微流体流钱伯斯再造使用血止血建模和血小板输注体外

该实验的总体目标是在体外模拟血小板输注，并使用流体动力学流和实时显微镜对胶原蛋白进行止血测试。血小板减少症患者使用储存的血小板浓缩物进行治疗。我们的方法旨在帮助回答血栓形成和止血领域的关键问题，特别强调此类储存的血小板浓缩物的质量和功能。

该技术的附加价值在于它模拟血流，因此考虑了流变学对参与细胞和生物分子的影响。目前的方法评估血小板与胶原蛋白的结合。然而，它也可以应用于其他粘连组织，包括动脉粥样硬化斑块、内皮细胞或特异性基质蛋白，如 Von Willebrand 因子和纤维蛋白原。

从准备生物芯片开始。涡旋并稀释制造商的等渗葡萄糖溶液中 1 至 20 的胶原蛋白原液，使其最终浓度为 50 微克/毫升。然后，将 0.8 微升移液管到新的一次性生物芯片的泳道中。

填充 chip 一端的所有 lane，并将其标记为 outlet 端。然后检查芯片，确保每个泳道都用溶液填充了 5/6，并且没有气泡。然后，将芯片在 4 摄氏度下孵育 4 小时或在加湿的密闭容器中过夜。

稍后，通过将阻塞缓冲液移液到通道的另一端来阻塞编码通道。然后对于每个泳道，剪下 12 厘米长的管子，并在每条管子上连接一个针，使其可以连接到生物芯片上。用注射器和连接器中的蒸馏水冲洗管长。

然后，用封闭缓冲液浸透它们，并将它们密封在加湿容器中至少一小时。接下来，准备泵和歧管。首先，用蒸馏水冲洗泵和歧管以去除任何气泡。

接下来，将生物芯片连接到自动显微镜载物台上。将长度的一端放入装有 HBS 的 1.5 毫升管中，然后将它们与另一端连接到生物芯片入口。将歧管针脚插入生物芯片的出口。

然后，使用泵用 HBS 冲洗系统。因此，任何残留的封闭缓冲液或粘附不良的胶原蛋白都将被去除。这样就完成了流通室的准备工作。

首先将健康志愿者最近采集的血液汇集到锥形离心管中。将样品以 250 离心约 15 分钟，Gs.Do 不要使用制动器，因为它会干扰松散堆积的下相。取出并丢弃富含血小板的血浆和血沉棕黄层。

保存含有尽可能少血小板的浓缩红细胞，以制备重组血液。现在，开始在 37 摄氏度下解冻 4 毫升 AB 型血浆，持续 5 分 20 秒。同时，使用自动血液学分析仪测定制备的浓缩红细胞的血细胞比容。

然后，测定血库制备的血小板浓缩物的血小板浓度，用于重建全血。计算 1 毫升血细胞比容为 40% 的重组血液和每微升 250， 000 个血小板所需的体积。现在，使用夹住的移液器吸头，将所需体积的红细胞、血浆和血小板浓缩物转移至所需浓度，最终体积为 1 毫升。

将复溶血液与温和倒置混合，并进行全血细胞计数。然后，获得含有钙黄绿素 AM 的准备好的微量离心管，并向其中加入 1 毫升重组血液。使用温和的倒置将血液与染料混合。

然后，将复溶的血液在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。在软件中，选择灌注泳道中的感兴趣区域。以 100 倍放大倍率聚焦于粘附在泳道底部的胶原纤维。

理想情况下，使用相差或微分干涉对比。选择 set current Z for selected tile regions （为所选切片区域设置当前 Z） 选项以数字方式修复所选 Z 位置。灌注前的光学焦点应放在成釉细胞胶原上，但这可能很棘手。

另一种方法是将显微镜聚焦在初始粘附的血小板上。现在，轻轻混合样品并将它们放在生物芯片旁边。然后，将连接到观察到的泳道的管道放入重组的血液中。

接下来，使用控制泵的软件，施加每平方厘米 50 达因的压力，将血液样本移动到泳道中并开始实验。在实验期间，每 15 秒记录一次图像，持续 5 分钟。使用图像分析软件确定血栓生长动力学。

在这种情况下，使用了 Zen 2012。首先打开插件图像分析以确定血小板的表面覆盖率。在 analyze interactive 选项卡中设置荧光阈值，以定义与阳性信号相关的像素强度，该信号来自粘附的血小板。

然后，使用 create tables 自动生成一个电子表格，其中包含每个时间点的阳性信号的表面积列表。将这些电子表格保存为 XML 格式，并在电子表格程序中打开它们以进行进一步计算。在每个时间点，计算所选对象的总表面积，并将此值表示为覆盖的表面的百分比。

然后，将数据绘制为灌注时间的函数，并通过线性回归计算斜率。这模拟了该特定实验条件的血栓生长动力学。将 3 个相同的重组全血样品同时灌注在胶原涂层的表面上。

这导致变异系数为 8.7%，表明测试比较的批内和实验室内差异是可接受的。通过用缺乏成分重组血液来模拟输血。进行了几次重建，血小板浓度降低。

正如预期的那样，较低的血小板计数导致粘附减少，这是灌注时间的函数。接下来，研究采血后和灌注期间温度降低的影响。发现当血液冷却到室温时，血栓的形成速度更慢。

与在整个研究过程中保持在 37 摄氏度的样品相比。在循环过程中，血小板在壁剪切应力升高的情况下与血管损伤部位结合。正如预期的那样，改变微流体流室中的剪切速率会改变总血小板粘附。

这些情况也会改变血栓生长动力学。看完这个视频后，应该对如何使用重组血液进行微流体流动室实验来测试储存的血小板浓缩物的质量和功能有一个很好的了解。这项技术可以在大约 7 小时内完成。

微流体流动室实验为血小板输注领域的研究人员探索捐赠、制备和储存变量的影响铺平了道路。一个相关的例子是病原体灭活。我们只举了一个实验对象的例子。

然而，钙浓度、纯粹应力和表面涂层的变化可用于解决不同的研究问题。与此程序类似，可以在微流体流动室中进行其他测量以回答其他问题。例如，储存的血小板在流动中凝固的性能。