一种从小鼠中分离大脑围取体的高输出方法

最近，脑梗塞的作用在神经系统疾病和大脑功能中已经很明显。因此，为这些细胞开发一种可靠的培养方法势在必行。我们提取穆林脑内膜的规程是进行体外研究和提供高纯度和细胞产量的性细胞的可靠工具。

与阿努普里亚·梅赫拉一起演示手术的将是露西·德霍克，一个来自我实验室的技术员。首先将大脑从特定的无病原体的四至六周男性C57BL/6小鼠放在无菌干绒无拭擦上，并使用弯曲的尖端钳子去除小脑、丝状神经和腹膜神经。使用棉签去除所有可见的脑筋，将脑组织倒置。

用浅向外冲程打开叶，并清除所有可见的血管。然后将无脑脑组织放入含有15毫升冷洗缓冲液的100毫米培养皿中B.To使组织均匀化，将大脑样本转移到Dounce组织研磨机砂浆管中，并将三到四毫升的洗涤缓冲液B添加到管中。使用松动的害虫切碎组织55次，然后用洗涤缓冲液B冲洗虫，用紧绷的害虫洗净组织浆25次。

在均质结束时，在两个50毫升管之间同样加入浆料，并加入1.5倍的冷30%牛血清白蛋白的体积。然后大力摇动管子，混合泥浆。为了分离血管部分，通过离心沉淀细胞，将超级纳特将转移到两个新的管中。

将颗粒存放在洗涤缓冲液B的冰上。将颗粒重新在三毫升的冷洗缓冲液B的冰上。将收获的超级钠离心机离心机，再重复一遍。

丢弃超滤剂，将颗粒重新悬浮在三毫升洗涤缓冲液B中，然后将重新悬浮的颗粒集中起来，用新鲜的冷洗缓冲液B将池状细胞悬浮液的最终体积带到10毫升。将过滤器放在培养皿中，用新鲜洗涤缓冲液 B 清除网眼并刮擦以恢复任何毛细管。然后用新鲜的过滤器进行第二次过滤。

在两个管之间平均分配滤物，通过离心收集细胞。丢弃超自然物质后，将颗粒池入一个管中，内含预预警洗涤缓冲液B，并加入预警告的胶原酶/Dispase。将管子放在一个摇晃的台水浴中，在37摄氏度下精确33分钟，然后停止与30毫升冷洗缓冲液B.通过离心收集细胞，并小心丢弃上清液。

快速但小心地将颗粒重新悬浮在洗涤缓冲液 B 中六次，然后再次离心悬浮液。丢弃上一块液后，将颗粒重新悬浮在18毫升的完整DMEM介质中，并在三孔涂层的9孔中，在完整的DMEM中播种2毫升细胞悬浮液。将细胞培养物放在无菌的 37 摄氏度 5%二氧化碳培养箱中 24 小时，然后小心地清除每一个井中的碎屑，并添加新鲜的 DMEM 介质。

48 小时后，每 48 小时更换一次井中的介质。在第8至10天，当细胞达到100%汇合时，将以百合细胞培养基培养的细胞传递到新的明胶涂层六孔板上，然后将细胞返回到细胞培养箱，再进行6至7天的监测。然后在第17天再次将细胞以百合细胞介质分割成新的明胶涂层板。

从通道零到通过二，有特定的形态特征，通过这些特征可以识别内皮细胞和随后的内皮细胞逐渐增加。在通道零培养中，从微维塞尔发育的拉长内皮细胞是丰富的。这种丰度在第一通道后减少，在第二通道后不存在。

相反，在早期培养中，周利器作为罕见的四边细胞出现，通过第二通道变得丰富。NG2、CD146和PDGFRβ的表达评估可用于通过定量PCR、免疫细胞化学和西方印迹评估百维细胞的纯度。酶消化是协议成功的关键步骤。

一定要严格监测酶浓度和孵育时间。