一种高效分离小鼠脑周细胞的方法

近年来，脑周细胞在神经系统疾病和脑功能中的作用日益明确。因此，建立一种可靠的周细胞培养方法显得至关重要。我们提出的从小鼠脑组织中提取周细胞的实验方案，为体外研究提供了一种可靠工具，能够获得高纯度和高细胞得率的周细胞。

由Lucie Dehouck（本实验室的技术员）与Anupriya Mehra共同演示该操作步骤。首先将一只无特定病原体、4至6周龄雄性C57BL/6小鼠的大脑置于无菌无绒擦拭布上，使用带弯头的镊子去除小脑、纹状体和枕部神经。用棉签清除所有可见的脑膜组织，并将脑组织翻转至背面朝上。

用轻柔的向外划动分开脑叶，去除所有可见的血管。然后将去除了脑膜的脑组织放入一个含有15毫升冷洗涤缓冲液B的100毫米培养皿中。为进行组织匀浆，将脑组织样本转移至Dounce组织研磨器的研磨管中，并向管中加入3至4毫升洗涤缓冲液B。先用松头研杵研磨组织55次，然后用洗涤缓冲液B冲洗研杵，再用紧头研杵将组织匀浆研磨25次。

匀浆结束后，将匀浆液等量分装至两个 50 毫升离心管中，并加入相当于每管体积 1.5 倍的冰冷 30% 牛血清白蛋白葡聚糖溶液。然后剧烈振荡离心管以充分混匀匀浆液。为分离血管组分，通过离心沉淀细胞，并将上清液转移至两个新离心管中。

将沉淀物置于冰上，用洗涤缓冲液B保存。在冰上用三毫升冷的洗涤缓冲液B重悬沉淀物。离心收集的上清液，并再重复此步骤一次。

弃去上清液，将沉淀物重悬于 3 毫升洗涤缓冲液 B 中。合并重悬的沉淀物，并用新鲜的冷洗涤缓冲液 B 将合并后的细胞悬液终体积调至 10 毫升。用 10 毫米移液器吹打 6 次，进一步解离细胞，直至肉眼不可见任何残留的沉淀团块，然后使用真空过滤装置和尼龙网筛过滤细胞悬液。将筛网置于培养皿中，用新鲜洗涤缓冲液 B 冲洗并轻轻刮擦以清除网孔，回收可能存在的毛细血管。随后，使用新的滤膜进行第二次过滤。

将滤液均分至两个离心管中，通过离心收集细胞。弃去上清液后，将沉淀合并至一个含有预热的含酶洗涤缓冲液B的离心管中，并向管中加入预热的胶原酶/分散酶。将该管置于摇床水浴中，在37摄氏度下精确孵育33分钟，然后加入30毫升冷的洗涤缓冲液B终止反应。通过离心收集细胞，并小心弃去上清液。

迅速但轻柔地用洗涤缓冲液B重悬沉淀物，重复六次，并再次离心悬浮液。弃去上清液后，将沉淀物重悬于18毫升完全DMEM培养基中，并将2毫升细胞悬液接种至3块Matrigel包被的六孔板的各9个孔中，每孔均含完全DMEM培养基。将细胞培养物置于无菌的37°C、5% CO₂培养箱中培养24小时，然后小心去除每个孔中的碎片，并加入新鲜DMEM培养基。

48 小时后，每隔 48 小时更换每个孔中的培养基。在第 8 至 10 天，当细胞达到 100% 汇合度时，将细胞传代至新的明胶包被的六孔板中，使用周细胞培养基，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养 6 至 7 天，期间进行监测。然后在第 17 天再次使用周细胞培养基将细胞分种至新的明胶包被的培养板中。

从第零代到第二代，内皮细胞以及周细胞的逐步增加可通过特定的形态学特征加以识别。在第零代培养中，由微血管发育而来的长梭形内皮细胞数量丰富；此特征在第一代后减少，并在第二代后消失。

相反，周细胞在早期培养中表现为稀少的四边形细胞，至第二代时数量显著增多。可通过定量PCR、免疫细胞化学和蛋白质印迹法检测NG2、CD146和PDGFRβ的表达，以评估周细胞培养的纯度。酶消化是本实验方案成功的关键步骤。

务必严格监控酶的浓度和孵育时间。