一种用于胶原诱导性关节炎模型中小鼠足爪组织炎症分子通路分析的冷冻研磨处理方案

在疾病相关的临床前模型中评估活性药物的作用机制时，分析局部组织的分子谱是一项关键步骤。在关节炎研究领域，所关注的局部组织环境是小型承重关节，其由骨、软骨、肌肉和免疫细胞组成的复杂混合物构成。本文介绍了一种在低温控制环境下对这种复杂组织进行机械破坏和/或粉碎的可靠且稳健的方法。

该方法可用于对单一均一样本来源进行下游蛋白质组学和转录组学分析，以建立疾病的分子特征。该方法能够产生均一的粉末，而许多其他传统技术则无法做到。此外，传统的低温分离步骤可实现高质量RNA的分离。

该方法可用于生成下游蛋白质组学和转录组学分析数据，从而实现对相关疾病通路的分子特征进行表征。该方法可为任何从组织中获取分子特征的研究领域提供见解。该方法可拓展至任何具有致密且难以解离组分的复杂组织系统。

尽管我们尚未对此进行评估，但可以看到该方法在耳软骨或骨骼等致密软组织中的潜在应用。将粉末转移至离心管进行称重的过程对时间要求较高，需要经过练习才能掌握。若耗时过长，粉末将开始融化并变得无定形。

在熟悉操作流程之前，建议将样本数量控制在10至15个以内。组织处理当天，需将所有所需器械置于干冰上预冷至少10分钟。请佩戴防冻手套，以避免极端低温造成伤害。

接下来，将每只制备好的小鼠足爪分别转移至1.5毫升离心管中，并立即在液氮中速冻。将冻存的足爪于-80摄氏度保存。当准备继续操作时，向冷冻研磨仪中加入液氮，并使其平衡至少10分钟。

将未处理的样品置于干冰上并保持，以避免冻融循环。然后将一只后肢足部放入预冷的大型聚碳酸酯研磨管中，管底装有钢塞。插入预冷的钢制撞击子，并用预冷的顶部钢塞封闭聚碳酸酯研磨管。

将装有样品的大聚碳酸酯研磨管转移至预冷的冷冻研磨仪中，并用仪器前端的橡胶夹扣紧盖子。让样品在液氮中冷却一分钟。随后，将冷冻研磨仪设置为每秒10个循环的程序，运行时间为一分钟。

按下运行按钮，等待冷冻研磨机完成研磨循环。完成后，打开冷冻研磨机的盖子，取出大型聚碳酸酯研磨瓶。将研磨瓶放入提取装置中，通过向下按压黑色手柄施加压力，直至顶部的钢制塞子从聚碳酸酯管中滑出，从而移除钢塞。

将打开的研磨管转移至干冰上，使用预冷的镊子取出钢制撞击子。将冷冻的粉末转移至预冷的50毫升锥形管中。称取30至50毫克的冷冻粉末，放入分层的1.5毫升微量离心管中用于RNA提取，另称取100至200毫克用于蛋白质提取。

将粉碎的样品储存于负80摄氏度，并在24小时内进行RNA和蛋白质提取。首先，每毫升RLT缓冲液中加入10微升β-巯基乙醇。根据每毫克组织对应23.3毫升RLT缓冲液的比例计算所需缓冲液体积，并将含β-巯基乙醇的适当体积RLT缓冲液加入装有冷冻粉末的离心管中。

将样品在3,000 RPM条件下涡旋振荡10秒。使用1毫升移液器剧烈吹打10次，然后再次将样品在3,000 RPM条件下涡旋振荡20秒。在13,000 ×g条件下离心2分钟，并将700 µL上清液转移至新离心管中。

向该离心管中加入 700 微升 70% 乙醇，并将 700 微升样品加入 RNA 纯化柱中。以至少 10,000 × g 的速度离心 30 秒。弃去滤过液，将样品剩余部分转移至 RNeasy 柱中，再次以至少 10,000 × g 的速度离心 30 秒。

弃去流出液，加入700微升RW1缓冲液洗涤柱子，并在至少10,000 × g的转速下离心30秒。若选择进行DNase消化处理，需在DNase处理前加入350微升RW1缓冲液；DNase处理后，再额外加入350微升RW1缓冲液。

然后加入 500 微升 RPE 缓冲液，洗涤柱两次，每次以至少 10,000 × g 的速度离心 30 秒，并确保每次弃去流出液。随后，以至少 10,000 × g 的速度离心柱子 2 分钟，以干燥柱体。通过加入 50 微升水洗脱 RNA，并以至少 10,000 × g 的速度离心 2 分钟。

收集穿流液并转移至新的1.5毫升离心管中。使用研究人员选择的方法测定RNA的含量，并在进一步分析前于负80摄氏度保存。使用细胞培养级水将10X细胞裂解储存液稀释为1X细胞裂解储存液。

将蛋白酶抑制剂混合物套装一用一毫升水重悬，配制成100X蛋白酶抑制剂储存液。取100微升该蛋白酶抑制剂加入9.9毫升1X细胞裂解缓冲液中，得到1X的终浓度工作液。每毫克组织粉末加入四微升冰浴预冷的细胞裂解缓冲液，并向管中加入一颗五毫米不锈钢珠。

将离心管在3,000 RPM下涡旋振荡60秒。将离心管转移至湿冰上，并继续处理下一个样本。此外，研究人员可能会发现将盒子竖直放置有助于珠子更充分地混合。

孵育一小时后，在4 °C条件下以10,000 × g离心15分钟。将上清液转移至新的离心管中，注意避免触及顶部的脂肪层。测定总蛋白浓度。

将每个样品分装至1.5毫升微量离心管中，并于负80摄氏度保存，直至准备进行后续分析。本研究采用低温粉碎法处理小鼠足爪，以提高从组织中提取的RNA或蛋白质的得率和质量，并实现对与炎症反应相关的分子谱的分析。图中所示为从CIA小鼠前爪提取的RNA的代表性凝胶电泳图像。

28S rRNA 和 18S rRNA 条带表明，所有样本均含有足量的完整 RNA。此处展示的是基于 BCA 蛋白质分析得出的总蛋白浓度的代表性散点图。来自未处理小鼠、CIA 小鼠或接受不同处理的 CIA 小鼠的总蛋白浓度在各组之间具有可比性。

随后进行 Luminex 分析，以测定蛋白提取物中炎症性细胞因子和趋化因子的浓度。归一化后的细胞因子和趋化因子浓度的代表性散点图显示，与未处理小鼠相比，CIA 小鼠中多种细胞因子水平升高，而抗 IL-17A 抗体治疗显著抑制了多种细胞因子的产生。通过微阵列分析评估 CIA 小鼠及治疗相关的转录组变化。

此处展示的是与正常小鼠相比，CIA 小鼠中显著上调基因的代表性热图。在执行该操作时，研究人员必须尽量缩短试管和粉末离开干冰的时间，以防止粉末解冻，从而避免 RNA 和蛋白质降解带来的后续问题。

该技术生成的高质量分子特征使研究人员能够深入分析治疗手段所产生的独特分子谱型，并进一步区分可用于治疗关节炎性疾病的潜在作用机制。该技术还可用于提取多种致密组织（如耳组织和骨组织），以进一步评估这些目标组织中的分子特征。了解治疗手段如何调节疾病相关的分子特征，有助于我们更准确地评估特定信号通路的调控情况。

或许更为重要的是，哪些通路并未受到正在评估的治疗机制的调控。在使用液氮和干冰时，必须佩戴个人防护装备，包括经过适当认证的防护手套和面罩。皮肤暴露超过数秒即可导致严重冻伤。

使用大量干冰时，必须在通风良好的区域操作，因为干冰会释放二氧化碳。