Name: 微流体流钱伯斯再造使用血止血建模和血小板输注体外 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 了解如何使用微流体流室和血液重组技术模拟血小板输注过程，在胶原蛋白表面评估止血功能。该方法可实时监测血小板与胶原的相互作用，为输血医学和血栓研究提供重要的体外评估工具。

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作者没有致谢。

本方案遵循机构关于人体样本研究的伦理准则，并已获得所有供体的知情同意。本研究所述实验已获得安特卫普大学医院机构审查委员会的批准。
注：温度指示均为室温，除非另有说明。
1. 准备流动腔装置
<ol>
	<li>准备通道、管路和插针
	<ol>
		<li>剧烈涡旋混匀胶原蛋白悬浮液，并用供应商提供的等渗葡萄糖溶液稀释至20倍，最终浓度为50 µg/ml。 
		注：我们使用马腱来源的胶原蛋白，主要由I型纤维组成。这种马源I型胶原蛋白常被称为“Horm”胶原蛋白，由于历史和生物学原因，已成为此类检测的金标准9。也可使用人III型胶原蛋白，但其纤维在表面包被效果较差，且血小板反应较弱。其他包被表面也可使用，例如血管性血友病因子（VWF）、纤维蛋白原、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、血小板反应蛋白-1，或这些蛋白的组合16。</li>
		<li>从供应商容器中取出一个新的一次性生物芯片。本实验所用生物芯片的尺寸为0.4W × 0.1H × 20L mm3。</li>
		<li>将0.8 µl胶原包被液从芯片一端加入微流控生物芯片的通道中，并标记为出口端。确保通道中有5/6长度被步骤1.1.1制备的含胶原包被液填充，避免产生气泡。 
		注：通道部分包被可防止胶原纤维在通道入口处积聚（见讨论部分）。</li>
		<li>在加湿密闭容器中4 °C孵育4小时或过夜。</li>
		<li>在芯片另一端加入封闭缓冲液（1.0% (w/v) 牛血清白蛋白和0.1% (w/v) 葡萄糖溶于10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲盐水（HBS；0.9% (w/v) NaCl，pH 7.4）），并标记为入口端，以封闭已包被的通道。确保通道完全充满封闭缓冲液，避免气泡产生。</li>
		<li>将管路剪成相同长度（12 cm）。每条通道使用一根管路，并将每根管路连接一个插针。例如，若需平行比较两种条件并设两个重复，则需准备四段管路和四个插针。</li>
		<li>使用注射器和26 G针头或配套连接件，用蒸馏水冲洗管路。</li>
		<li>用封闭缓冲液饱和管路。置于密闭加湿容器中，至少孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备泵和多通路装置
	<ol>
		<li>用蒸馏水冲洗泵和多通路装置，并去除气泡。</li>
		<li>在出口端使用固定的10 µl吸头将生物芯片通道中的封闭缓冲液吸出。用无尘精密擦拭纸和变性酒精清洁芯片表面，以去除指纹和灰尘。</li>
		<li>将生物芯片固定在自动显微镜载物台上。若一次运行中同时使用多个通道，则将八通道多通路分流器连接至生物芯片出口端。 
		注：八通道多通路分流器是一种硬件装置（图S1），连接泵与生物芯片。它可控制生物芯片上所有可用通道（共八个），或根据配套软件中操作者自定义的组合选择部分通道运行。</li>
		<li>将带插针的管路插入生物芯片入口端，另一端（无插针）插入含有HBS的1.5 ml锥形离心管中。通过泵使用1 ml HBS冲洗所有管路及其连接的通道，以去除残留的封闭缓冲液及未牢固结合的胶原蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 血液样本的制备
<ol>
	<li>健康志愿者新鲜全血的采集与分离17
	<ol>
		<li>使用含乙二胺四乙酸（EDTA）作为抗凝剂的真空采血管收集最初几毫升血液，并仅将此样本用于全自动血液分析仪进行全血细胞计数（CBC）。</li>
		<li>使用真空采血管采集适量血液，所用抗凝剂需适宜。进行流室实验时，若研究方案不涉及纤维蛋白形成，则标准抗凝剂为肝素或水蛭素；若涉及纤维蛋白形成，则使用枸橼酸钠。 
		注：结果中描述的所有实验均使用肝素作为抗凝剂。 
		注：血液用量取决于需进行的实验数量，每3个通道约需1管（7 ml）。</li>
		<li>将试管置于旋转仪上，等待血液重组。 
		注意：该检测应在采血后3小时内完成。</li>
		<li>离心15分钟，250 g，以制备富血小板血浆（PRP）。请勿使用离心机刹车，以免扰动松散的沉淀物。
		<ol>
			<li>若采集了多个试管，则将血液汇集至一个锥形离心管中。 
			注意：离心速度或时间可根据富血小板血浆（PRP）的得率和差异细胞分离情况进行适当调整。 &#34;污染&#34; 首选。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>移除并弃去富含血小板血浆和白膜层，得到含少量血小板的浓缩红细胞。 
		注：浓缩红细胞组分中的血小板计数为13 &#177;5 × 103 每 &#181;l（均值 &#177;SD，n = 12）在我们实验室的平均结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血液重组
	<ol>
		<li>在37℃下解冻AB血型（RhD阴性）血浆 &#176;4 ml 样品在 C 条件下离心 5 分钟 20 秒。</li>
		<li>使用自动化血液分析仪测定在2.1.5中制备的浓缩红细胞的血细胞比容。</li>
		<li>测定将用于重组上述红细胞组分的血库制备血小板浓缩液中的血小板浓度。</li>
		<li>计算将产生 40% 血细胞比容和 250 × 10⁹/L 血小板浓度的浓缩红细胞和血小板悬液的体积&#179; 血小板&#181;1 ml 样品中。 
		注：可根据研究方案任意设定其他目标细胞滴度。</li>
		<li>使用剪去尖端的移液器吸头将浓缩红细胞和血浆转移至新的离心管中，并加入血小板浓缩液，直至样品体积达到1 ml。 
		注意：根据所研究的变量，所有重组样本中的血浆组分应保持一致，因为血浆对血栓形成速率具有显著影响。例如，反复冻融、来自不同供体的血浆或使用不同抗凝剂采集的血浆均可能影响实验结果。</li>
		<li>轻柔倒置混匀重组血液，并进行全血细胞计数。</li>
		<li>准备一个 &#34;空白&#34; 对照样品中，用相同体积的0.9%（m/v）氯化钠水溶液替代血小板组分体积，以测定内源性血小板的浓度（即 使用全血细胞计数（CBC）测定再构成血液中的非血库血小板（non-blood bank platelets）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标记
	<ol>
		<li>将1 ml重悬血液移液至含有1的试管中 &#181;l 5 mM Calcein AM (5 &#181;M 最终浓度） 
		注：可使用其他细胞染料14.</li>
		<li>轻轻翻转混匀。</li>
		<li>37℃孵育5分钟 &#176;使用前置于 C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 灌注实验
<ol>
	<li>将物镜对准通道底部附着的胶原纤维。理想情况下，使用相差或微分干涉差（DIC）模式进行对焦。在实验软件中选择“为选定的拼接区域设置当前Z值”，以数字方式固定选定的Z位置。</li>
	<li>在显微镜实验软件中选择通道内将被记录的感兴趣区域（ROI，xy平面）。 
	注意：ROI可任意选择灌注通道内的任意表面积。建议避免在通道的入口和出口附近分析血小板聚集体形成，以规避该区域流场分布不均可能带来的副作用，尽管这种影响相对较小。ROI的表面积应包含足够数量的血小板或血栓，以确保信号的稳定性。在本方案中，ROI为三个并列、大小相等的图像经数字拼接而成，总面积为0.62 mm2，位于2 cm长通道的中央区域。</li>
	<li>轻轻翻转混匀样品，并将样品管置于生物芯片旁的自动载物台上。</li>
	<li>将连接生物芯片入口的管路插入盛有再悬浮血液样品的试管中。</li>
	<li>通过泵的软件，对连接盛有再悬浮血液样品试管的通道，以50 dyne/cm2（或其他所需剪切应力）启动泵。 
	注意：可根据需要使用其他剪切应力。</li>
	<li>使用显微镜的图像采集与实验软件，每15秒实时记录一次图像，持续5分钟。 
	注意：可根据实验设计采用其他时间序列。 
	注意：我们通常使用100倍放大倍数（10倍物镜和10倍目镜），但也可根据需要使用更高或更低的放大倍数。</li>
</ol>
4. 洗脱
<ol>
	<li>使用蒸馏水冲洗连接至出口并连接到多通道歧管或泵的所有管路，随后用0.5% (v/v) 次氯酸钠（漂白剂）冲洗，最后用0.1 M NaOH水溶液冲洗。将固定在生物芯片入口处的管路作为危险废物丢弃。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用图像分析软件确定血栓生长动力学。以下命令针对 ZEN2012 软件。
	<ol>
		<li>打开插件图像分析，以确定血小板的表面覆盖面积。</li>
		<li>在分析交互选项卡中设置荧光阈值，以定义与阳性信号相关的像素强度，即已黏附的血小板或正在黏附的血小板。</li>
		<li>使用创建表格功能自动生成一个电子表格，其中将包含那些信号强度介于所选阈值之间的“对象”各自的表面积（单位：µm2）。此步骤需对每个时间点分别进行。 
		注意：一旦选定荧光阈值，分析软件将自动识别视野中符合标准的“对象”。这些对象包括血栓、小型血小板聚集体或单个血小板，其覆盖一定数量的像素。每个对象将在电子表格中单独列出。</li>
		<li>将这些电子表格以 xml 格式保存，并在电子表格程序中打开以进行后续计算。</li>
		<li>将所选对象的表面积求和，再除以测量区域的总面积（µm2），得到相对表面覆盖率（%）。对每个时间点均执行此计算。</li>
		<li>以灌注时间为横坐标绘制表面覆盖率曲线，并通过线性回归计算斜率，从而获得该特定条件下的血栓生长动力学参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+at+work+in+primary+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelets at work in primary hemostasis.</a> Blood Rev. 25, 155-167 (2011).</li>
<li>Stalker, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+in+the+hemostatic+response+and+its+relationship+to+the+platelet-signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network.</a> Blood. 121, 1875-1885 (2013).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+platelet+adhesion+to+artery+subendothelium+is+mediated+by+factor+VIII-Von+Willebrand+factor+bound+to+the+subendothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium.</a> Nature. 279, 636-638 (1979).</li>
<li>Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+platelet+adhesion+by+arrest+onto+fibrinogen+or+translocation+on+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor.</a> Cell. 84, 289-297 (1996).</li>
<li>Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+in+vitro+thrombus+formation+with+novel+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices.</a> Platelets. 23, 501-509 (2012).</li>
<li>Varga-Szabo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+sensor+STIM1+is+an+essential+mediator+of+arterial+thrombosis+and+ischemic+brain+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction.</a> J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).</li>
<li>Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hemostasis+in+flowing+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hemostasis in flowing blood.</a> Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).</li>
<li>Roest, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber-based+assays+to+measure+thrombus+formation+in+vitro%3A+requirements+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).</li>
<li>Heemskerk, J. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+surfaces+to+measure+thrombus+formation+under+flow%3A+possibilities+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).</li>
<li>Shrivastava, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+platelet+storage+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">The platelet storage lesion.</a> Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).</li>
<li>Miyaji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+platelet+aggregation+of+platelet+concentrate+during+storage+recovers+in+the+body+after+transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion.</a> Transfusion. 44, 891-899 (2004).</li>
<li>Goodrich, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+in+vitro+platelet+quality+measurements+with+in+vivo+platelet+viability+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects.</a> Vox Sang. 90, 279-285 (2006).</li>
<li>Van Aelst, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboflavin+and+amotosalen+photochemical+treatments+of+platelet+concentrates+reduce+thrombus+formation+kinetics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro.</a> Vox Sang. 108, 328-339 (2015).</li>
<li>Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+c+light+pathogen+inactivation+treatment+of+platelet+concentrates+preserves+integrin+activation+but+affects+thrombus+formation+kinetics+on+collagen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro.</a> Transfusion. , (2015).</li>
<li>de Witt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+platelet+function+defects+by+multi-parameter+assessment+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation.</a> Nat Commun. 5, 4257(2014).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+platelet+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Dynamics of platelet thrombus formation.</a> J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).</li>
<li>Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+randomized+trial+of+a+prophylactic+platelet+transfusion+trigger+of+10+x+10%289%29+per+L+versus+30+x+10%289%29+per+L+in+allogeneic+hematopoietic+progenitor+cell+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients.</a> Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).</li>
<li>Neeves, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+variability+in+platelet+accumulation+on+type+1+fibrillar+collagen+in+microfluidic+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one+%22%5BJournal%5D)">Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays.</a> PloS one . 8, e54680(2013).</li>
<li>Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+blood+platelets+by+adenosine+diphosphate+and+its+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.</a> Nature. 194, 927-929 (1962).</li>
<li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+Standardization+of+Light+Transmission+Aggregometry%3A+A+Consensus+of+the+Working+Party+from+the+Platelet+Physiology+Subcommittee+of+SSC%2FISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH.</a> J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).</li>
<li>Deckmyn, H., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+quality+control+of+platelets+for+transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22ISBT+Sci+Series%22%5BJournal%5D)">Assays for quality control of platelets for transfusion.</a> ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulants+%28thrombin+inhibitors%29+and+aspirin+synergize+with+P2Y12+receptor+antagonism+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis.</a> Circulation. 108, 2697-2703 (2003).</li>
<li>Casari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor+mutation+promotes+thrombocytopathy+by+inhibiting+integrin+alphaIIbbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3.</a> J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).</li>
<li>Gitz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+platelet+survival+after+cold+storage+by+prevention+of+Glycoprotein+Ib%CE%B1+clustering+in+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts.</a> Haematologica. , (2012).</li>
<li>Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Quality+Testing+of+Blood+Platelet+Transfusions+with+Dynamic+Light+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Part+Syst+Char%22%5BJournal%5D)">Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering.</a> Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+2%3A+current+methods+and+considerations+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future.</a> J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).</li>
<li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+1%3A+Biorheologic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations.</a> J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

微流控流动腔实验是研究流动血液中血小板功能的优秀工具，可用于评估止血功能 体外 在不同的实验背景下。尽管实验室间的标准化程度较差9我们证明，在本实验室条件下，实验变异在可接受范围内，从而能够可靠地比较同一研究中的（配对）样本。这一结论通过已充分记录的血小板储存损伤现象进行了验证，后者是指在血库储存条件下血小板发生的有害变化11此外，我们近期发表了关于三种现有的病原体灭活技术对经血液重组后PC血小板在微流控流动腔中功能影响的研究。14,15.
当生物物理和生物化学参数发生变化时，血小板的反应也各不相同20。因此，可根据具体的研究问题，在本方案中调整剪切应力、细胞数量和细胞组成、温度、包被条件、抗凝剂以及许多其他因素。本方案仅使用 commercially available 硬件和软件工具，以便其他实验室能够执行类似的检测。对于基础研究而言，这可能是一个劣势，特别是因为现有硬件的灵活性不如定制装置。该检测本身具有较强的稳健性，但其可重复性会受到生物学和时间变异的影响。因此，实验样...

止血需要细胞、蛋白质、离子和组织在特定的时空范围内协同并受调控地发挥作用1不受控的活性可能导致一系列与血液凝固相关疾病的出血或血栓形成，进而引发发病或死亡。微流控流动腔实验是一种模拟止血过程的具有挑战性的技术。 体外该方法可用于研究止血过程中各种复杂相互作用，其中血小板发挥主导作用。
血管损伤后，血小板会黏附于暴露的内皮下基质（糖）蛋白，以防止血液流失。黏附后，血小板在自分泌和旁分泌信号的刺激下被激活并发生聚集，最终形成由纤维蛋白稳定、牢固封闭伤口的血小板网络，即血栓2。与其他大多数血小板功能检测方法不同，流动腔实验考虑了血流的物理参数，因而能够反映流变学对参与细胞及生物分子的影响3,4。
通过改变影响止血（亚）过程的关键参数，如黏附基质、流变学和流动轮廓、细胞组成、毒素或药物的存在、离子强度等，流动腔实验在止血与血栓形成研究中取得了里程碑式的科学发现5。在过去二十年中，传统的低通量流动腔实验需要大量样本体积（10–100 ml），现已发展为微流控腔室，通常由小型平行板腔构成，并结合现代技术，可在受控的管壁剪切条件下灌注全血。微缩化显著提高了检测通量，主要原因是硬件设置更简化，且所需（血液）体积更少，使实验更具可及性和灵活性。例如，现在可使用小型实验动物的血液，而无需牺牲动物。经基因修饰小鼠的血样因此有助于识别促进或抑制止血的关键分子，并推动了新颖的基础科学认知6。
专业的研究实验室通常仍在使用定制的流动腔室，例如由聚二甲基硅氧烷（PDMS）7 制成的腔室，该材料可在光刻模具上聚合，而模具设计可通过软件进行蓝图绘制。所得到的腔室成本低廉、可一次性使用，并且便于拆卸以进行事后分析。此外，基本上任何结构的通道设计，包括分叉或急转弯，都可以按需构建。这一优势同时也带来了缺点，因为标准化原本就是流动腔室实验的主要问题，而定制的PDMS腔室并未对此有所帮助。除此之外，包被条件、荧光探针、抗凝剂、采样与分析之间的时间以及温度等因素也均缺乏良好标准化8。尽管对这些变量进行标准化具有挑战性，但为了实现不同实验室之间结果的可比性，标准化仍是必不可少的。该议题是国际血栓与止血学会生物流变学科学与标准化分会委员会的主要研究主题9,10。
血小板浓缩物（PC）被用于治疗因多种疾病导致血小板减少和/或出血的患者。但已知PC中的血小板会随着时间延长而发生功能脱敏，这一与老化相关的退化过程通常被称为血小板储存损伤11。有时人们认为这些血小板在输注后可在循环系统中恢复功能12，但支持这一观点的证据十分有限。此外，由于现有检测方法与治疗或预防效果之间的关系尚不明确13，临床上并未常规检测构成PC的血小板功能。微流控流动腔技术为研究PC中血小板功能提供了手段，有助于优化从采集到发放之间的操作流程。该技术是一种强大的研究工具，可用于对PC进行直接（配对）比较，我们此前已发表相关研究14,15，本文将对此进行描述。

<table><tbody><tr><td>含EDTA的BD真空采血管&amp;nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>含肝素的BD真空采血管</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>含枸橼酸钠的BD真空采血管</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>水蛭素血液采血管</td><td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>BD真空采血Eclipse系统</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368650</td><td>带预装持针器的采血针</td></tr><tr><td>移液器吸头 100–1,000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 2–200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 1–10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>5 ml离心管</td><td>Simport</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>15 ml锥形离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml锥形离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 ml注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>精密擦拭纸</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ 生物芯片</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>在&lt;strong&gt;图S1&lt;/strong&gt; A中称为“生物芯片”</td></tr><tr><td>Vena8管路</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>在&lt;strong&gt;图S1&lt;/strong&gt; B中称为“一次性管路”</td></tr><tr><td>Vena8针头</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>在&lt;strong&gt;图S1&lt;/strong&gt; B中称为“针销”</td></tr><tr><td>生物芯片单入口连接器</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8连接器</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>在&lt;strong&gt;图S1&lt;/strong&gt; B中称为“可重复使用管路”和“分流器”</td></tr><tr><td>加湿盒</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>微流控泵软件</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux检测软件</td></tr><tr><td>Horm胶原</td><td>Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>天然马肌腱胶原（I型）&lt;br/&gt; 用等渗葡萄糖溶液稀释胶原</td></tr><tr><td>HEPES缓冲盐水（HBS）</td><td>实验室自制</td><td>实验室自制</td><td>10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲盐水（0.9% (w/v) NaCl，pH 7.4）</td></tr><tr><td>封闭缓冲液</td><td>实验室自制</td><td>实验室自制</td><td>含1.0% (w/v) 牛血清白蛋白和0.1% (w/v) 葡萄糖的HBS溶液</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Molecular probes</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>10%漂白剂</td><td>实验室自制</td><td>实验室自制</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td>实验室自制</td><td>实验室自制</td><td></td></tr><tr><td>变性酒精</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>配备Multiflow8。在&lt;strong&gt;图S1&lt;/strong&gt; A中称为“泵”和“管路分配器”</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>配备Colibri-LED和高分辨率CCD相机</td></tr><tr><td>显微镜软件&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td>血液分析仪</td><td>Sysmex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>血小板孵育仪</td><td>Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>孵育水浴槽</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Brand</td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>试管滚轴混合器</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>无菌对接装置</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>管路封口机</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 in vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

用于输注的血液血小板在储存过程中会逐渐丧失止血功能。血小板功能可通过多种（间接的）体外实验进行研究，但这些方法中没有一种能像微流控流动腔那样全面。在本方案中，采用储存的血库血小板重悬血小板减少的新鲜血以模拟血小板输注。随后，将重悬后的样本灌注至微流控流动腔中，以模拟暴露的内皮下基质蛋白上的止血过程。可通过配对实验设计测量献血、运输、组分分离、储存及病原体灭活等因素的影响。这使得能够可靠地比较血液组分制备过程中每一步操作对止血功能的影响。我们的结果展示了温度循环、剪切速率、血小板浓度和储存时间对血小板功能的影响。综上所述，本方案可分析血库血小板的功能，最终有助于优化包括采血、运输、组分制备、储存和输注在内的整个处理流程。

为展示批内变异，将三个相同的重建全血样本同时灌注于胶原包被的表面（图1）。结果得到的变异系数为8.7%。该数据表明批内及实验室内的变异处于可接受范围，允许对相关样本进行可靠比较。
本文所述商用流式腔室的入口与测量腔室呈垂直方向，这可能导致该位置的流动略显湍流而非层流。尤其在未使用抗凝剂的实验中，血液与固定化激动剂之间的接触时间增加，可能引起堵塞。入口堵塞会影响腔室下游的检测结果。因此，通过部分包被流式腔室（图2），使入口区域不含有血小板激动剂，从而避免初级和次级止血过程的过早激活，对实验装置进行了优化。此外，部分包被黏附表面的方法已被该领域其他研究团队成功应用16。同时，这一简单实用的技巧有助于研究血液从非反应性（未包被）表面流向反应性（包被）区域时的“过渡”区域。
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采用血液重建和微流控流动腔模拟血小板输注与止血过程，以研究血液库保存血小板的功能。体外实验数据展示了血小板储存损伤对止血功能的影响。

使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 In Vitro

用于输注的血液血小板在储存期间会逐渐丧失止血功能。可采用多种方法检测血小板功能，...

本实验的总体目标是在体外模拟血小板输注，并通过胶原表面止血过程、流体动力学流动及实时显微镜观察对其进行检测。血小板减少症患者通常接受储存的血小板浓缩物治疗。本方法旨在帮助解答血栓形成与止血领域中的关键问题，尤其关注储存血小板浓缩物的质量与功能。该技术的附加价值在于其能够模拟血流，从而考虑流变学对参与的细胞和生物分子的影响。当前方法用于评估血小板与胶原蛋白的结合，但也可应用于其他黏附性组织，包括动脉粥样硬化斑块、内皮细胞，或特定基质蛋白，如血管性血友病因子和纤维蛋白原。首先准备生物芯片。将胶原蛋白储备液在生产商提供的等渗葡萄糖溶液中涡旋并按1:20稀释，使其终浓度为50微克/毫升。然后，取0.8微升该溶液加入到新的一次性生物芯片的通道中。填充芯片一端的所有泳道，并将此端标记为出口端。然后检查芯片，确保每个泳道中有五分之六的空间已被溶液填充，且无气泡。随后，将芯片置于加湿密闭容器中，在4°C下孵育4小时或过夜。随后，通过将封闭缓冲液移液至泳道的另一端来封闭编码通道。然后针对每个泳道，截取12厘米长的管路，并在每段管路上安装一个插针，以便将其连接至生物芯片。使用注射器和连接头中的蒸馏水冲洗管路段。然后，用封闭缓冲液充分浸润，并将其密封于湿盒中孵育至少一小时。接着，准备泵和多通管路系统。首先，用蒸馏水冲洗泵和多通管路，以去除任何气泡。接下来，将生物芯片连接到自动显微镜载物台上。将管路的一端插入装有HBS的1.5毫升离心管中，另一端连接至生物芯片的进样口。将多通管路针插入生物芯片的出样口。然后，使用泵以 HBS 冲洗系统，从而去除残留的封闭缓冲液或结合不牢固的胶原蛋白。至此，完成流室的准备工作。首先将健康志愿者的新近血液样本收集并混入一个锥形离心管中。以约250 ×g的离心力离心约15分钟。切勿使用刹车，以免扰动松散沉积的下层成分。移除并弃去富含血小板的血浆以及白细胞层（buffy coat）。保存含有尽可能少血小板的浓缩红细胞，用于制备重组血液。现在，将4 mL AB型血浆在37摄氏度下解冻5分钟20秒。同时，使用全自动血液分析仪测定所制备浓缩红细胞的红细胞压积。然后，测定用于全血重建的血库制备血小板浓缩液的血小板浓度。计算制备1毫升、40% hematocrit、每微升含250,000个血小板的重建全血所需的各组分体积。现在，使用剪去尖端的移液器吸头，将所需体积的红细胞、血浆和血小板浓缩液转移至目标浓度，最终体积为1毫升。轻轻颠倒混匀复溶的血液，并进行全血细胞计数。然后取一支预先准备好的含有Calcein AM的微量离心管，向其中加入一毫升复溶的血液。再次轻轻颠倒混匀，使血液与染料充分混合。然后，在 37 摄氏度下将重建的血液孵育 5 分钟。在软件中，选择灌注通道内的感兴趣区域。在 100 倍放大倍数下，聚焦于通道底部附着的胶原纤维。理想情况下，应使用相差显微镜或微分干涉差显微镜。选择“为选定的拼接区域设置当前Z值”选项，以数字方式固定选定的Z位置。灌注前的光学焦点应位于成釉细胞胶原上，但这一点可能较难把握。另一种方法是将显微镜的焦距对准最初附着的血小板。然后轻轻混匀样品，并将其放置在生物芯片旁边。接着，将连接至观察通道的管路放入重组血液中。接下来，使用控制泵的软件，施加50 dyne/cm²的压力，使血样进入通道并开始实验。实验过程中，每15秒记录一次图像，持续5分钟。利用图像分析软件确定血栓生长动力学。本实验采用 Zen 2012 软件。首先打开插件图像分析功能，以测定血小板的表面覆盖率。在“分析交互”选项卡中设置荧光阈值，以定义与阳性信号相关的像素强度，该信号来源于黏附的血小板。然后，使用创建表格功能自动生成一个电子表格，其中包含每个时间点阳性信号的表面积列表。将这些电子表格以 XML 格式保存，并在电子表格程序中打开以进行进一步计算。在每个时间点，计算所选对象的总表面积，并将该值表示为覆盖表面积的百分比。然后，将数据以灌注时间为自变量作图，并通过线性回归计算斜率，以此模拟该特定实验条件下的血栓生长动力学。同时对三个相同的重组全血样本在胶原包被的表面进行灌注。这导致变异系数为8.7%，表明该检测方法在同一批次内和同一实验室内的变异处于可接受范围，适用于检测结果的比较。通过补充缺乏的血液成分来重建血液，以模拟输血过程。进行了多次重建实验，其中血小板浓度逐步降低。正如预期，血小板计数降低导致在灌注时间内黏附减少。接下来研究了采血后及灌注期间温度降低的影响。当血液冷却至室温时，血栓形成速度减慢。与在整个研究过程中保持在37摄氏度的样本相比，循环中的血小板在血管壁剪切应力升高条件下会结合至血管损伤部位。正如预期，改变微流控流动腔中的剪切速率会改变血小板的总黏附量。这些条件也会改变血栓生长的动力学。观看本视频后，使用者应能充分理解如何利用重组血液进行微流控流动腔实验，以检测储存血小板浓缩液的质量与功能。该技术的完成时间约为七小时。微流控流动腔实验为血小板输注领域的研究人员探索捐献、制备和储存变量的影响奠定了基础。一个相关实例是病原体灭活。我们仅以一个实验主题为例进行了说明。然而，通过改变钙离子浓度、剪切应力和表面涂层，可以针对不同的研究问题进行探讨。类似于本实验方法，还可利用微流控流动腔系统开展其他测量，以回答更多科学问题。例如，储存血小板在流动条件下的凝血性能评估。

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

微流体流钱伯斯再造使用血止血建模和血小板输注<em&gt;体外</em

我们正在描述一种在无菌连续流动回路中对贴壁细胞施加层流剪切应力的方法。通过透明的腔室可观察细胞的黏附和形态，从回路中获取样品用于代谢物分析，并在剪切作用后收集细胞以用于后续实验或培养。...

平行板流动腔室与连续流动回路用于评估内皮祖细胞在层流剪切应力下的反应

一种在具有微血管尺寸通道的微流控装置整个内部三维表面培养内皮细胞单层的方法&lt;30 μm）被描述。 这一 体外...

用于研究血液系统疾病中微血管相互作用的内皮化微流控技术

该方案可模拟生理或病理条件下的血流 体外...

体外 生理与病理血流模型及其在血管细胞重塑研究中的应用

本文描述了一种同时测量血小板功能和凝血功能的止血实验模型。该模型可实时检测血小板和纤维蛋白的荧光信号，并测定血小板黏附速率、凝血速率以及凝血启动时间。该模型用于评估输注用浓缩制剂中血小板在流动条件下的促凝血特性。...

一种用于血小板输注与止血研究的微流控流动腔模型可实时测量血小板沉积与纤维蛋白形成

微流控流动腔, 血小板输注, 止血, 血小板沉积, 纤维蛋白形成, 实时监测, 血栓形成, 凝血功能评估, 体外模型, 血液动力学

我们提出一种体外血管疾病模型，用于研究全血与患者来源内皮细胞的相互作用。该系统可在不同条件下研究原代内皮细胞的血栓形成特性。该方法特别适用于评估凝血不同阶段的原位血栓形成能力及抗凝治疗效果。...

用于实时研究全血-内皮相互作用与血凝块动态的体外微流控疾病模型

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一种用于研究血管医疗器械血液相容性及宿主细胞激活的体外血流动力学回路模型

利用微流控装置可评估血小板在流动条件下的功能，并模拟止血复苏过程，该技术在创伤和输血医学中具有应用价值。...

微流控技术在血小板功能评估中的应用

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用于重建肿瘤微环境的微流控装置 体外

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使用介电泳和层流在多通道微流控装置中分离微珠与细胞

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系统分析 体外 使用多孔板微流控系统进行细胞滚动实验

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使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 In Vitro

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