免疫细胞衍生细胞外囊泡的表征及研究功能对细胞环境的影响
2020年6月2日
本报告强调了从微胶质或血液巨噬细胞分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。微胶质衍生的EV被评价为神经外生长的调节器，而血液巨噬细胞衍生的EV在体外检测中控制C6胶质瘤细胞入侵时被研究。目标是更好地了解这些EV功能作为免疫中介器在特定微环境中。
该协议使得有可能保证细胞外囊泡的分离和 EBDF 蛋白数量的增加的通知。与其他隔离技术相比，这种技术认为它更完整，更垂直活动。电动汽车在LC和病理条件下的研究也越来越多。
此方法可应用于我们选择描述和研究 EV 的任何系统。对于该内容或生物伦理，在跟踪电动汽车时需要特别注意，如在培养中导致以下实验。视觉演示对于承载特定设备（如自制尺寸排除色谱柱）以及纳米粒子计数器和质谱仪的参与至关重要。
帮助证明这个程序将是安东内拉拉福罗梅罗，一个从实验室。首先从条件介质中预隔离细胞外囊泡或 EV。将条件从微胶质或巨噬细胞培养物转移到培养基中，并将其在1，200次G下离心10分钟，以粒粒细胞。
将上流液转移到新的锥形管中，并再将离心机转移20分钟，以消除凋亡体。然后将上一液转移到10.4毫升聚碳酸酯管中。将管子放入 70.1 TI 转子中，在 100，000 次 G 下将超离心机放入 4 摄氏度下 90 分钟，以对 EV 进行颗粒。
离心后，丢弃上清液，将颗粒重新在 200 微升 0.2 微米过滤 PBS 中。要隔离 EV，请通过清洗和消毒玻璃色谱柱，并在底部放置 60 微升过滤器，准备自制尺寸排除色谱柱。将柱子与交链接的阿加罗斯凝胶过滤基层堆叠在一起，形成直径为 0.6 厘米、高度为 20 厘米的固定相。
然后用 50 毫升 0.2 微米过滤 PBS 冲洗相。如有必要，请将柱存放在摄氏四度，供以后使用。将重新暂停的 EV 颗粒放在固定相的顶部，收集 250 微升的 20 个连续分数，同时继续将 PBS 添加到固定相的顶部。
分数可以储存在零下20摄氏度。要执行纳米颗粒跟踪分析，用 0.2 微米过滤 PBS 稀释每个分数，并涡旋以消除聚集体。将溶液放入一毫升注射器中，并放入自动注射器泵中。
接下来，将摄像机设置调整为适当的屏幕增益级别和摄像机级别，然后单击"运行"。将样品加载到分析室中，输液速率为 1000 15 秒。然后减少并稳定视频录制的速度流，以 25 的输液速率 15 秒。
连续捕获三个 60 秒的粒子流视频。然后在视频分析之前调整摄像机电平和检测阈值。单击"设置确定"以开始分析，并在完成时单击"导出"。
用一毫升 0.2 微米过滤 PBS 清洗系统。如果执行电子显微镜分析，使用50千吨离心滤波器来浓缩感兴趣的大小排除色谱分数。对于蛋白质提取，将50微升RIPA缓冲液与EV样品混合5分钟。
在500瓦和20千赫下对样品进行三次声波化，5秒钟。然后在摄氏4度下以2万次G离心10分钟，清除车辆碎屑。隔离蛋白质后，在12%聚丙烯凝胶的堆叠凝胶中执行蛋白质迁移。
在室温下将凝胶中的蛋白质与库马西蓝混合20分钟。然后切除每块彩色凝胶，并切成小块。如手稿中所述，将凝胶片通过一系列连续洗涤。
然后用真空浓缩器完全干燥。干燥后，在56摄氏度下，用100微升100毫摩尔碳酸氢铵，含有10毫摩尔二十二醇，减少蛋白质一小时。接下来，用含有50毫摩尔碘多乙酰胺的100微升100毫摩尔碳酸氢钠进行蛋白烷化，在黑暗中45分钟。
根据手稿说明清洗凝胶片，并在真空浓缩器上完全干燥。在37摄氏度的碳酸氢铵中用50微升的三聚液进行蛋白质消化。第二天，用50微升100%ACN从凝胶中提取消化的蛋白质，在37摄氏度下30分钟，然后在室温下15分钟连续搅拌。
然后在20毫摩尔碳酸氢铵中用50微升5%TFA的50微升提取蛋白质两次，同时连续搅拌20分钟。加入 100 微升的 ACN，继续搅拌 10 分钟。之后，干燥蛋白质，并在20微升0.1%TFA中重新暂停。
使用带 C 18 反向相介质的 10 微升移液器尖端对样品进行脱盐和浓缩肽。然后用ACN和0.1%的甲酸洗。使用真空浓缩器完全干燥样品，并在 20 微升 ACN 和 0.1% 甲酸中重新泵化，用于液相色谱串联质谱法（LC-MS）。
将消化的肽加载到仪器中，并进行样品分析。为了确认EV隔离，每个SCC分数都经过纳米粒子跟踪分析。粒子数在分数五、六和七中显著增加。
这些分数被汇集到一个样本2F-EV阳性，并与EV负数分数，1F-EV阴性和3F-EV阴性进行比较，使用西方印迹分析。结果表明，在EV阳性样品和细胞酸盐控制中存在热休克蛋白90。EV 阳性样本的电子显微镜显示 EV 的尺寸范围约为 100 纳米和 400 纳米。
为了识别EV阴性样品中的污染物蛋白，并描述EV的蛋白质含量，进行了蛋白质组学分析。在1F-EV阴性样本和2F-EV阳性样本之间，以及2F-EV阳性样本和3F-EV阴性样本之间，对已识别的蛋白质进行比较。使用这种非靶向方法，将536种蛋白质的池提交给ExoCarta数据库，并导致86个EV相关蛋白质的识别。
此外，该池还允许识别蛋白质相互作用及其相关的生物功能。研究发现，EV阳性样本中的蛋白质在免疫和神经保护途径中发挥作用。用PC 12细胞和大鼠原发神经元对神经素产生的影响进行了评价。
与控制相比，在电动汽车下观察到显著增长。对胶质瘤细胞入侵进行了巨噬细胞衍生的电动汽车评价。研究发现，EV损害了胶质瘤球体的生长和入侵。
要记住的最重要的事情是真正小心地丢弃超离心步骤的上清液，以防止在此过程中丢失 EV。我们赞成采用大规模和非靶向的方法，关注整个蛋白质含量，然后关注电动汽车的垂直效应。因此，核酸中的内容可以通过分析来关联。
通过这种方法，从初级培养，我们能够区分EV蛋白和自由蛋白，是品种之外。因此，问题仍然是，这种凝固是神器还是一些其他真正的
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概述
本研究详细介绍了从小胶质细胞和血液巨噬细胞分离细胞外囊泡（EVs）的协议，强调它们在神经突生长调节和胶质瘤细胞侵袭控制中的作用。研究结果旨在增强我们对EV在特定微环境中作为免疫介质的功能理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 细胞外囊泡（EVs）在细胞通信中扮演重要角色。
- 小胶质细胞和巨噬细胞是中枢神经系统中的关键免疫细胞。
- 了解EV如何影响神经元功能可以为神经免疫相互作用提供见解。
- 目前的EV分离技术可能影响囊泡的完整性和活性。
研究目的
- 评估来自小胶质细胞和血液巨噬细胞的EV在不同生物学背景中的表现。
- 评估这些EV对神经突生长和胶质瘤细胞行为的影响。
- 建立可靠的EV分离协议，确保生物学完整性。
使用的方法
- 主要方法包括细胞培养，然后通过分步离心从条件培养基中分离EV。
- 使用纳米粒子跟踪分析和Western blot技术来表征EV。
- 详细包括超离心、尺寸排阻色谱和蛋白质提取方法。
- 注意在EV处理过程中保持生物学伦理。
主要结果
- 在富含EV的特定分数中观察到显著更高的粒子计数。
- Western blot分析确认了EV阳性样本中心脏应激相关蛋白的存在。
- 电子显微镜确定了分离EV的大小范围，表明分离方法成功。
结论
- 从小胶质细胞和巨噬细胞分离EV的开发协议可能增强对免疫介导的神经发育过程的研究。
- 该研究为未来对EV在各种生物学背景中的作用的调查提供了框架。
- 了解这些EV的功能意义可能为神经系统疾病的治疗策略提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation and functional characterization of immune cell-derived extracellular vesicles (EVs) enable mechanistic de-risking in neuroimmunology and oncology target validation. This approach supports predictive confidence in therapeutic vesicle design by linking EV protein signatures to neurite outgrowth and glioma invasion phenotypes. The protocol provides a scalable, reproducible workflow for evaluating EV-mediated immune functions in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial and macrophage EV protein signatures as biomarkers for immune-mediated pathway modulation.
- Operational Value: Provides standardized isolation via ultracentrifugation and size-exclusion chromatography to ensure EV integrity for functional assays.
- Predictive Value: Supports target de-risking by correlating EV-enriched proteins (e.g., HSP90) with functional outcomes in neurite outgrowth and glioma spheroid invasion models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative nanoparticle tracking data from SEC fractions to standardize EV yield and purity across batches.
- Operational Value: Enables functional readouts in neurite outgrowth (PC12/primary neurons) and glioma invasion (C6 spheroids) assays for immune mediator screening.
- Assay Readiness: Pooled EV-positive fractions (5-7) provide consistent material for downstream proteomic and functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant EV functions in neurite outgrowth (neuroprotection) and glioma invasion (anti-tumor immune modulation).
- Translational Continuity: Links EV protein cargo to immune and neuroprotective pathways, supporting biomarker-aligned mechanistic studies.
- Preclinical Model Utility: Uses primary neurons and glioma spheroids to evaluate EV effects in physiologically relevant culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of immune cell EVs as modulators of neuronal and cancer cell phenotypes, supporting lead identification through functional de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of EV-mediated immune signaling in CNS and tumor microenvironments via isolated vesicle functional assays.
- Screening: Delivers standardized, quantification-ready EV preparations for high-content phenotypic screening in neurite outgrowth and invasion models.
- Analytics: Generates nanoparticle tracking, Western blot, and proteomic data to quantify EV yield, validate markers (e.g., HSP90), and characterize functional protein cargo.
- Translational Research: Connects EV protein signatures to pathway-level effects in neurite outgrowth and glioma invasion, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and characterization platform applicable to multiple immune cell types and disease contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of immune cell EV functions in neurite outgrowth and glioma invasion models.
- Operational Value: Standardized isolation via ultracentrifugation and SEC ensures reproducibility and scalability across labs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking EV protein signatures to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic vesicle candidates based on functional immune mediator validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, ultracentrifugation, and size-exclusion chromatography for EV isolation.
- Dependent on nanoparticle tracking analyzers, Western blot systems, and mass spectrometry for EV characterization.
- Necessitates cross-team standardization of EV fractionation and pooling (e.g., fractions 5-7) for reproducible functional assays.
- Adaptation to primary microglia, macrophages, or other immune cells requires validation of EV yield and functional activity.
- Practical limitation: EV integrity depends on careful supernatant removal post-ultracentrifugation to prevent loss of vesicle yield.
