在血清型 1 型肺炎链球菌 菌株 519/43 中构建突变体
2020年9月11日
在这里，我们描述了一种 肺炎链球菌 血清型1菌株519/43，该菌株可以通过利用其自然获取DNA和自杀质粒的能力进行基因改造。作为原理证明，在肺溶血素（ply）基因中制造了同基因突变体。
该协议很重要，因为它允许对以前不可处理的血清型进行基因改造，从而有可能研究和了解血清型。这为疫苗开发等生物工作开辟了途径。演示该程序的是伦敦卫生与热带医学学院的助理教授 Vanessa S.Terra。
首先，按照 pGEM-T Easy System I 制造商的说明进行连接，生成质粒 pSD1。在 4 摄氏度下孵育反应过夜。第二天，用 pSD1 转化化学感受态大肠杆菌 Dh5-α，将 50 μL 细胞与 3 μL pSD1 连接反应物在冰上孵育 15 分钟，然后将细胞暴露在热休克下，将细胞置于冰上 2 分钟。
从冰中取出细胞，加入 350 微升 SOC 培养基，然后在 37 摄氏度和 120 RPM 下孵育培养物 2 小时。将转化接种在补充有 0.4 毫摩尔 IPTG、0.24 毫克/毫升 X-Gal 用于蓝白斑选择和 100 微克/毫升氨苄青霉素的 Luria-Bertani 琼脂上，以确保在平板上生长的所有菌落都具有质粒骨架。挑选三个含有 pSD1 的白色菌落，并在 10 毫升补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 L-B 中建立过夜生长。
将培养物在 37 摄氏度下摇动孵育过夜。第二天，将培养物以 3， 082 G 离心，并使用沉淀进行质粒提取。提取质粒 DNA 后，对 pSD1 质粒和壮观霉素盒进行 BamH1 限制性消化。
将限制性酶切反应和对照在 37 摄氏度下孵育 3 小时。限制性限制完成后，通过电泳分析产物，然后切除正确的条带并使用市售试剂盒进行纯化。接下来，使用 BamH1 消化的 pSD1 和壮观霉素进行连接反应。
这将产生质粒 pSD2。如前所述，将 pSD2 转化为化学感受态大肠杆菌 DH5-α。然后，根据它们在补充有 100 μg/mL 大观霉素和氨苄青霉素的 LBA 中生长的能力选择携带质粒 pSD2 的转化体，并提取质粒 DNA。
在 BHI 中准备肺炎链球菌 519/43 的过夜培养物，并使其在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下静态生长。第二天，在 10 毫升新鲜 BHI 肉汤中以 1：50 和 1：100 的比例稀释培养物。在 37 摄氏度下静态孵育培养物，直到 595 纳米处的 OD 介于 0.05 和 0.1 之间。
一旦达到适当的 OD，取 860 微升培养物并将其转移到微量离心管中。加入 100 微升 100 毫摩尔氢氧化钠、10 微升 20% BSA、10 微升 100 毫摩尔氯化钙、2 微升 50 纳克/毫升 CSP1 和 500 纳克 pSD2。将反应物在 37 摄氏度下静态孵育 3 小时。
然后，在 3 小时的孵育期内，每小时将 330 μL 接种到补充有 100 μg/mL 壮观霉素的 5% 血琼脂平板上。然后，将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。将壮观霉素耐药菌落贴在另一个补充有 100 μg/mL 大观霉素的血琼脂平板上，以及补有 100 μg/mL 氨苄青霉素的血琼脂平板上，以检测质粒骨架的存在。
将两组板孵育过夜。通过限制性消化确认 pSD2 的正确组装。然后使用 pSD2 转化 519.43 个野生型细胞。
过夜孵育后在壮观霉素上生长的菌落被认为是阳性转化子。通过评估 D39、519/43 野生型和突变型 519/43 δ 层的溶血活性来对溶肺素突变进行表型确认。这与 0.5% 皂苷对红细胞的溶血进行了比较，后者被认为是 100% 突变体失去了裂解红细胞的能力。
通过测序进一步确认所有阳性集落，以评估插入位置。使用结合位点在同源区域之外的引物。进行转化反应时，按正确的顺序添加试剂非常重要。
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概述
本文介绍了一种遗传修饰S. pneumoniae 1型血清型519/43菌株的方法，利用其自然获得DNA的能力。该研究展示了在肺炎溶素（ply）基因中创建同源突变体，为进一步研究铺平了道路。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 基因工程
- 病原体研究
背景
- 肺炎链球菌是一种重要的人类病原体。
- 对这种血清型进行遗传修饰一直是一个挑战。
- 了解其遗传学可以帮助疫苗开发。
- 本研究提供了一种新的遗传操纵方法。
研究目的
- 使S. pneumoniae 1型血清型的遗传修饰成为可能。
- 为研究目的创建突变株。
- 促进对肺炎溶素及其在发病机制中作用的研究。
使用的方法
- 使用pGEM-T Easy System I生成质粒pSD1。
- 通过连接反应转化E. coli Dh5-alpha。
- 对能量细胞进行孵育和热休克处理。
- 通过标准分子技术验证遗传修饰。
主要结果
- 成功创建了ply基因的同源突变体。
- 证明了该协议在遗传修饰方面的有效性。
- 对疫苗研究和开发的潜在影响。
- 建立了一个研究S. pneumoniae的新模型。
结论
- 该方法允许对先前难以处理的血清型进行遗传操纵。
- 这为生物学研究开辟了新途径。
- 进一步的研究可以利用这种技术进行疫苗开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Genetic modification of Streptococcus pneumoniae serotype 1 has been a longstanding barrier in infectious disease research, particularly for vaccine and therapeutic target validation in high-burden regions. This protocol enables functional genomics in a clinically relevant strain, supporting mechanistic de-risking of virulence factors like pneumolysin. By establishing a reliable mutagenesis system, it improves predictive confidence in target selection and accelerates preclinical evaluation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through isogenic mutant construction in a clinically relevant serotype.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional validation of virulence genes such as ply.
- Strategic Value: Supports target de-risking by linking genotype to phenotype in infection models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates defined mutant strains for standardized phenotypic assays, including hemolysis and infection models.
- Operational Value: Establishes a workflow for generating isogenic controls essential for assay reproducibility.
- Strategic Value: Enables scalable screening of genetic variants using selectable markers and counter-selection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates phenotype-genotype correlation in vivo using intraperitoneal and intranasal challenge models.
- Operational Value: Produces validated mutant stocks for downstream efficacy and safety testing.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing serotype-specific pathogenic mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling target validation through genetic manipulation prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene knockout to clarify pathway involvement in pathogenesis.
- Screening: Generates isogenic mutant panels for comparative phenotypic screening in cell-based and animal models.
- Analytics: Enables quantitative measurement of dependent variables such as hemolytic activity and bacterial burden in tissues.
- Translational Research: Connects molecular findings to preclinical outcomes by comparing infection phenotypes across serotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform for serial mutagenesis applicable to other vaccine candidate antigens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in serotype-specific pathogenesis.
- Operational Value: Delivers a standardized, reproducible method for generating defined genetic mutants in S. pneumoniae.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by enabling early assessment of target essentiality and virulence contribution.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing functional data on virulence factors before costly preclinical investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial transformation, and allelic exchange techniques.
- Dependent on access to electroporation or chemical transformation systems for E. coli and S. pneumoniae.
- Necessitates standardized protocols for DNA preparation, restriction digestion, and ligation to ensure plasmid integrity.
- Requires biosafety level 2 containment for handling pathogenic S. pneumoniae strains.
- Success depends on optimizing competence-inducing conditions, including CSP1 concentration and calcium chloride levels.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Generation of Plasmid pSD1 and Chemical Transformation of E. coli Dh5α
2:03
Plasmid DNA Extraction, Restriction Digestion of pSD1 and Spectinomycin Gene, and Assembly of pSD2
3:03
Transformation of S. pneumoniae Strain 519/43
4:46
Results: Confirmation of Mutagenesis
5:43
Conclusion
