应用小鼠结扎派伊尔集合淋巴结肠段环实验评估M细胞对细菌的摄取

本实验的总体目标是研究位于肠道黏膜免疫系统内M细胞对细菌的摄取情况。该实验的第一步是暴露并结扎麻醉小鼠的肠系膜淋巴结集合淋巴滤泡。随后将荧光标记的细菌注入结扎区域。

一小时后，切除烧灼区域的组织。随后对组织中的细胞进行通透处理，并使用M细胞标志物GP2进行染色。最后，通过共聚焦显微镜观察样本，可观察到M细胞转胞吞的细菌。

除了有助于揭示M细胞介导细菌转胞吞作用的分子基础外，该方法还可应用于其他系统。例如，本方案可用于协助研究细胞通透性以及使用氯化物和微生物在限定肠道环境中的作用。使用无菌玻璃涂布棒将荧光标记的细菌划线接种于LB琼脂平板上，并在37°C条件下培养平板，直至可见单菌落。挑取一个单菌落，接种至2 mL新鲜LB培养基中。

然后将细菌在37摄氏度下于摇床中过夜培养。待种子培养物生长后，取500微升菌液转入4.5毫升LB培养基中，在37摄氏度下培养3至4小时，或直至其在600纳米处的光密度达到1，表明细菌处于对数生长期。此时，在4摄氏度下以3000 × g离心5分钟，收集细菌；离心后弃去上清液，并用5毫升无菌PBS洗涤菌体沉淀。重复洗涤步骤后，将细菌重悬于5毫升PBS中。

将小鼠置于持续的异氟烷麻醉下后，使用无菌器械无菌打开小鼠腹腔。首先暴露小肠，并找到派伊尔结（Peyer's patches）。一旦发现派伊尔结，使用无菌缝线在结的一侧约五毫米处结扎肠管。

操作过程中需注意避免切断血管。肠段结扎后，使用注射器向结扎肠袢的浆膜面注入约 50 µL 含 10⁷ CFU 的细菌悬液。然后用缝线结扎肠管另一侧。

用夹子闭合小鼠的腹部，并在安乐死前将小鼠维持在麻醉状态下1小时。为收获派尔集合淋巴结（Peyer's patch），需仔细切除该组织区域。随后用PBS剧烈冲洗所收获的肠段数次，以清洗PI斑块的顶侧，并去除多余的黏膜液体和细菌。

PI 的膜片清洗后，将其放入 24 孔板的一个孔中，并加入细胞破膜剂或细胞透化溶液。将样品置于冰上孵育一小时。PI 的膜片固定后，用一毫升透化洗涤缓冲液浸泡五分钟。

重复此洗涤步骤三次。然后将样品置于1毫升封闭缓冲液中，冰上孵育30分钟。封闭步骤完成后，加入抗小鼠GP2单克隆抗体，使其终浓度为5微克/毫升，并在4摄氏度下孵育样品过夜，以标记M细胞。

接着，按之前步骤洗涤样本。加入标记二抗，于冰上避光孵育两小时。样本染色完成后，用 PBS 轻柔洗涤样本。

然后将三到四片圆形盖玻片放置在载玻片上，并将含有 pires 的样本块浸入 200 微升含 30% 甘油的 PBS 溶液中。在载玻片上，使用 DM IRE2 共聚焦激光显微镜或 Delta Vision 去卷积显微镜观察样本。在此图像中，绿色的 GFP 标记的鼠伤寒沙门氏菌可见被红色标记的 GP2 围绕，后者位于顶端质膜上。

在此旋转后的图像中，可在亚顶端胞质囊泡内观察到细菌。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用结扎的派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）肠段卢（Lu）测定法来评估M细胞介导的细菌转胞吞作用。