Name: 流循环模型中血液接触植入物的血液相容性测试模拟人类血流 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习使用流循环模型评估血液接触植入物的血液相容性，该模型采用新鲜肝素化人血模拟人体生理条件。此方法为生物材料研究和临床前研究提供可靠的评估手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

对于扫描电子显微镜实验，我们感谢图宾根大学医院医学材料科学与技术部门的 Ernst Schweizer。本研究由捷克共和国教育、青年和体育部在国家可持续发展计划 II（项目 BIOCEV-FAR LQ1604）框架内资助，并得到捷克科学基金会项目 No. 18-01163S 的支持。

该血液采样程序已获得图宾根大学医学院伦理委员会批准（项目识别代码：270/2010BO1）。所有受试者在参与前均签署了书面知情同意书。
1. 肝素负载单管的制备
<ol>
	<li>将未稀释的肝素（5,000 IU/mL）与氯化钠（NaCl，0.9%）溶液混合，配制终浓度为 15 IU/mL 的肝素溶液。</li>
	<li>向每个中性单支采血管（9 mL）中加入 900 µL 稀释后的肝素溶液，以便在采血后获得 1.5 IU/mL 的终末肝素浓度。每位供体准备三支采血管，另加三支备用采血管，并将装有肝素的采血管于 4 °C 保存至采血前。</li>
</ol>
2. 血液采样
<ol>
	<li>在采血前30分钟，将含肝素的单支采血管从冰箱中取出。</li>
	<li>通过静脉穿刺，从每位健康供体（n = 5）采集27 mL血液样本用于流环实验。仅使用平滑的止血带，以避免血小板和血液凝固级联反应的过早激活。</li>
	<li>将血液样本分别收集到三支含有900 µL肝素溶液（1.5 IU/mL）的单支采血管中，并将这三支采血管的血液全部汇入一个塑料容器中，以确保所有成分均匀分布。</li>
	<li>立即将混合后的肝素化血液分别转移至另外三支不同的单支采血管中，其中分别含有EDTA（1.2 mL）、枸橼酸盐（1.4 mL）或枸橼酸盐、茶碱、腺苷和双嘧达莫混合物（CTAD，2.7 mL），用于获取基线值。随后按照第5–8节所述步骤处理样本。 
	注意：为确保不受干扰的凝血行为，供体在最近14天内应避免使用影响止血功能的药物（如乙酰水杨酸、萘普生和羧苄西林），以及口服避孕药和吸烟。</li>
</ol>
3. 流动回路的制备
<ol>
	<li>截取三根长度为75 cm、内径为3.2 mm的肝素涂层聚氯乙烯管。将神经血管激光切割植入物装入管中，可选择是否带有纤维蛋白-肝素涂层。请留出一根管不装入植入物作为对照。</li>
	<li>将管的一端置于盛有0.9% NaCl的储液器中，将管路连接至蠕动泵泵头，并将另一端插入量筒中。</li>
	<li>启动蠕动泵，使用计时器并通过观察量筒中的液位，调节泵的设置，使流速达到150 mL/min。</li>
</ol>
4. 血液相容性测试的实施
<ol>
	<li>使用 12 mL 注射器将血液注入试管中。让 6 mL 血液平稳流入每支含有样品或未加载对照的试管中。</li>
	<li>形成回路，并使用一段 0.5 cm 长的硅胶连接管将试管紧密封闭。将试管置于 37 °C 的水浴中，开始灌注，持续 60 min。</li>
</ol>
5. 全血细胞计数分析
<ol>
	<li>采样后（基线）或灌注后，取1.2 mL血液放入含EDTA的采血管中，轻轻倒置混匀5次。</li>
	<li>将采血管插入血细胞分析仪，对每个样本进行血常规分析。血常规检测完成后，按照第7节所述，将采血管置于冰上孵育15−60分钟，用于后续分析。</li>
</ol>
6. 枸橼酸盐血浆的采集
<ol>
	<li>向含有柠檬酸盐的单支采血管中加入 1.4 mL 血液（新鲜抽取或循环后），轻轻倒置 5 次。</li>
	<li>在室温（RT）下以 1,800 × g 离心 18 分钟。将血浆部分分装成三份，每份 250 µL，转移至 1.5 mL 反应管中，并用液氮速冻血浆样品。储存于 -20 °C 直至分析。</li>
</ol>
7. EDTA 血浆的采集
<ol>
	<li>在血细胞计数测量后，将单管置于冰上孵育15−60分钟。然后在4 °C条件下以2,500 x g离心20分钟。</li>
	<li>离心后，将血浆组分分装为三份，每份250 µL，转移至1.5 mL反应管中，并用液氮速冻。随后于-80 °C保存，直至分析。</li>
</ol>
8. CTAD 血浆的采集
<ol>
	<li>将新采集或孵育后的血液注入含有CTAD混合物的单室管中，至2.7 mL，轻轻颠倒混匀5次。随后将单室管置于冰上孵育15−60分钟，然后在2,500 × g、4 °C条件下离心20分钟。</li>
	<li>取700 µL中间血浆组分转移至1.5 mL离心管中，并将装有样品的离心管在2,500 × g、4 °C条件下离心20分钟。</li>
	<li>离心后，将中间组分分别分装为两份100 µL样品至1.5 mL反应管中，用液氮速冻后于-20 °C保存，直至分析。 
	注意：EDTA血浆与CTAD血浆的采集可同时进行，因操作条件相同。</li>
</ol>
9. 从枸橼酸血浆中测量人TAT
<ol>
	<li>将柠檬酸盐血浆在37 °C水浴中解冻。</li>
	<li>根据制造商说明书使用凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒。配制血浆标准品和对照品，并稀释洗涤液、抗人TAT辣根过氧化物酶（POD）标记抗体和显色液。在开始检测前，将所有试剂和微孔板置于室温（15−25 °C）平衡30分钟。</li>
	<li>向微孔板的每个孔中加入50 µL样品缓冲液，并分别向孔中加入50 µL样品缓冲液（空白孔）、血浆标准品、血浆对照品以及未稀释的血浆样本（每个样本设复孔）。密封微孔板，在37 °C轻轻振荡孵育15分钟，随后用300 μL洗涤液洗涤3次。</li>
	<li>向每个孔中加入100 µL POD标记的抗人TAT抗体。密封微孔板，在37 °C轻轻振荡孵育15分钟，随后用300 μL洗涤液洗涤3次。</li>
	<li>向每个孔中加入100 µL新鲜配制的显色液。密封微孔板，在室温下避光孵育30分钟。</li>
	<li>移除密封膜，向每孔加入100 µL终止液。使用分光光度计在490−500 nm波长处读取各孔的光密度（OD）值。以标准品浓度拟合标准曲线，计算各样本的浓度。</li>
</ol>
10. 从柠檬酸盐血浆中测定中性粒细胞弹性蛋白酶
<ol>
	<li>在37 °C水浴中解冻枸橼酸盐血浆。</li>
	<li>按照制造商说明书使用多形核中性粒细胞（PMN）-弹性蛋白酶ELISA试剂盒：用试剂盒中的稀释缓冲液重悬PMN-弹性蛋白酶对照品和PMN-弹性蛋白酶标准品，以制备标准曲线。</li>
	<li>根据制造商说明稀释洗涤液。在开始检测前，将所有试剂和微孔板置于室温（RT）平衡30分钟。用稀释缓冲液将枸橼酸盐血浆样本稀释至1:100。</li>
	<li>每孔中加入100 µL样本稀释液（空白）、PMN-弹性蛋白酶标准品（15.6−1,000 ng/mL）、PMN-弹性蛋白酶对照品（高、低浓度）以及稀释后的血浆样本，每个样本设复孔。密封微孔板，在室温下轻轻振荡孵育60分钟。随后，用300 μL洗涤液洗涤4次。</li>
	<li>每孔加入150 µL酶标抗体溶液。密封微孔板，在室温下轻轻振荡孵育60分钟。随后，用300 μL洗涤液洗涤4次。</li>
	<li>每孔加入200 µL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液。密封微孔板，在避光条件下室温孵育20分钟。然后揭去封膜，每孔加入50 µL终止液。</li>
	<li>使用分光光度计在450 nm波长下读取吸光度（OD），参考波长为630 nm。将标准曲线数据拟合为趋势线，并计算样本浓度。</li>
</ol>
11. 从EDTA血浆中测定末端补体复合物（TCC）
<ol>
	<li>将EDTA血浆在37 °C水浴中解冻，解冻后置于冰上保存。</li>
	<li>按照制造商说明书使用补体级联SC5b-9 ELISA试剂盒：按说明书所述稀释洗涤液。检测开始前，将所有试剂和微孔板在室温下放置30分钟。用试剂盒提供的稀释缓冲液将EDTA血浆样本稀释至1:10。</li>
	<li>每孔加入300 µL洗涤液以润湿表面，2分钟后吸弃。每孔分别加入100 µL样本缓冲液（空白孔）、SC5b-9标准品、SC5b-9质控品（高、低浓度）以及稀释后的血浆样本，每个样本设复孔。</li>
	<li>密封微孔板，在室温下孵育60分钟。随后用300 μL洗涤液洗板5次。</li>
	<li>每孔加入50 µL酶标抗体。密封微孔板，在室温下孵育30分钟。然后用300 μL洗涤液洗板5次。</li>
	<li>每孔加入100 µL TMB底物溶液。密封微孔板，在避光条件下于室温孵育15分钟。</li>
	<li>移除密封膜，每孔加入100 µL终止液。使用分光光度计在450 nm波长处读取吸光度（OD）。根据标准曲线数据拟合趋势线，并计算各样本的浓度。</li>
</ol>
12. 从CTAD血浆中测定β-血栓球蛋白
<ol>
	<li>在37 °C水浴中解冻CTAD血浆。</li>
	<li>按照制造商说明书使用β-血栓球蛋白（β-TG）ELISA试剂盒：用提供的磷酸盐缓冲液重建β-TG对照品和β-TG标准品，并用蒸馏H2O稀释洗涤液。使用提供的磷酸盐缓冲液重建POD标记的抗体。开始检测前，将所有试剂和微孔板在室温下放置30分钟。</li>
	<li>使用提供的磷酸盐缓冲液，按照制造商说明书配制标准曲线和对照品。将CTAD血浆样本稀释至1:21。</li>
	<li>每孔分别加入200 µL磷酸盐缓冲液（空白）、β-TG标准品、β-TG对照品（高、低浓度）及稀释后的血浆样本，每个样本设复孔。密封微孔板，在室温下孵育60分钟。随后用300 μL洗涤液洗涤5次。</li>
	<li>每孔加入200 µL酶标抗体。密封微孔板，在室温下孵育60分钟。随后用300 μL洗涤液洗涤5次。</li>
	<li>每孔加入200 µL TMB底物溶液。密封微孔板，在避光条件下室温孵育5分钟。移除封板膜，每孔加入50 µL 1 M硫酸（H2SO4）终止反应。</li>
	<li>将微孔板静置15−60分钟，然后在450 nm波长下用光度计读取吸光度（OD）。将标准曲线数据拟合为趋势线，并计算样本浓度。</li>
</ol>
13. 扫描电子显微镜样品制备
<ol>
	<li>用镊子将植入物从管中取出，并在0.9% NaCl溶液中浸洗3次，每次短暂冲洗。</li>
	<li>将植入物置于戊二醛溶液（2%戊二醛溶于磷酸盐缓冲液[PBS缓冲液不含Ca2+/Mg2+]）中，4 °C下过夜保存。</li>
	<li>随后，将植入物在PBS缓冲液中孵育10分钟。依次用浓度递增的乙醇孵育10分钟进行脱水处理：40%、50%、60%、70%、80%、90%、96%和100%。将脱水后的样品保存在100%乙醇中，直至进一步分析。</li>
	<li>在进行扫描电子显微镜（SEM）观察前，按照干燥装置说明书或文献10操作，进行临界点干燥。</li>
</ol>
14. 扫描电子显微镜
<ol>
	<li>将干燥的植入物固定在扫描显微镜的样品载具上，并对样品进行金钯溅射镀膜。</li>
	<li>将镀膜后的植入物放入样品室，在100倍、500倍、1,000倍和2,500倍放大倍数下拍摄具有代表性表面及细胞黏附情况的图像。</li>
</ol>

<ol><li>ISO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biological+evaluation+of+medical+devices%22">Biological evaluation of medical devices</a>. , ISO 10993-4 (2002).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Contacting+Biomaterials%3A+In+Vitro+Evaluation+of+the+Hemocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99(2018).</li>
<li>Li, Y., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination%3A+a+key+element+in+the+interpretation+of+nanosafety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).</li>
<li>Cattaneo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+investigation+of+chemical+properties+and+biocompatibility+of+neurovascular+braided+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67(2019).</li>
<li>Stang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocompatibility+testing+according+to+ISO+10993-4%3A+discrimination+between+pyrogen-+and+device-induced+hemostatic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation.</a> Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).</li>
<li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstacles+in+haemocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica+%28Cairo%29%22%5BJournal%5D)">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica (Cairo). , 392584(2013).</li>
<li>Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+blood+flow+model+with+physiological+wall+shear+stress+for+hemocompatibility+testing-An+example+of+coronary+stent+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing.</a> Biointerphases. 11 (3), 031004(2016).</li>
<li>Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+hemocompatibility+testing%3A+The+importance+of+fresh+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood.</a> Biointerphases. 11 (2), 029802(2016).</li>
<li>Kaplan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-thrombogenic+fibrin-heparin+coating+promotes+in+vitro+endothelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).</li>
<li>JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples">https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples</a> (2019).</li>
<li>Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+hemocompatibility+and+vascular+endothelial+cell+functionality+on+titania+nanostructures+under+static+and+dynamic+conditions+for+improved+coronary+stenting+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications.</a> Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).</li>
<li>Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+novel+blood+incubation+systems+for+in+vitro+hemocompatibility+assessment+of+planar+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces.</a> The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).</li>
<li>Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+hemocompatibility+of+materials+with+arterial+blood+flow+by+platelet+functional+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Polish+Academy+of+Sciences%3A+Technical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests.</a> Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).</li>
<li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocompatibility+evaluation+of+different+silver+nanoparticle+concentrations+employing+a+modified+Chandler-loop+in+vitro+assay+on+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).</li>
<li>Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shear+rate+on+the+adhesion%2Factivation+of+human+platelets+in+flow+through+a+closed-loop+polymeric+tubular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers-a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide.</a> Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).</li>
<li>Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vitro+hemocompatibility+testing-improving+the+signal+to+noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2FBiomedizinische+Technik%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio.</a> Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).</li>
<li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platelet+accumulations+around+%22air+bubbles%22+in+blood+after+venous+air+embolism%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism.</a> International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).</li>
<li>Miller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+A%3A+Physicochemical+and+Engineering+Aspects%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).</li>
<li>van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+modified+chandler%2C+roller+pump%2C+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions%3A+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> International Journal of Biomaterials. , 673163(2012).</li>
<li>Krajewski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+thrombogenicity+and+endothelialization+of+bare+metal+and+surface-coated+neurovascular+stents%5BTitle%5D)+AND+%22AJNR+American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents.</a> AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).</li>
<li>Monnink, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon-carbide+coated+coronary+stents+have+low+platelet+and+leukocyte+adhesion+during+platelet+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation.</a> Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).</li>
<li>Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilink+stent+promotes+less+platelet+and+leukocyte+adhesion+than+a+traditional+stainless+steel+stent%3A+an+in+vitro+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study.</a> Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).</li>
<li>Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+haemodialysis+membrane+biocompatibility+by+parallel+assessment+in+an+ex+vivo+model+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).</li>
<li>Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+for+studying+the+interactions+between+human+whole+blood+and+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52112(2014).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

本方案介绍了一种在模拟人体血流的剪切流模型中，依据ISO 10993-4标准对接触血液的植入物进行血液相容性测试的全面且可靠的方法。该研究基于对激光切割神经血管植入物的测试，但该方法可适用于多种样品。结果表明，该方法能够广泛分析多项参数，包括血细胞计数、多种血液相容性标志物的表达水平，以及血液接触后对器械表面的显微观察。通过本方案，可检测不同器械在血液相容性方面的潜在差异。
体外血液相容性评估的一种替代方法是体内动物实验，后者存在多种缺点，例如由于组织损伤带来的强烈短期效应，可能导致装置相关效应的变异性更高且结果失真6。
在体外血液相容性测试中，现有三种模型：（1）静态血液孵育模型，（2）振荡血液孵育模型，以及（3）剪切流模型。静态模型通过将器械直接与血液孵育，提供了一种简单且快速评估血栓形成性的方法，但其仅能获得关于血液相容性的初步结果11。为克服静态模型的主要缺陷（即血细胞沉降和较大的空气接触表面积），可采用振荡血液孵育模型，该...

植入物和与人体血液相互作用的生物材料在体内的应用，需要进行严格的临床前测试，重点研究止血系统各种标志物的变化。国际标准化组织10993-4（ISO 10993-4）规定了对血液接触类器械（如支架和血管移植物）进行评价的核心原则，并考虑了器械的设计、临床用途以及所需材料1。
人血是一种含有多种血浆蛋白和细胞的液体，其中包括白细胞（白血球，WBCs）、红细胞（红血球，RBCs）和血小板，这些成分在人体内执行复杂的功能2异物材料与血液直接接触可能引发不良反应，例如激活免疫系统或凝血系统，从而导致炎症反应、血栓并发症以及植入后的严重问题。3,4,5因此, 体外血液相容性验证可在植入前检测并排除血液与异物表面接触后可能引发的任何血液学并发症6.
本研究建立的循环流动模型通过在管路（直径为3.2 mm）中施加150 mL/min的流速，模拟脑血流条件和动脉直径，用于评估神经血管支架及类似器械的血液相容性2,7。除了需要建立理想的体外模型外，血液来源也是分析生物材料血液相容性时获得可靠且未受干扰结果的重要因素8。采集的血液应在取样后立即使用，以避免因长期储存引起的变化。通常应使用21 G针头轻柔采血，避免血液淤滞，以最大限度减少采血过程中血小板和凝血级联反应的预先激活。此外，献血者的排除标准包括吸烟者、孕妇、健康状况不佳者，以及在过去14天内服用过口服避孕药或止痛药者。
本研究描述了一种在流动条件下对支架植入物进行广泛血液相容性测试的体外模型。在比较未涂层支架与纤维蛋白-肝素涂层支架时，综合血液相容性测试结果表明，纤维蛋白-肝素涂层支架具有更优的血液相容性9。相比之下，未涂层支架会激活凝血级联反应，表现为凝血酶-抗凝血酶III（TAT）浓度升高，以及由于血小板黏附至支架表面导致的血小板数量减少。总体而言，建议将该血液相容性模型作为临床前测试手段，以检测器械对止血系统可能引起的任何不良影响。

<table><tbody><tr><td>注射用水</td><td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td><td>1088813</td><td></td></tr><tr><td>β-血小板球蛋白 ELISA 试剂盒</td><td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td><td>00950</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Rotana 460 R 离心机</td><td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>枸橼酸钠单采血管（1.4 mL）</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>6,16,68,001</td><td></td></tr><tr><td>CTAD 单采血管（2.7 mL）</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>367562</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 单采血管（1.2 mL）</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>6,16,62,001</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 p.A.（1000 mL）</td><td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td><td>1,31,08,61,611</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛（25% 水溶液）</td><td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td><td>23114.01</td><td></td></tr><tr><td>试管肝素涂层</td><td>Ension, Pittsburgh, USA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠（25,000 IE/5 mL）</td><td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td><td>PZN 15261203</td><td></td></tr><tr><td>Multiplate Reader Mithras LB 940 多功能酶标仪</td><td>Berthold, Bad Wildbad, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠溶液</td><td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td><td>1312813</td><td></td></tr><tr><td>空白单采血管（9 mL）</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>2,10,63,001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵 ISM444B</td><td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td><td>3475</td><td></td></tr><tr><td>移液器（100 &amp;micro;L）</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>3124000075</td><td></td></tr><tr><td>移液器（1000 &amp;micro;L）</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>塑料容器（100 mL）</td><td>Sarstedt, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>7,55,62,300</td><td></td></tr><tr><td>PMN-弹性蛋白酶 ELISA 试剂盒</td><td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td><td>DEH3311</td><td></td></tr><tr><td>聚氯乙烯管</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>反应管（1.5 mL）</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>30123328</td><td></td></tr><tr><td>神经血管激光切割植入物</td><td>Acandis GmbH, Pforzheim</td><td>01-0011x</td><td></td></tr><tr><td>SC5b-9 ELISA 试剂盒</td><td>TECOmedical, Buende, Germany</td><td>A029</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>密封膜（96 孔板用）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>注射器 10/12 mL Norm-Ject</td><td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td><td>10080010</td><td></td></tr><tr><td>TAT 微量试剂盒</td><td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td><td>OWMG15</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅 Type 1083</td><td>Gesellschaft f&amp;uuml;r Labortechnik, Burgwedel, Germany</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

模拟人体血流的循环流动模型中血液接触型植入物的血液相容性测试

血液相容性测试，植入物，体外循环模型，血流动力学，溶血，血小板活化，凝血功能，白细胞反应，补体激活，血栓形成

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

医疗设备（如血管移植物、支架和心脏导管）在体内循环系统中用于临时或永久性植入的情况日益增多，这要求采用一种可靠且多参数的方法，以评估这些设备可能引起的血液学并发症（即血液成分的激活与破坏）。对接触血液的植入物进行全面的体外血液相容性测试，是实现其成功体内应用的第一步。因此，在临床应用前，必须依据国际标准化组织10993-4（ISO 10993-4）标准进行广泛的分析。本文介绍的流动回路描述了一种灵敏的模型，用于分析支架（本例为神经血管支架）的止血性能，并揭示其不良影响。使用新鲜的人全血以及轻柔的采血方式至关重要，以避免血液在实验前被激活。血液在37 °C条件下，以每分钟150 mL的流速，通过蠕动泵驱动，在含肝素涂层管路及测试样品的回路中灌注60分钟。在灌注前后，检测血液学指标（即血细胞计数、血红蛋白、红细胞压积以及血浆标志物），以评估白细胞（多形核中性粒细胞[PMN]-弹性蛋白酶）、血小板（β-血小板球蛋白[β-TG]）、凝血系统（凝血酶-抗凝血酶III复合物[TAT]）以及补体级联反应（SC5b-9）的激活情况。综上所述，我们提出了一种在临床应用前对支架及其他接触血液的医疗器械进行广泛血液相容性评价所必需且可靠的模型。

简要总结，采集含肝素的单支采血管中的人全血，混匀后用于评估细胞计数的基线水平以及血浆中血液相容性标志物。
随后，使用蠕动泵以150 mL/min的流速和37 °C的温度，向含有神经血管植入物样品的管路中灌注血液，并持续灌注60分钟。再次对所有组别的细胞数量进行分析，并制备血浆样本用于ELISA检测（图1）。所有样品类型及对照组的血细胞数量和血液参数（如血红蛋白和红细胞压积）均在采血后立即以及在流动回路模型中灌注后直接进行定量分析。结果显示，白细胞数量（图2A）、红细胞数量（图2B）以及红细胞压积值（图2C）在各组间均未检测到显著变化。然而，与基线值相比，在流动回路模型中孵育血液后检测到血红蛋白水平下降，该变化归因于血液在流动回路系统中的灌注过程（...

本方案描述了使用激光切割神经血管植入物对血液接触类器械进行全面血液相容性评价的方法。采用新鲜肝素化人血构建循环流动模型以模拟血液流动。灌注后，分析多种血液学指标，并与采血后立即测得的数值进行比较，以评估被测器械的血液相容性。

医疗设备（如血管移植物、支架和心脏导管）在临时或永久留置体内的应用日益增多，这些设备在...

本方案根据国际标准化组织（ISO）指南，提出了一种用于评估血液接触类器械血液相容性的模型。该模型能够很好地模拟与植入物相对应的生理条件，因其血栓事件背景值低且抗凝剂浓度低，可实现对血液参数的广泛分析。该方法适用于生物材料研究，因其为血液相容性评价提供了一种简便的途径。此外，该方法还可用于临床前研究。肝素加载步骤如下：首先，将 5,000 国际单位的未稀释肝素与 0.9% 氯化钠溶液混合，配制成浓度为每毫升 15 国际单位的肝素溶液。随后，将 900 微升稀释后的肝素溶液分别加入每位供体的三个中性采血管和三个预留采血管中，并将加载肝素的采血管置于 4°C 下保存。在采集血样前30分钟，将单用采血管置于室温下。当单用采血管恢复至室温后，从每位供体采集9毫升血液，分别加入三个单用采血管中，随后将每位供体的27毫升血液全部汇集至一个塑料容器中。为准备流动回路，每种实验条件至少使用一根装有目标神经血管激光切割植入物的导管，并将每根导管的一端放入盛有0.9%氯化钠溶液的储液器中。将未装液的管路放入储液槽中，并将所有管路连接到泵头。然后将每根管路的另一端插入量筒中，使用计时器监测量筒内的液位，调节蠕动泵的设置，使流速达到 150 毫升/分钟。进行血液相容性测试时，使用 12 毫升注射器向每根管路中注入 6 毫升血液。形成回路后，使用一段0.5厘米长的硅胶连接管将导管紧密封闭，并将导管置于37摄氏度水浴中。随后开始计时60分钟。进行全血细胞计数分析时，向含有EDTA的单个采血管中加入1.2毫升未灌注的血液，或在灌注结束后从每根导管中各取1.2毫升血液加入。轻轻将单管倒置5次，并将样品管装入血细胞分析仪，对每个样品进行血常规分析。分析结束后，将单管置于冰上静置15–60分钟。对于枸橼酸盐血浆的采集，使用含枸橼酸盐的单管加入1.4 mL未灌注或已灌注的血液，并轻轻将每支单管倒置5次。通过离心分离血浆，并将血浆组分分装为三份，每份250微升，分别转移至独立的1.5毫升反应管中。随后将血浆样本在液氮中速冻，并于-20摄氏度保存直至分析。对于EDTA血浆的采集，在完成血液计数测定后的4摄氏度孵育步骤后，通过离心分离血浆，并将血浆组分分装为三份，每份250微升，分别转移至独立的1.5毫升反应管中。然后将血浆样品在液氮中冷冻，以用于-20摄氏度保存。对于CTAD血浆采集，用2.7毫升新鲜抽取或灌注的血液填充含CTAD的单采血管，并轻轻颠倒混匀5次。将单采血管置于冰上15至60分钟，然后通过离心收集血浆。将每份中段血浆组分各700微升转移至各自的1.5毫升反应管中，并将装有样品的反应管再次离心。然后，将中段组分分别取两份100微升的等分试样转移至各自的1.5毫升反应管中，并用液氮速冻，随后于-20摄氏度保存。为测定枸橼酸盐血浆样本中的TAT水平，向96孔平底板的每个孔中加入50微升ELISA样本稀释液，并将血浆标准品、血浆对照品及未稀释的血浆样本各50微升，以复孔形式分别加入板中相应的孔内。封板后，在37摄氏度下轻轻振荡孵育样品15分钟。孵育结束后，每孔加入300微升洗涤液，洗涤3次，然后每孔加入100微升辣根过氧化物酶标记的抗人TAT抗体。在37摄氏度下振荡孵育15分钟后，每孔用300微升新鲜洗涤液再洗涤3次。最后一次洗涤后，每孔加入 100 微升新配制的显色剂溶液，在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，每孔加入 100 微升终止液，并使用标准曲线数据作为趋势线，在分光光度计上于 490 至 500 纳米波长处测定各孔的光密度，以计算各样品的 TAT 浓度。为准备扫描电子显微镜观察，用镊子将植入物从试管中取出，并用新鲜的 0.9% 氯化钠溶液每次洗涤，每植入物快速冲洗三次。最后一次洗涤后，将植入物置于不含钙和镁的 PBS 中含 2% 戊二醛的独立容器内，4 摄氏度下保存过夜。次日早晨，在脱水前将植入物放入 PBS 独立容器中孵育 10 分钟，随后按所示浓度梯度用乙醇进行脱水处理，每个浓度处理 10 分钟。在采血和灌注后立即检测，未发现白细胞或红细胞数量以及血细胞比容值发生变化。然而，在灌注循环系统内灌注后，可检测到血红蛋白水平下降。血小板数量也出现减少，当管路中存在未涂层支架时，血小板减少更为明显。值得注意的是，当血液与纤维蛋白-肝素涂层支架共同孵育时，这种减少现象得到缓解。在灌注作用下，TAT 复合物浓度轻度升高。然而，当植入裸金属支架时，检测到 TAT 显著增加，表明凝血系统被强烈激活。使用纤维蛋白-肝素涂层支架可防止此种激活。灌注导致补体级联反应的活化程度增加，而这种活化不受未涂层支架或纤维蛋白-肝素涂层支架存在的影响。同样，中性粒细胞也被激活，这通过多形核中性粒细胞弹性蛋白酶水平的定量结果得以证实。扫描电子显微镜观察显示，灌注后未涂层支架表面存在密集的血细胞和蛋白质网络，而在纤维蛋白-肝素涂层支架上则未观察到该现象。确认血液符合样本采集的纳入标准，并尽快使用 freshly drawn blood 至关重要。人血可能含有经血传播的病毒及其他病原体，具有感染风险，因此在处理样本时务必始终穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

hemocompatibility-testing-blood-contacting-implants-flow-loop-model

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

流循环模型中血液接触植入物的血液相容性测试模拟人类血流

一种在具有微血管尺寸通道的微流控装置整个内部三维表面培养内皮细胞单层的方法&lt;30 μm）被描述。 这一 体外...

用于研究血液系统疾病中微血管相互作用的内皮化微流控技术

血液接触聚合物血流导管会引发异物反应，这种反应与临床并发症有关。本文介绍了钱德勒循环装置（Chandler Loop...

使用Ex Vivo Chandler环路装置评估改性聚合物血液导管的生物相容性

可靠的人类血管血液相互作用研究模型尚且缺乏。我们提出一种 体外...

一种新型方法 体外 研究人全血与内皮相互作用的模型

此处，我们介绍一种可用于评估白细胞募集动态的实验方案 离体...

在流动条件下评估白细胞-内皮细胞相互作用 离体 自动灌流微流控腔室检测法

该方案可模拟生理或病理条件下的血流 体外...

体外 生理与病理血流模型及其在血管细胞重塑研究中的应用

采用血液重建和微流控流动腔模拟血小板输注与止血过程，以研究血液库保存血小板的功能。体外实验数据展示了血小板储存损伤对止血功能的影响。...

使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 In Vitro

血管壁损伤或炎症期间，白细胞会积极地与血管细胞和血小板相互作用。本文介绍一种基于层流的简便检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。...

基于层流的检测方法用于研究白细胞在培养的血管细胞和黏附血小板上的募集作用

我们提出一种体外血管疾病模型，用于研究全血与患者来源内皮细胞的相互作用。该系统可在不同条件下研究原代内皮细胞的血栓形成特性。该方法特别适用于评估凝血不同阶段的原位血栓形成能力及抗凝治疗效果。...

用于实时研究全血-内皮相互作用与血凝块动态的体外微流控疾病模型

本文介绍了一种标准化的体外血液动力学回路模型的实验方案。该模型可用于检测灌注管路或血管支架的血液相容性，以符合ISO（国际标准化组织）10993-4标准的要求。...

一种用于研究血管医疗器械血液相容性及宿主细胞激活的体外血流动力学回路模型

从分离的植入物中提取细胞，并通过流式细胞术对其进行表征，可显著促进对植入物免疫应答模式的理解。本文描述了一种从分离的植入物中精确分离细胞并进行染色以用于流式细胞分析的方法。...

高维流式细胞术用于分离的植入物组织免疫功能分析

本文介绍了一种用于构建模拟肺切除术的器官芯片（OOC）系统的实验方案。该系统旨在研究糖萼损伤与肺切除术后并发症之间可能存在的关联。...

在三维流体芯片中模拟肺叶切除术后血管内皮糖萼——一种基于血管的器官芯片系统的构建方法

学习使用流循环模型评估血液接触植入物的血液相容性，该模型采用新鲜肝素化人血模拟人体生理条件。此方法为生物材料研究和临床前研究提供可靠的评估手段。

模拟人体血流的循环流动模型中血液接触型植入物的血液相容性测试血液相容性测试，植入物，体外循环模型，血流动力学，溶血，血小板活化，凝血功能，白细胞反应，补体激活，血栓形成

探索更多视频

模拟人体血流的循环流动模型中血液接触型植入物的血液相容性测试 血液相容性测试，植入物，体外循环模型，血流动力学，溶血，血小板活化，凝血功能，白细胞反应，补体激活，血栓形成

探索更多视频

模拟人体血流的循环流动模型中血液接触型植入物的血液相容性测试血液相容性测试，植入物，体外循环模型，血流动力学，溶血，血小板活化，凝血功能，白细胞反应，补体激活，血栓形成