在血清型 1 型肺炎链球菌 菌株 519/43 中构建突变体

该协议很重要，因为它允许对以前不可处理的血清型进行基因改造，从而有可能研究和了解血清型。这为疫苗开发等生物工作开辟了途径。演示该程序的是伦敦卫生与热带医学学院的助理教授 Vanessa S.Terra。

首先，按照 pGEM-T Easy System I 制造商的说明进行连接，生成质粒 pSD1。在 4 摄氏度下孵育反应过夜。第二天，用 pSD1 转化化学感受态大肠杆菌 Dh5-α，将 50 μL 细胞与 3 μL pSD1 连接反应物在冰上孵育 15 分钟，然后将细胞暴露在热休克下，将细胞置于冰上 2 分钟。

从冰中取出细胞，加入 350 微升 SOC 培养基，然后在 37 摄氏度和 120 RPM 下孵育培养物 2 小时。将转化接种在补充有 0.4 毫摩尔 IPTG、0.24 毫克/毫升 X-Gal 用于蓝白斑选择和 100 微克/毫升氨苄青霉素的 Luria-Bertani 琼脂上，以确保在平板上生长的所有菌落都具有质粒骨架。挑选三个含有 pSD1 的白色菌落，并在 10 毫升补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 L-B 中建立过夜生长。

将培养物在 37 摄氏度下摇动孵育过夜。第二天，将培养物以 3， 082 G 离心，并使用沉淀进行质粒提取。提取质粒 DNA 后，对 pSD1 质粒和壮观霉素盒进行 BamH1 限制性消化。

将限制性酶切反应和对照在 37 摄氏度下孵育 3 小时。限制性限制完成后，通过电泳分析产物，然后切除正确的条带并使用市售试剂盒进行纯化。接下来，使用 BamH1 消化的 pSD1 和壮观霉素进行连接反应。

这将产生质粒 pSD2。如前所述，将 pSD2 转化为化学感受态大肠杆菌 DH5-α。然后，根据它们在补充有 100 μg/mL 大观霉素和氨苄青霉素的 LBA 中生长的能力选择携带质粒 pSD2 的转化体，并提取质粒 DNA。

在 BHI 中准备肺炎链球菌 519/43 的过夜培养物，并使其在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下静态生长。第二天，在 10 毫升新鲜 BHI 肉汤中以 1：50 和 1：100 的比例稀释培养物。在 37 摄氏度下静态孵育培养物，直到 595 纳米处的 OD 介于 0.05 和 0.1 之间。

一旦达到适当的 OD，取 860 微升培养物并将其转移到微量离心管中。加入 100 微升 100 毫摩尔氢氧化钠、10 微升 20% BSA、10 微升 100 毫摩尔氯化钙、2 微升 50 纳克/毫升 CSP1 和 500 纳克 pSD2。将反应物在 37 摄氏度下静态孵育 3 小时。

然后，在 3 小时的孵育期内，每小时将 330 μL 接种到补充有 100 μg/mL 壮观霉素的 5% 血琼脂平板上。然后，将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。将壮观霉素耐药菌落贴在另一个补充有 100 μg/mL 大观霉素的血琼脂平板上，以及补有 100 μg/mL 氨苄青霉素的血琼脂平板上，以检测质粒骨架的存在。

将两组板孵育过夜。通过限制性消化确认 pSD2 的正确组装。然后使用 pSD2 转化 519.43 个野生型细胞。

过夜孵育后在壮观霉素上生长的菌落被认为是阳性转化子。通过评估 D39、519/43 野生型和突变型 519/43 δ 层的溶血活性来对溶肺素突变进行表型确认。这与 0.5% 皂苷对红细胞的溶血进行了比较，后者被认为是 100% 突变体失去了裂解红细胞的能力。

通过测序进一步确认所有阳性集落，以评估插入位置。使用结合位点在同源区域之外的引物。进行转化反应时，按正确的顺序添加试剂非常重要。