卡诺尔哈布炎细胞外囊泡的纯化与分析

本文介绍了生成、纯化和量化卡内哈卜迪炎细胞外囊泡的方法。

细胞外囊泡场缺乏基因可治疗的无脊椎动物模型来研究细胞外囊泡的蛋白质和RNA信号。该协议建立了从C.elegans获得大量纯细胞外囊泡的方法。这足以进行健壮的RNA-SEQ和蛋白质蛋白分析。

当同步培养物C.elegans将食物从正常生长的培养基中耗尽时，使用橡皮筋将五微米尼龙网滤帽固定到无菌瓶上，然后开始真空。将 L1 蠕虫倒入过滤器，并在蠕虫聚合体上传递相等的介质体积。涡旋后，将三个10微升的蠕虫悬浮液转移到蠕虫培养板盖上，并计算每滴动物的数量。

将蠕虫悬浮液调整为每微升新鲜介质的两只动物，并再次涡流悬浮液。接下来，在新的板盖上加入9，10微升的蠕虫，并手动计算每滴动物的数量。然后计算平均误差和标准误差，即每个蠕虫种群的百分比，并计算每个种群中动物的总数。

为准备蠕虫的分泌生成，用3个5分钟洗涤在15毫升无菌M9介质中，每毫升每洗一千毫升的卡贝尼西林50微克，用柔和的漩涡将蠕虫分离，将洗涤液汇集到50毫升锥形管中。上次洗涤后，将蠕虫稀释为每微升S-Basel溶液中一种动物，每毫升胆固醇2.5微克，每毫升胆固醇浓度50微摩尔。然后将高达 400 毫升的蠕虫悬浮液添加到无菌的两升底部困惑烧瓶中。

将烧瓶放在20摄氏度的圆形旋转器上，24小时每分钟旋转100次。对于细胞外囊泡收获，将蠕虫转移到 50 毫升锥形管中进行离心，并通过 0.22 微米真空过滤器将上清液清除，以清除任何颗粒碎屑。数了一下后，将一滴悬浮蠕虫放到细菌草坪上，在15分钟后将动物们打上移动、瘫痪或死亡的分数。

接下来，将过滤的上清液浓缩到700微升中，使用再生硝基纤维素10千达顿分子量截止过滤器，并添加150微升的新鲜S-Basel溶液。过滤和涡流产生的溶液，并重复两次的减少和过滤，正如刚刚证明的。上次过滤后，将上流液离心机离心，以清除处理过程中可能积聚的任何颗粒和碎屑，并按照制造商的说明添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒以及 EDTA。

要准备大小排除柱，将15毫升悬浮的气糖树脂排入空重力流柱筒中。当柱排干时，加入 S-Basel 溶液，直到树脂床以 10 毫升的最终体积包装。用 40 毫升无菌过滤的 S-Basel 溶液更换树脂缓冲液，注意不要打扰树脂，并允许重力通过柱排出缓冲液。

一旦树脂顶部不再被淹没，盖住墨盒的底部以停止流动，并在柱下放置收集管。要启动分泌物分馏，请取下盖子，并立即将浓缩分泌物溶液滴到柱床的顶部，然后添加一毫升的 S-Basel 溶液滴。在柱子下放置一个新鲜的收集管，然后慢慢用五毫升的S-Basel溶液填充上柱储液罐。

收集前两毫升的埃卢酸盐后，快速更换管子以收集后四毫升。使用再生硝基纤维素 10 千吨分子量截止自旋过滤器将含有柱状的细胞外囊泡浓缩至 300 微升，并将过滤器的浓缩物转移到低结合微离质管中。然后用100微升的S-Basel溶液洗涤滤膜两次，每次洗涤20秒的涡旋，并将洗涤液与原液混合，最终样品量为500微升。

为了准备细胞外囊泡，通过流动细胞计量分析进行定量，在微离库管中加入840微升S-Basel溶液和60微升纯化的细胞外囊泡。将样品的300微升加入两个额外的微离心管，以及每管中7个适当电位探针的微升。将 7 微升 1%Triton X-100 添加到最后一根管中，然后通过涡流混合所有管。

将声波尖端放在第三个样品的管子中心，以 20% 的功率和 30% 的占空比脉冲样品 10 次。接下来，在两个控制微离心管中加入300微升S-Basel溶液，并在仅染料管中加入7微升探针。仅标记第二管缓冲器。

然后，根据标准方案，在室温下将所有管子孵育一小时，防止光线，然后根据标准方案通过流式细胞仪进行分析。要分析数据，请打开相应的流式细胞测分析软件中的文件。设置一个矩形门，从绘图的顶部开始，从小角度光散射水平的一倍 10 到二到一倍十到四，然后将门向下，直到它包含大约 2.5% 的事件。

在探头之后命名门，将门复制并粘贴到其他两个样本和控制数据图上。然后将分析导出到电子表格。在这里，显示了10个生物复制的代表性结果。

复制之间的变异性并不显著，种群规模平均值的典型标准误差略超过10% 。动物在板块之间的转移导致大约10%的动物损失，而大约20%的动物在蔗糖浮选步骤中丢失。平均而言，1000只野生型幼年成年动物会将大于10公斤的蛋白质分泌到环境中。当这个分数通过大小排除色谱进一步分离时，总蛋白质洗脱图显示两到六毫升之间的小蛋白质峰值和八毫升后的大峰值。

细胞外囊泡包含在柱式水闸前五毫升内。在直接比较C.elegans和人类细胞外囊泡之间的流动细胞学特性时，C.elegans细胞外囊泡样本事件的直方图，按小角度光散射排序，显示所有制剂在平均荧光强度约为10倍至第三位时达到峰值。电位测量探针DI-8-ANEPPS，有力地标记了C.elegans细胞外囊泡和由DI-8-ANEPPS表达排序的纯化细胞外囊泡的丰度，C.elegans和细胞培养衍生制剂之间没有显著差异。

本程序准备的样品适合所有典型的下游细胞外囊泡分析方法，包括RNA-SEQ、流式细胞仪、纳米粒子跟踪分析和蛋白质细胞分析。建立净化C.elegans细胞外囊泡的方法使研究人员能够利用这个简单的无脊椎动物模型来研究影响细胞外囊泡货物成分的遗传途径和生理过程。