鼠标应用结扎Peyer氏修补肠袢含量评价M细胞的细菌吸收
December 17th, 2011
在一个专门的卵泡相关Peyer氏斑上皮M细胞在肠道相关淋巴组织的粘膜免疫监视中发挥的重要作用。在这里，我们描述了细菌transcytosis M细胞的评价方法在体内。这种方法提供了一种方法，以了解在免疫系统中的M -细胞功能。
该程序的总体目标是检查位于肠粘膜免疫系统内的 M 细胞对细菌的摄取。该程序的第一步是暴露并结扎麻醉小鼠的肠道 pyres 斑块。然后将荧光细菌注射到连接区域。
一小时后，切掉柴堆斑块。然后渗透组织中的细胞并进行 M 细胞标志物 GP 2 染色。最后，使用共聚焦显微镜观察样品，并且可以可视化细菌被 M 细胞转胞吞作用。
除了提供对 m 细胞细菌转胞吞作用的分子基础的见解外，dismissal 还可以应用于其他系统。例如，该方案可用于辅助细胞通透性，并在框架肠道中使用氯和微生物使用无菌玻璃涂抹器在 LB 螺旋板上划线荧光细菌，并在 37 摄氏度下孵育板，直到可见单个菌落。从固体螺旋钻上挑选一个菌落，并将其接种到两毫升新鲜的 LB 培养基中。
然后在摇床上以 37 摄氏度培养细菌过夜。发酵剂培养物生长后，将 500 微升细菌转移到 4.5 毫升 LB 培养基中，并在 37 摄氏度下孵育这种新培养物 3 到 4 小时，或直到其 600 纳米的光密度达到 1，表明细菌生长处于对数期。此时，将培养物在 4 摄氏度下以 3000 倍 G 离心 5 分钟，以离心后收获细菌，弃去 snat 并用 5 毫升无菌 PBS 洗涤沉淀 重复洗涤步骤后，Resus 将细菌悬浮在 5 毫升 PBS 中。
将小鼠置于持续的 isof 氟麻醉下后，使用无菌工具无菌打开小鼠的腹部。首先暴露小肠并找到 PI 的补丁。找到 PI 的补丁后，使用无菌缝纫纱线将肠道结扎到补丁一侧约 5 毫米处。
在手术过程中注意避免切断血管。连接肠道后，使用注射器将 50 微升细菌悬浮液（约 10 微升）注射到 7 个 CFU 中，注射到肠道松散侧的已结扎的 pyres 补片环中。然后用纱线结扎肠道的另一侧。
用夹子关闭小鼠的腹部，并在安乐死前将小鼠保持在麻醉状态一小时。要收获柴堆补丁，请小心地切除柴堆补丁。然后用力冲洗 PBS 通过收获的肠道切片数次，以清洗 PI 贴片的顶端侧并去除多余的粘膜液和细菌。
洗涤 PI 的贴片后，将其放入 24 孔板的孔中，并添加细胞效应或细胞渗透溶液。将样品在冰上孵育 1 小时。固定 P'S 贴片后，将其浸泡在 1 毫升烫发洗涤缓冲液中 5 分钟。
重复此洗涤步骤 3 次。然后将样品置于 1 mL 封闭缓冲液中，并在冰上孵育 30 分钟。封闭步骤后，添加抗小鼠 GP 2 单克隆抗体至终浓度为 5 μg/mL，并在 4 摄氏度下孵育样品过夜以对 M 细胞进行染色。
接下来，像以前一样清洗样品。为偶联抗体添加二级地板，并将样品在冰上避光孵育 2 小时。样品染色后，在 PBS 中轻轻洗涤样品。
然后将三到四片圆形盖玻片放在载玻片上，将 PIRES 贴片嵌入 200 微升 30% 甘油的 PBS 溶液中。在载玻片上，使用 DM IRE 双共聚焦激光显微镜或 Delta 视觉修复反卷积显微镜观察样品。在这张图片中，可以看到绿色 GFP 标记的鼠伤寒沙门氏菌被顶端质膜上以红色显示的 GP 2 包围。
在这个旋转的图像中，细菌在顶端下细胞质囊泡内可见。看完这个视频，你应该对如何使用连接的 pys 肠 Lu asay 评估 M 细胞的细菌转胞吞作用有一个很好的了解。
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概述
本研究聚焦于肠道粘膜免疫系统中的M细胞，特别是它们在细菌转运中的作用。所描述的方法允许在体内评估M细胞的功能，从而有助于我们对粘膜免疫监视的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 微生物学
- 神经科学
背景
- M细胞是Peyer斑中的专门化上皮细胞。
- 它们在肠道的免疫反应中扮演着关键角色。
- 了解它们的功能可以为肠道健康和疾病提供洞见。
- 细菌转运是免疫监视中的关键过程。
研究目的
- 评估M细胞在体内对细菌的摄取。
- 开发一种用于研究M细胞功能的方法。
- 增进对粘膜免疫监视机制的理解。
使用的方法
- 在麻醉小鼠中结扎肠道Peyer斑。
- 向结扎区域注射荧光细菌。
- 一小时后切除Peyer斑。
- 对组织样本进行M细胞标记物GP2染色，并通过共聚焦显微镜观察。
主要结果
- 成功可视化了M细胞的细菌转运。
- 证明了评估方法的可行性。
- 提供了对M细胞免疫功能的洞见。
- 有助于理解肠相关淋巴组织。
结论
- 该方法允许对M细胞功能进行详细研究。
- 了解M细胞可以为肠道健康策略提供信息。
- 进一步研究可以探索对免疫治疗的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of bacterial transcytosis by M cells in Peyer’s patches addresses a critical gap in understanding mucosal immune surveillance and host-microbe interactions. This assay enables mechanistic de-risking of antigen uptake pathways, supporting predictive confidence in early immunology and microbiome-targeted discovery. The method’s ability to distinguish bacterial species transcytosed by M cells informs target validation and portfolio triage for mucosal immunomodulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of M cell-mediated antigen uptake mechanisms in a physiologically relevant system.
- Supports functional target validation for molecules modulating mucosal immune responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the role of Gp2 and bacterial ligands in transcytosis.
- Provides predictive confidence for advancing immunomodulatory or microbiome-based candidates.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated ex vivo platform for quantifying bacterial uptake by M cells using fluorescence and confocal microscopy.
- Enables reproducible measurement of transcytosis events across bacterial strains and experimental conditions.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators affecting M cell function or permeability.
- Facilitates reliable evaluation of candidate compounds targeting mucosal immune pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying host-microbe interactions in the gut mucosa.
- Provides translational continuity from discovery to preclinical validation of mucosal immune targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions for immunotherapeutic and vaccine candidates targeting gut immunity.
- Supports identification of translational biomarkers linked to M cell-mediated antigen uptake.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing of antigen uptake, supporting lead identification, and informing preclinical validation of mucosal immune modulators.
- Discovery Biology: Quantifies M cell-mediated transcytosis to clarify antigen uptake pathways and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for comparing bacterial uptake across strains and interventions.
- Analytics: Delivers confocal imaging and fluorescence-based measurements to support statistical comparison of experimental groups.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to preclinical models of gut immunity and host-microbe interaction.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse bacterial species and candidate modulators in mucosal immunology workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mucosal immune target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes bacterial uptake quantification and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for immunomodulatory and microbiome-targeted programs, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting gut immune pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and confocal microscopy.
- Demands access to fluorescence labeling reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different bacterial species or model systems.
- Throughput is limited by surgical and imaging workflow constraints.
