微流体流钱伯斯再造使用血止血建模和血小板输注体外
2016年3月19日
使用血液重构和微流体流室对血小板输注和止血进行建模，以研究血库血小板的功能。数据证明了血小板贮积病变对体外止血的影响。
该实验的总体目标是在体外模拟血小板输注，并使用流体动力学流和实时显微镜对胶原蛋白进行止血测试。血小板减少症患者使用储存的血小板浓缩物进行治疗。我们的方法旨在帮助回答血栓形成和止血领域的关键问题，特别强调此类储存的血小板浓缩物的质量和功能。
该技术的附加价值在于它模拟血流，因此考虑了流变学对参与细胞和生物分子的影响。目前的方法评估血小板与胶原蛋白的结合。然而，它也可以应用于其他粘连组织，包括动脉粥样硬化斑块、内皮细胞或特异性基质蛋白，如 Von Willebrand 因子和纤维蛋白原。
从准备生物芯片开始。涡旋并稀释制造商的等渗葡萄糖溶液中 1 至 20 的胶原蛋白原液，使其最终浓度为 50 微克/毫升。然后，将 0.8 微升移液管到新的一次性生物芯片的泳道中。
填充 chip 一端的所有 lane，并将其标记为 outlet 端。然后检查芯片，确保每个泳道都用溶液填充了 5/6，并且没有气泡。然后，将芯片在 4 摄氏度下孵育 4 小时或在加湿的密闭容器中过夜。
稍后，通过将阻塞缓冲液移液到通道的另一端来阻塞编码通道。然后对于每个泳道，剪下 12 厘米长的管子，并在每条管子上连接一个针，使其可以连接到生物芯片上。用注射器和连接器中的蒸馏水冲洗管长。
然后，用封闭缓冲液浸透它们，并将它们密封在加湿容器中至少一小时。接下来，准备泵和歧管。首先，用蒸馏水冲洗泵和歧管以去除任何气泡。
接下来，将生物芯片连接到自动显微镜载物台上。将长度的一端放入装有 HBS 的 1.5 毫升管中，然后将它们与另一端连接到生物芯片入口。将歧管针脚插入生物芯片的出口。
然后，使用泵用 HBS 冲洗系统。因此，任何残留的封闭缓冲液或粘附不良的胶原蛋白都将被去除。这样就完成了流通室的准备工作。
首先将健康志愿者最近采集的血液汇集到锥形离心管中。将样品以 250 离心约 15 分钟，Gs.Do 不要使用制动器，因为它会干扰松散堆积的下相。取出并丢弃富含血小板的血浆和血沉棕黄层。
保存含有尽可能少血小板的浓缩红细胞，以制备重组血液。现在，开始在 37 摄氏度下解冻 4 毫升 AB 型血浆，持续 5 分 20 秒。同时，使用自动血液学分析仪测定制备的浓缩红细胞的血细胞比容。
然后，测定血库制备的血小板浓缩物的血小板浓度，用于重建全血。计算 1 毫升血细胞比容为 40% 的重组血液和每微升 250， 000 个血小板所需的体积。现在，使用夹住的移液器吸头，将所需体积的红细胞、血浆和血小板浓缩物转移至所需浓度，最终体积为 1 毫升。
将复溶血液与温和倒置混合，并进行全血细胞计数。然后，获得含有钙黄绿素 AM 的准备好的微量离心管，并向其中加入 1 毫升重组血液。使用温和的倒置将血液与染料混合。
然后，将复溶的血液在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。在软件中，选择灌注泳道中的感兴趣区域。以 100 倍放大倍率聚焦于粘附在泳道底部的胶原纤维。
理想情况下，使用相差或微分干涉对比。选择 set current Z for selected tile regions （为所选切片区域设置当前 Z） 选项以数字方式修复所选 Z 位置。灌注前的光学焦点应放在成釉细胞胶原上，但这可能很棘手。
另一种方法是将显微镜聚焦在初始粘附的血小板上。现在，轻轻混合样品并将它们放在生物芯片旁边。然后，将连接到观察到的泳道的管道放入重组的血液中。
接下来，使用控制泵的软件，施加每平方厘米 50 达因的压力，将血液样本移动到泳道中并开始实验。在实验期间，每 15 秒记录一次图像，持续 5 分钟。使用图像分析软件确定血栓生长动力学。
在这种情况下，使用了 Zen 2012。首先打开插件图像分析以确定血小板的表面覆盖率。在 analyze interactive 选项卡中设置荧光阈值，以定义与阳性信号相关的像素强度，该信号来自粘附的血小板。
然后，使用 create tables 自动生成一个电子表格，其中包含每个时间点的阳性信号的表面积列表。将这些电子表格保存为 XML 格式，并在电子表格程序中打开它们以进行进一步计算。在每个时间点，计算所选对象的总表面积，并将此值表示为覆盖的表面的百分比。
然后，将数据绘制为灌注时间的函数，并通过线性回归计算斜率。这模拟了该特定实验条件的血栓生长动力学。将 3 个相同的重组全血样品同时灌注在胶原涂层的表面上。
这导致变异系数为 8.7%，表明测试比较的批内和实验室内差异是可接受的。通过用缺乏成分重组血液来模拟输血。进行了几次重建，血小板浓度降低。
正如预期的那样，较低的血小板计数导致粘附减少，这是灌注时间的函数。接下来，研究采血后和灌注期间温度降低的影响。发现当血液冷却到室温时，血栓的形成速度更慢。
与在整个研究过程中保持在 37 摄氏度的样品相比。在循环过程中，血小板在壁剪切应力升高的情况下与血管损伤部位结合。正如预期的那样，改变微流体流室中的剪切速率会改变总血小板粘附。
这些情况也会改变血栓生长动力学。看完这个视频后，应该对如何使用重组血液进行微流体流动室实验来测试储存的血小板浓缩物的质量和功能有一个很好的了解。这项技术可以在大约 7 小时内完成。
微流体流动室实验为血小板输注领域的研究人员探索捐赠、制备和储存变量的影响铺平了道路。一个相关的例子是病原体灭活。我们只举了一个实验对象的例子。
然而，钙浓度、纯粹应力和表面涂层的变化可用于解决不同的研究问题。与此程序类似，可以在微流体流动室中进行其他测量以回答其他问题。例如，储存的血小板在流动中凝固的性能。
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概述
本研究使用血液重建和微流控流动室来研究血小板输注和止血。它强调了血小板储存病变对体外止血功能的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 血液学
- 血栓形成
- 止血
背景
- 血小板减少症患者接受储存的血小板浓缩物。
- 血小板储存病变可能影响止血功能。
- 了解血小板功能对改善输血结果至关重要。
- 当前的方法评估血小板与胶原蛋白和其他粘附组织的相互作用。
研究目的
- 在体外模拟血小板输注。
- 在流体动力学流动下评估胶原蛋白上的止血功能。
- 研究储存的血小板浓缩物的质量和功能。
使用的方法
- 血液重建技术。
- 用于实时显微镜的微流控流动室。
- 评估血小板与胶原蛋白的结合。
- 应用于其他粘附组织如动脉粥样硬化斑块。
主要结果
- 展示了储存病变对血小板功能的影响。
- 提供了对储存血小板止血能力的见解。
- 显示了流体动力学流动在评估血小板相互作用中的相关性。
- 突出了对各种粘附组织的潜在应用。
结论
- 该研究为评估血小板输注效果提供了一种新的方法。
- 研究结果可能影响关于血小板储存和输注的临床实践。
- 未来的研究可能会扩展对血栓形成和止血影响的探讨。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to evaluate platelet transfusion efficacy under physiologically relevant flow conditions, addressing a critical gap in preclinical assessment of blood product quality. By simulating hemostasis in microfluidic chambers using reconstituted blood, the method provides quantitative, real-time readouts of platelet function that support go/no-go decisions in transfusion medicine development. The approach de-risks translational advancement by linking storage variables to functional outcomes, thereby improving predictive confidence in platelet product performance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding platelet function and storage lesion impact on hemostasis.
- Operational Value: Enables functional target validation of platelet concentrates under controlled shear stress and temperature conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating platelet concentration, storage duration, and temperature cycling with thrombus growth kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening of platelet-modulating compounds or storage interventions.
- Reproducibility: Delivers quantitative surface coverage measurements with low intra-assay variation (8.7% CV), enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Supports multiplexed testing of three identical reconstituted blood samples simultaneously over collagen-coated surfaces.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thrombocytopenia treatment scenarios using reconstituted blood to mimic clinical platelet transfusion.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by measuring hemostatic function on collagen under hydrodynamic flow.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement decisions by quantifying the impact of blood donation, transport, component separation, storage, and pathogen inactivation on platelet function.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment, enabling continuous evaluation of platelet product quality across the processing chain.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of platelet storage lesions and pathway clarification of hemostasis under flow.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating platelet adhesion and thrombus growth kinetics.
- Analytics: Generates quantitative thrombus growth kinetics via image analysis and linear regression, enabling cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by simulating transfusion and measuring functional outcomes in disease-relevant shear conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for assessing platelet product quality across multiple storage variables and processing steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in platelet function by reducing mechanistic ambiguity in storage lesion effects.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through controlled perfusion, blocking, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking storage duration, temperature, and shear rate to functional platelet outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of platelet processing optimizations based on empirical hemostasis data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, blood reconstitution, and real-time microscopy.
- Dependent on automated microscope stage, pump-manifold system, and biocompatible biochips.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit, platelet concentration, and perfusion pressure settings.
- Involves adaptation considerations for varying shear rates, temperature profiles, and surface coatings (e.g., collagen, VWF, fibrinogen).
- Practical limitations include the need for air bubble-free channel filling and precise Z-focus maintenance during perfusion.
