模拟人体血流的循环流动模型中血液接触型植入物的血液相容性测试 血液相容性测试，植入物，体外循环模型，血流动力学，溶血，血小板活化，凝血功能，白细胞反应，补体激活，血栓形成

本方案根据国际标准化组织（ISO）指南，提出了一种用于评估血液接触类器械血液相容性的模型。该模型能够很好地模拟与植入物相对应的生理条件，因其血栓事件背景值低且抗凝剂浓度低，可实现对血液参数的广泛分析。该方法适用于生物材料研究，因其为血液相容性评价提供了一种简便的途径。

此外，该方法还可用于临床前研究。肝素加载步骤如下：首先，将 5,000 国际单位的未稀释肝素与 0.9% 氯化钠溶液混合，配制成浓度为每毫升 15 国际单位的肝素溶液。随后，将 900 微升稀释后的肝素溶液分别加入每位供体的三个中性采血管和三个预留采血管中，并将加载肝素的采血管置于 4°C 下保存。

在采集血样前30分钟，将单用采血管置于室温下。当单用采血管恢复至室温后，从每位供体采集9毫升血液，分别加入三个单用采血管中，随后将每位供体的27毫升血液全部汇集至一个塑料容器中。为准备流动回路，每种实验条件至少使用一根装有目标神经血管激光切割植入物的导管，并将每根导管的一端放入盛有0.9%氯化钠溶液的储液器中。

将未装液的管路放入储液槽中，并将所有管路连接到泵头。然后将每根管路的另一端插入量筒中，使用计时器监测量筒内的液位，调节蠕动泵的设置，使流速达到 150 毫升/分钟。进行血液相容性测试时，使用 12 毫升注射器向每根管路中注入 6 毫升血液。

形成回路后，使用一段0.5厘米长的硅胶连接管将导管紧密封闭，并将导管置于37摄氏度水浴中。随后开始计时60分钟。进行全血细胞计数分析时，向含有EDTA的单个采血管中加入1.2毫升未灌注的血液，或在灌注结束后从每根导管中各取1.2毫升血液加入。

轻轻将单管倒置5次，并将样品管装入血细胞分析仪，对每个样品进行血常规分析。分析结束后，将单管置于冰上静置15–60分钟。对于枸橼酸盐血浆的采集，使用含枸橼酸盐的单管加入1.4 mL未灌注或已灌注的血液，并轻轻将每支单管倒置5次。

通过离心分离血浆，并将血浆组分分装为三份，每份250微升，分别转移至独立的1.5毫升反应管中。随后将血浆样本在液氮中速冻，并于-20摄氏度保存直至分析。对于EDTA血浆的采集，在完成血液计数测定后的4摄氏度孵育步骤后，通过离心分离血浆，并将血浆组分分装为三份，每份250微升，分别转移至独立的1.5毫升反应管中。

然后将血浆样品在液氮中冷冻，以用于-20摄氏度保存。对于CTAD血浆采集，用2.7毫升新鲜抽取或灌注的血液填充含CTAD的单采血管，并轻轻颠倒混匀5次。将单采血管置于冰上15至60分钟，然后通过离心收集血浆。

将每份中段血浆组分各700微升转移至各自的1.5毫升反应管中，并将装有样品的反应管再次离心。然后，将中段组分分别取两份100微升的等分试样转移至各自的1.5毫升反应管中，并用液氮速冻，随后于-20摄氏度保存。为测定枸橼酸盐血浆样本中的TAT水平，向96孔平底板的每个孔中加入50微升ELISA样本稀释液，并将血浆标准品、血浆对照品及未稀释的血浆样本各50微升，以复孔形式分别加入板中相应的孔内。

封板后，在37摄氏度下轻轻振荡孵育样品15分钟。孵育结束后，每孔加入300微升洗涤液，洗涤3次，然后每孔加入100微升辣根过氧化物酶标记的抗人TAT抗体。在37摄氏度下振荡孵育15分钟后，每孔用300微升新鲜洗涤液再洗涤3次。

最后一次洗涤后，每孔加入 100 微升新配制的显色剂溶液，在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，每孔加入 100 微升终止液，并使用标准曲线数据作为趋势线，在分光光度计上于 490 至 500 纳米波长处测定各孔的光密度，以计算各样品的 TAT 浓度。为准备扫描电子显微镜观察，用镊子将植入物从试管中取出，并用新鲜的 0.9% 氯化钠溶液每次洗涤，每植入物快速冲洗三次。

最后一次洗涤后，将植入物置于不含钙和镁的 PBS 中含 2% 戊二醛的独立容器内，4 摄氏度下保存过夜。次日早晨，在脱水前将植入物放入 PBS 独立容器中孵育 10 分钟，随后按所示浓度梯度用乙醇进行脱水处理，每个浓度处理 10 分钟。在采血和灌注后立即检测，未发现白细胞或红细胞数量以及血细胞比容值发生变化。

然而，在灌注循环系统内灌注后，可检测到血红蛋白水平下降。血小板数量也出现减少，当管路中存在未涂层支架时，血小板减少更为明显。值得注意的是，当血液与纤维蛋白-肝素涂层支架共同孵育时，这种减少现象得到缓解。

在灌注作用下，TAT 复合物浓度轻度升高。然而，当植入裸金属支架时，检测到 TAT 显著增加，表明凝血系统被强烈激活。使用纤维蛋白-肝素涂层支架可防止此种激活。

灌注导致补体级联反应的活化程度增加，而这种活化不受未涂层支架或纤维蛋白-肝素涂层支架存在的影响。同样，中性粒细胞也被激活，这通过多形核中性粒细胞弹性蛋白酶水平的定量结果得以证实。扫描电子显微镜观察显示，灌注后未涂层支架表面存在密集的血细胞和蛋白质网络，而在纤维蛋白-肝素涂层支架上则未观察到该现象。

确认血液符合样本采集的纳入标准，并尽快使用 freshly drawn blood 至关重要。人血可能含有经血传播的病毒及其他病原体，具有感染风险，因此在处理样本时务必始终穿戴适当的个人防护装备（PPE）。