶部钢制塞封闭聚碳酸酯研磨管（图1C）。</li>
	<li>将装有样品的大型聚碳酸酯研磨管转移至已充满液氮的冷冻研磨机中，并使用仪器前端的橡胶夹扣关闭盖子。</li>
	<li>让样品在液氮中冷却1分钟。</li>
	<li>将冷冻研磨机设置为每秒10个循环、持续1分钟的程序，按下启动按钮。等待设备完成整个研磨周期。 
	注意： 机器运行时钢制撞击子来回运动会产生敲击声。请使用耳塞以防止听力损伤。</li>
	<li>打开冷冻研磨机盖子，取出大型聚碳酸酯研磨管，按图1D所示将其放入提取装置中。通过向下按压黑色手柄，直至钢制塞从聚碳酸酯管中滑出，从而移除顶部钢制塞。</li>
	<li>将打开的大型聚碳酸酯研磨管放回干冰上。使用已预冷的镊子取出钢制撞击子。</li>
	<li>将冷冻粉末转移至已预冷的50 mL锥形管中。</li>
	<li>称取30–50 mg冷冻粉末至已预冷并去皮的1.5 mL微量离心管中用于RNA提取，另称取100–200 mg冷冻粉末用于蛋白质提取。 
	注意： 冷冻粉末应呈白色或淡粉色细沙状，如图1E所示。</li>
	<li>将粉碎后的样品储存在-80 °C，并在24小时内进行RNA和蛋白质的提取。</li>
</ol>
2. RNA 提取
<ol>
	<li>每 1 mL RLT 缓冲液中加入 10 µL β-巯基乙醇（β-ME）。</li>
	<li>根据组织量计算所需 RLT 缓冲液体积，比例为 23.3 mL/mg，并将相应体积的含 β-ME 的 RLT 缓冲液加入装有冷冻粉末的离心管中。该比例经实验确定为小鼠足部组织的最佳比例。</li>
	<li>将样品在 3,000 RPM 条件下涡旋振荡 10 秒。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器剧烈吹打 10 次，充分混匀。</li>
	<li>再次将样品在 3,000 RPM 条件下涡旋振荡 20 秒。</li>
	<li>在 13,000 × g 条件下离心 2 分钟。</li>
	<li>将 700 µL 上清液转移至新的离心管中，并加入 700 µL 70% 乙醇。 
	注意：如果管中上清液体积 &#60;700 µL，仍可继续实验，加入等体积的 70% 乙醇即可。</li>
	<li>将 700 µL 样品加载至 RNA 纯化柱中。</li>
	<li>在 ≥10,000 × g 条件下离心 30 秒。</li>
	<li>弃去穿流液，将剩余样品继续加载至 RNeasy 柱中。</li>
	<li>在 ≥10,000 × g 条件下离心 30 秒。</li>
	<li>弃去穿流液，加入 700 µL RW1 缓冲液洗涤柱子，并在 ≥10,000 × g 条件下离心 30 秒。&#160;若进行 DNASE 消化步骤，则在 DNASE 处理前加入 350 µL RW1 缓冲液。&#160;DNASE 处理后，再额外加入 350 µL RW1 缓冲液。</li>
	<li>可选）按照试剂盒制造商说明书进行 DNase 消化步骤。</li>
	<li>每次加入 500 µL RPE 缓冲液，重复洗涤两次，每次均在 ≥10,000 × g 条件下离心 30 秒，每次均弃去穿流液。</li>
	<li>在 ≥10,000 × g 条件下离心 2 分钟，干燥柱子。</li>
	<li>加入 50 µL 水进行洗脱，在 ≥10,000 × g 条件下离心 2 分钟。收集穿流液并转移至新的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>使用研究者选定的方法测定 RNA 含量，并于 -80 °C 保存，以备后续分析。</li>
</ol>
3. 蛋白质提取
<ol>
	<li>使用细胞培养级水将10倍浓度的细胞裂解储存液稀释为1倍浓度的细胞裂解储存液。</li>
	<li>加入1 mL水重悬蛋白酶抑制剂混合物集I，配制成100倍浓度的蛋白酶抑制剂储存液。</li>
	<li>将100 µL蛋白酶抑制剂加入9.9 mL的1倍细胞裂解液中，配制成终浓度为1倍的储存溶液。</li>
	<li>每毫克组织粉末加入4 µL预冷的1倍细胞裂解缓冲液（例如，向200 mg组织粉末中加入800 µL裂解缓冲液）。</li>
	<li>向离心管中加入一颗5 mm不锈钢珠。</li>
	<li>以3,000 RPM涡旋震荡管子60秒。随后将管子转移至湿冰上，并继续处理下一个样品。</li>
	<li>将所有样品管放入一个盒子中，置于摇床上以1,000 RPM在4 °C条件下震荡1小时。&#160; 
	注意：&#160;研究人员可能会发现将盒子垂直放置有助于钢珠更有效地混合样品。</li>
	<li>在4 °C条件下以10,000 x g 离心15分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的离心管中，避免接触顶部的脂肪层。</li>
	<li>测定总蛋白浓度。进行10至30倍稀释的蛋白裂解液适用于BCA检测。</li>
	<li>将样品分装至1.5 mL微量离心管中，在进一步分析前于-80 °C保存。</li>
</ol>

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li>
<li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226(2009).</li>
<li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis%3A+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li>
<li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+factors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+Allergy%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li>
<li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis%3A+focus+on+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+%26+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li>
<li>Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticytokine+treatment+of+established+type+II+collagen-induced+arthritis+in+DBA%2F1+mice.+A+comparative+study+using+anti-TNF+alpha+anti-IL-1+alpha%2Fbeta%2C+and+IL-1Ra%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra.</a> Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).</li>
<li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li>
<li>Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+a+model+for+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis.</a> Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).</li>
<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li>
</ol>

作者 BJ、SH、ML、RM、ML、TO 和 FS 是强生研发公司（Janssen Research &amp;#38; Development Inc）的员工，并且是母公司强生公司（Johnson &amp; Johnson, Inc.）的股东。

尽管从科学角度有必要在滑膜组织中评估分子通路，但目前许多关于小鼠CIA模型免疫谱型的研究主要集中在外周血，而对炎症足爪的蛋白质和RNA分析数据则相对有限。造成这种偏向的原因可能有多个：小鼠踝关节直径不超过约2 cm；病变区域包含皮肤、骨骼和结缔组织，这些组织通常难以通过传统方法（如组织研磨器、研钵研杵、二氧化硅珠破碎、吹打裂解或酶消化）充分均质化。这些方法通常会导致组织破碎不完全、蛋白质或RNA得率低，或因蛋白水解和核酸降解而导致质量不一致。本文所述的可靠方法提供了一套详细操作流程，可将组织制备成均一的冷冻粉末，从而支持后续的蛋白质组学和转录组学分析，实现从单一且均一的样本来源建立疾病的分子特征谱。
进行该方法时应考虑几个关键步骤。首先，在组织采集过程中应沿毛发线剪下小鼠足部，并避免带有大量毛发。过多的毛发可能在RNA提取过程中堵塞层析柱，并干扰蛋白质提取。其次，整个操作过程中，离心管、镊子和刮勺应始终保持在干冰上，因为组织粉末温度升高会迅速导致材料变为无定形状态 &#34;泥&#34; 蛋白质和RNA的完整性将受到影响。第三，用于蛋白质或RNA提取的组织粉末用量应经过仔细优化。增...

类风湿关节炎（RA）是一种慢性全身性炎症性疾病，其特征是关节出现持续性对称性滑膜炎，并伴有皮肤、心脏、肺和眼睛等关节外器官受累1。尽管在人类患者中免疫反应的全身表现显而易见，但RA病理学的一个重要特征是免疫细胞浸润滑膜组织以及滑膜成纤维细胞的增殖2。
与人类类风湿关节炎（RA）相似，小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）模型可引发明显的组织炎症，表现为滑膜组织及全身各部位的活跃免疫应答。不同小鼠品系对CIA模型的易感性与主要组织相容性复合体（MHC）单倍型以及抗原特异性T细胞和B细胞的相互作用相关3,4。此外，人类RA中的多种致病通路，包括自身抗体产生、免疫复合物沉积、髓系细胞活化、多关节受累以及伴有滑膜免疫细胞浸润的血管翳形成，在该模型中也均能观察到5,6。研究人员已利用这一成熟的CIA模型来研究抗炎性细胞因子治疗的效果7。许多已获批用于自身免疫性疾病或炎症性疾病的生物制剂，如抗TNFα和抗IL-6，在CIA模型中也被证实具有疗效8,9。
分析免疫系统在滑膜组织中的相互作用对于阐明与类风湿关节炎（RA）发病机制相关的分子机制至关重要。在人类临床实践中，通常在超声成像引导下进行针刺滑膜活检。而在临床前研究中，由于小鼠关节结构较小，使得活检操作极为困难甚至无法实施。近期，我们已证明可利用小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）模型来评估多种药物组合对不同终点指标的影响，并通过联合干预策略实现疾病缓解10。本研究采用基于低温冷冻研磨机的粉碎方法，将发炎的小鼠足爪组织处理成均一的细粉，并建立了下游的RNA和蛋白质提取流程。该方法可有效保护RNA和蛋白质免受酶解和化学降解，使我们能够对同一均质化样本来源应用多种分析技术。

<table><tbody><tr><td>5 mm 不锈钢珠</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>抑制RNASE酶的样品还原剂</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 质量评估试剂盒</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>Corning</td><td>25-055-CI</td><td>水</td></tr><tr><td>细胞裂解储存液</td><td>Cell Signaling</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>微量离心管</td></tr><tr><td>Eppendorf 管离心盒</td><td>Nalgene</td><td>5055</td><td>用于水平放置 Eppendorf 管的离心盒</td></tr><tr><td>Everlast 247 可调速摇床</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td></td></tr><tr><td>冷冻研磨仪</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6875</td><td>用于将足部组织研磨成粉末的冷冻研磨仪</td></tr><tr><td>研磨管</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6801</td><td>用于将足部组织研磨成粉末的聚碳酸酯管</td></tr><tr><td>Pierce BCA 试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>总蛋白定量试剂盒</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物套装 1</td><td>Calbiochem</td><td>539131</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>蛋白 BCA 试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Quantigene 试剂盒</td><td>Thermofisher</td><td>QP1013</td><td>bDNA 分析试剂盒</td></tr><tr><td>制冷型微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>离心</td></tr><tr><td>RLT 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>RNA 提取缓冲液</td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>包含 RNeasy 柱、RLT 缓冲液和 RW1 缓冲液</td></tr><tr><td>摇床</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td>摇床/振荡器</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>VWR</td><td>10806-412</td><td>用于粉末转移的刮勺</td></tr><tr><td>不锈钢珠</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>蛋白提取过程中用于混匀的珠子</td></tr><tr><td>管盖提取器</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6884</td><td>用于取下研磨管盖的提取工具</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>样品混匀</td></tr></tbody></table>

一种用于胶原诱导性关节炎模型中小鼠足爪组织炎症分子通路分析的冷冻研磨处理方案

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

对局部组织中的分子变化进行分析对于理解治疗候选物在体内的作用机制至关重要。在关节炎研究领域，许多研究集中于炎症关节，这些关节由骨、软骨、肌肉、基质细胞和免疫细胞等复杂混合物构成。本文中，我们建立了一种可靠且稳健的机械方法，在低温控制环境下将炎症小鼠足爪破碎成均一的粉末样品。随后制备蛋白质和RNA裂解物，以实现蛋白质组学和转录组学检测，并对局部组织中相关疾病通路进行分子表征。

此处，我们展示了从CIA小鼠前爪提取的RNA的代表性凝胶图像（见图2A）。28S rRNA和18S rRNA条带表明所有样本均含有足量的完整RNA。接下来，我们展示了基于BCA法测定的总蛋白浓度的代表性散点图（见图2B）。来自正常小鼠、CIA小鼠或接受不同处理的CIA小鼠的总蛋白浓度在各组之间具有可比性。为确定蛋白提取物中炎症性细胞因子和趋化因子的浓度，我们进行了Luminex分析。我们展示了归一化后的细胞因子和趋化因子浓度（pg/mg总蛋白）的代表性散点图（见图2C）。与正常小鼠相比，CIA小鼠中多种细胞因子水平升高，而抗IL-17A抗体处理显著抑制了多种细胞因子的产生。为评估CIA模型中的转录组变化及治疗相关效应，我们进行了微阵列分析。我们展示了CIA小鼠相较于正常小鼠显著上调基因的代表性热...

开发了一种使用液氮冷冻研磨机处理小鼠足爪的低温粉碎方法，以提高从组织中提取的RNA或蛋白质的得率和质量，并实现对与炎症反应相关的分子谱的分析。

在体内研究治疗候选物的作用机制时，对局部组织中的分子变化进行分析至关重要。在……领域

在疾病相关的临床前模型中评估活性药物的作用机制时，分析局部组织的分子谱是一项关键步骤。在关节炎研究领域，所关注的局部组织环境是小型承重关节，其由骨、软骨、肌肉和免疫细胞组成的复杂混合物构成。本文介绍了一种在低温控制环境下对这种复杂组织进行机械破坏和/或粉碎的可靠且稳健的方法。该方法可用于对单一均一样本来源进行下游蛋白质组学和转录组学分析，以建立疾病的分子特征。该方法能够产生均一的粉末，而许多其他传统技术则无法做到。此外，传统的低温分离步骤可实现高质量RNA的分离。该方法可用于生成下游蛋白质组学和转录组学分析数据，从而实现对相关疾病通路的分子特征进行表征。该方法可为任何从组织中获取分子特征的研究领域提供见解。该方法可拓展至任何具有致密且难以解离组分的复杂组织系统。尽管我们尚未对此进行评估，但可以看到该方法在耳软骨或骨骼等致密软组织中的潜在应用。将粉末转移至离心管进行称重的过程对时间要求较高，需要经过练习才能掌握。若耗时过长，粉末将开始融化并变得无定形。在熟悉操作流程之前，建议将样本数量控制在10至15个以内。组织处理当天，需将所有所需器械置于干冰上预冷至少10分钟。请佩戴防冻手套，以避免极端低温造成伤害。接下来，将每只制备好的小鼠足爪分别转移至1.5毫升离心管中，并立即在液氮中速冻。将冻存的足爪于-80摄氏度保存。当准备继续操作时，向冷冻研磨仪中加入液氮，并使其平衡至少10分钟。将未处理的样品置于干冰上并保持，以避免冻融循环。然后将一只后肢足部放入预冷的大型聚碳酸酯研磨管中，管底装有钢塞。插入预冷的钢制撞击子，并用预冷的顶部钢塞封闭聚碳酸酯研磨管。将装有样品的大聚碳酸酯研磨管转移至预冷的冷冻研磨仪中，并用仪器前端的橡胶夹扣紧盖子。让样品在液氮中冷却一分钟。随后，将冷冻研磨仪设置为每秒10个循环的程序，运行时间为一分钟。按下运行按钮，等待冷冻研磨机完成研磨循环。完成后，打开冷冻研磨机的盖子，取出大型聚碳酸酯研磨瓶。将研磨瓶放入提取装置中，通过向下按压黑色手柄施加压力，直至顶部的钢制塞子从聚碳酸酯管中滑出，从而移除钢塞。将打开的研磨管转移至干冰上，使用预冷的镊子取出钢制撞击子。将冷冻的粉末转移至预冷的50毫升锥形管中。称取30至50毫克的冷冻粉末，放入分层的1.5毫升微量离心管中用于RNA提取，另称取100至200毫克用于蛋白质提取。将粉碎的样品储存于负80摄氏度，并在24小时内进行RNA和蛋白质提取。首先，每毫升RLT缓冲液中加入10微升β-巯基乙醇。根据每毫克组织对应23.3毫升RLT缓冲液的比例计算所需缓冲液体积，并将含β-巯基乙醇的适当体积RLT缓冲液加入装有冷冻粉末的离心管中。将样品在3,000 RPM条件下涡旋振荡10秒。使用1毫升移液器剧烈吹打10次，然后再次将样品在3,000 RPM条件下涡旋振荡20秒。在13,000 ×g条件下离心2分钟，并将700 µL上清液转移至新离心管中。向该离心管中加入 700 微升 70% 乙醇，并将 700 微升样品加入 RNA 纯化柱中。以至少 10,000 × g 的速度离心 30 秒。弃去滤过液，将样品剩余部分转移至 RNeasy 柱中，再次以至少 10,000 × g 的速度离心 30 秒。弃去流出液，加入700微升RW1缓冲液洗涤柱子，并在至少10,000 × g的转速下离心30秒。若选择进行DNase消化处理，需在DNase处理前加入350微升RW1缓冲液；DNase处理后，再额外加入350微升RW1缓冲液。然后加入 500 微升 RPE 缓冲液，洗涤柱两次，每次以至少 10,000 × g 的速度离心 30 秒，并确保每次弃去流出液。随后，以至少 10,000 × g 的速度离心柱子 2 分钟，以干燥柱体。通过加入 50 微升水洗脱 RNA，并以至少 10,000 × g 的速度离心 2 分钟。收集穿流液并转移至新的1.5毫升离心管中。使用研究人员选择的方法测定RNA的含量，并在进一步分析前于负80摄氏度保存。使用细胞培养级水将10X细胞裂解储存液稀释为1X细胞裂解储存液。将蛋白酶抑制剂混合物套装一用一毫升水重悬，配制成100X蛋白酶抑制剂储存液。取100微升该蛋白酶抑制剂加入9.9毫升1X细胞裂解缓冲液中，得到1X的终浓度工作液。每毫克组织粉末加入四微升冰浴预冷的细胞裂解缓冲液，并向管中加入一颗五毫米不锈钢珠。将离心管在3,000 RPM下涡旋振荡60秒。将离心管转移至湿冰上，并继续处理下一个样本。此外，研究人员可能会发现将盒子竖直放置有助于珠子更充分地混合。孵育一小时后，在4 °C条件下以10,000 × g离心15分钟。将上清液转移至新的离心管中，注意避免触及顶部的脂肪层。测定总蛋白浓度。将每个样品分装至1.5毫升微量离心管中，并于负80摄氏度保存，直至准备进行后续分析。本研究采用低温粉碎法处理小鼠足爪，以提高从组织中提取的RNA或蛋白质的得率和质量，并实现对与炎症反应相关的分子谱的分析。图中所示为从CIA小鼠前爪提取的RNA的代表性凝胶电泳图像。28S rRNA 和 18S rRNA 条带表明，所有样本均含有足量的完整 RNA。此处展示的是基于 BCA 蛋白质分析得出的总蛋白浓度的代表性散点图。来自未处理小鼠、CIA 小鼠或接受不同处理的 CIA 小鼠的总蛋白浓度在各组之间具有可比性。随后进行 Luminex 分析，以测定蛋白提取物中炎症性细胞因子和趋化因子的浓度。归一化后的细胞因子和趋化因子浓度的代表性散点图显示，与未处理小鼠相比，CIA 小鼠中多种细胞因子水平升高，而抗 IL-17A 抗体治疗显著抑制了多种细胞因子的产生。通过微阵列分析评估 CIA 小鼠及治疗相关的转录组变化。此处展示的是与正常小鼠相比，CIA 小鼠中显著上调基因的代表性热图。在执行该操作时，研究人员必须尽量缩短试管和粉末离开干冰的时间，以防止粉末解冻，从而避免 RNA 和蛋白质降解带来的后续问题。该技术生成的高质量分子特征使研究人员能够深入分析治疗手段所产生的独特分子谱型，并进一步区分可用于治疗关节炎性疾病的潜在作用机制。该技术还可用于提取多种致密组织（如耳组织和骨组织），以进一步评估这些目标组织中的分子特征。了解治疗手段如何调节疾病相关的分子特征，有助于我们更准确地评估特定信号通路的调控情况。或许更为重要的是，哪些通路并未受到正在评估的治疗机制的调控。在使用液氮和干冰时，必须佩戴个人防护装备，包括经过适当认证的防护手套和面罩。皮肤暴露超过数秒即可导致严重冻伤。使用大量干冰时，必须在通风良好的区域操作，因为干冰会释放二氧化碳。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在胶原蛋白诱发关节炎模型中，用于处理小鼠爪的冷冻粉碎协议，用于评估组织炎症的分子通路

本视频展示了一种用于小鼠自身免疫性关节炎的细胞治疗法。将表达卵清蛋白特异性受体的诱导多能干细胞（iPSC）来源的调节性T细胞，与乳化于佐剂中的甲基化牛血清白蛋白（mBSA）共同注射。小鼠抗原呈递细胞（APCs）对mBSA进行加工并将其呈递给T细胞，从而促进T细胞活化并迁移至膝关节滑膜。后续注射在左膝关节仅使用mBSA，而在右膝关节则联合使用mBSA和卵清蛋白。在左膝关节，针对mBSA的免疫反应引发关节炎；而在右膝关节，调节性T细胞与卵清蛋白相互作用，减轻炎症反应，从而改善关节炎症状。...

一种用于小鼠模型中自身免疫性关节炎的细胞疗法

我们开发了一种诱发性关节炎疼痛的检测方法，并将其与标准化的自发性疼痛测量方法相结合，用于检测不同化学诱导型小鼠关节炎模型中的疼痛。这些方法对不同类型的关节疼痛具有较高的敏感性和可重复性。...

单关节膝痛小鼠模型中疼痛的自发性与诱发性评估

本文介绍了三种评估中性粒细胞在体内和体外迁移与浸润的方法。这些方法可用于发现靶向中性粒细胞迁移的潜在治疗药物。...

检测小鼠中性粒细胞的迁移与浸润

本实验方案描述了在切断小鼠内侧半月板胫骨韧带以使膝关节失稳后，对关节软骨表面进行可控的微刃划伤操作。该动物模型可诱导骨关节炎（OA）的加速发展，适用于研究骨赘形成、骨硬化以及早期疼痛等病理过程。...

内侧半月板失稳与软骨划痕小鼠加速性骨关节炎模型

本研究提供了一种改良方案，用于从鼠类炎症性关节炎组织中分离滑膜巨噬细胞和成纤维细胞。...

从小鼠关节炎组织中分离和培养原代滑膜巨噬细胞与成纤维细胞

我们提出了一种针对石膏固定诱导的膝骨关节炎大鼠进行推拿操作的实验方案。根据初步研究结果，该方法的疗效可能依赖于减轻炎症反应和减缓软骨损伤。...

推拿手法减轻膝骨关节炎大鼠的炎症与软骨丢失

该研究揭示了皮肤在通过表皮（EC）免疫调节小鼠免疫反应中的作用。使用蛋白质抗原进行表皮免疫可抑制接触性超敏反应中的免疫应答，或在与病原体相关分子模式联合使用时逆转皮肤诱导的免疫抑制。表皮免疫作为一种有效的无针免疫治疗策略，展现出良好的应用前景。...

经皮诱导免疫调节的小鼠模型

体内关节成像是一种有价值的技術，可用於揭示白細胞在發炎關節中的遷移行為以及分子動態。本文中，我們介紹了一種利用II型膠原誘導關節炎（CIA）小鼠模型進行體內關節成像的詳細實驗方案。...

体内成像揭示白细胞在关节内的迁移行为

本文报道了一种通过过继转移SKG小鼠的CD4+...

小鼠类风湿性关节炎的过继转移模型

覆盖派尔集合淋巴结的特殊滤泡相关上皮中的M细胞在肠相关淋巴组织的黏膜免疫监视中发挥重要作用。本文描述了评估M细胞介导细菌转胞吞作用的方法。...

应用小鼠结扎派伊尔集合淋巴结肠段环实验评估M细胞对细菌的摄取

学习冷冻粉碎技术处理小鼠爪部组织，用于关节炎研究中的RNA和蛋白质提取。该方法可生成均质粉末，提高分子分析质量，助力炎症信号通路的临床前研究。

一种用于胶原诱导性关节炎模型中小鼠足爪组织炎症分子通路分析的冷冻研磨处理方案

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