Name: 在型号蓝藻种类标记和无标记突变体的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 学习在集胞藻PCC6803中制备无标记突变体及在聚球藻PCC7002中制备标记突变体的遗传操作方法。该技术利用抗生素抗性基因插入与负筛选标记去除，实现蓝藻菌株的多次基因改造，为工业菌株开发提供可靠手段。

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我们感谢环境服务协会教育信托基金、剑桥合成生物学 SynBio 基金以及印度政府社会正义与赋能部提供的经费支持。

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<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

构建无标记突变体最关键的步骤包括：1）精心设计质粒，确保仅目标区域发生改变；2）保持样品无菌，尤其是在蔗糖培养基上培养时；3）将转化后的细胞首先接种于不含抗生素的BG11琼脂平板上，用于获得有标记的突变体，24小时后再添加含抗生素的琼脂；4）在接种于含蔗糖的BG11琼脂平板前，将有标记的突变体连续培养满4天；5）确保有标记的突变体已完全分离；6）充分验证突变株的基因型。对于最后一步，可设计额外的引物以扩增缺失区域的一部分，从而确认该区域已被删除。Southern印迹法虽然操作繁琐，也可用于验证。然而，根据我们的经验，本文所述方法已足以正确验证突变体。该方法也曾成功用于构建集胞藻Synechococcus elongatus PCC7942的有标记突变体，但对该蓝细菌进行多次转化仍具有挑战性。
如果无法分离出标记突变体，则需采用不同的环境条件，如高 CO2，弱光（&#60;20 µmol 光子 m⁻² s⁻¹-2 秒-1）或其他营养物质（即 葡萄糖）可以进行检测。例如，添加葡萄糖对于...

蓝细菌是一类进化历史悠久且种类多样的细菌门类，几乎存在于地球上的所有自然环境中。在海洋生态系统中，它们尤为丰富，并在多种营养循环中发挥关键作用，每年约占海洋中碳固定量的一半1、氮固定量的大部分2，以及数亿吨碳氢化合物的生成3。真核藻类和植物中负责光合作用的细胞器——叶绿体，很可能起源于被宿主生物吞噬的一类蓝细菌4。蓝细菌已被证明是研究光合作用、电子传递5及多种生化途径的有用模式生物，其中许多途径在植物中是保守的。此外，由于蓝细菌能够利用太阳能将水和CO2高效转化为生物量9，它们正越来越多地被用于食品、生物燃料6、电能7和工业化合物8的生产。许多蓝细菌种类可在非耕地上使用极少营养物质和海水进行培养，表明其有望大规模培养而不影响农业生产。某些种类还可提供天然产物，包括抗真菌、抗菌和抗癌化合物10,11。
获得突变体的能力对于理解蓝细菌的光合作用、生物化学和生理学至关重要，同时也是开发工业用途菌株的基础。大多数已发表的研究通过将抗生素抗性盒插入目标位点来构建基因改造菌株。这种方法限制了可在同一菌株中引入的突变数量，因为在蓝细菌中可用的抗生素抗性盒种类有限。含有赋予抗生素抗性基因的菌株不能用于开放池塘中的工业生产，而开放池塘很可能是生产生物燃料和其他低价值产品的唯一具有成本效益的方式12。构建无标记突变体可克服这些限制。无标记突变体不含任何外源DNA（除非有意引入），并可进行多次遗传操作。因此，可以根据需要在菌株中引入任意数量的遗传改变。此外，还可以最大限度地减少对修饰位点下游基因的极性效应，从而实现对生物体更精确的改造13。
为获得突变菌株，首先构建含有两个DNA片段的自杀型质粒，这两个片段分别与蓝细菌染色体上待删除基因两侧的区域（称为5'和3'侧翼区）相同。随后将两个基因插入这两个侧翼区之间：其中一个基因编码抗生素抗性蛋白，另一个基因编码SacB，后者产生果聚糖蔗糖酶，使菌株对蔗糖敏感。在该过程的第一阶段，获得标记突变株， 即 含有外源DNA的菌株被构建出来。将质粒构建体与蓝细菌细胞混合，使该DNA被生物体自然摄取。通过在含有适当抗生素的琼脂平板上培养，筛选转化子，并通过PCR验证突变基因型。自杀性质粒无法在目标菌株内复制，因此任何具有抗生素抗性的菌落均源于重组事件，即目标基因已插入染色体中。为了产生无标记突变体，可将带有标记的突变体与第二种仅包含5'和3'侧翼区域的自杀性质粒混合。然而，若需要插入外源DNA，则可使用一种由5'和3'侧翼区域组成、并在这些DNA片段之间插入含目标基因的表达盒的质粒。筛选通过在含有蔗糖的琼脂平板上培养进行。由于蔗糖对表达蔗糖敏感基因的细胞具有致死性，当 sacB 基因产物表达后，只有发生第二次重组事件的细胞才能存活，即蔗糖敏感基因连同抗生素抗性基因一起从染色体上重组至质粒上。由于重组交换，两侧的侧翼区域及其中间的任何DNA片段都被插入到染色体中。
我们已成功利用这些方法在集胞藻属Synechocystis sp. PCC6803（下文简称Synechocystis）的同一菌株中引入多个染色体突变13,14，用于在目标基因中引入单点突变13，以及用于基因表达盒的表达。尽管在我们开展工作之前，已有研究在Synechocystis中实现无标记基因敲除的报道15,16，但目前尚无公开的详细方法，尤其缺乏对关键步骤的可视化展示。我们还应用相同的方法在另一种模式蓝细菌——聚球藻属Synechococcus sp. PCC7002（下文简称Synechococcus）中构建了有标记的基因敲除突变体。本实验方案提供了一种清晰、简便的突变体构建方法，以及快速验证和保藏这些菌株的操作流程。

<table><tbody><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>氰钴胺</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>90 mm 三重通气培养皿</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 锥形瓶</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm × 38&amp;nbsp;m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>DNA 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤培养基</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 质粒小提试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 圆底管</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &amp;micro;m 玻璃珠</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>荧光灯管</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron 光生物反应器</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

模式蓝藻物种中标记和无标记突变体的构建

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

蓝细菌是具有重要生态意义的生物，也是生产生物燃料和有用工业产品的潜在平台。对蓝细菌进行遗传操作，特别是对集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）和聚球藻（Synechococcus sp. PCC7002）等模式生物的操作，是基础与应用研究中的关键工具。无标记突变体的构建是一种尤为强大的技术，其过程首先通过插入抗生素抗性盒（一段包含一个或多个基因的可操作DNA片段）对菌株染色体进行修饰，随后利用负筛选标记将该抗性盒移除。无标记突变体可进行多次遗传操作，从而可在同一菌株中引入任意数量的遗传改变。此外，突变菌株中不含编码抗生素抗性蛋白的基因具有优势，可避免耐药生物逃逸至环境中的风险。然而，科学文献中对蓝细菌反复进行遗传操作的详细方法描述尚不充分。本文中，我们全面介绍了这一技术，并已成功应用于构建具有多个基因缺失、目标基因单点突变以及插入新型基因盒的突变体。

质粒设计对于成功构建标记与非标记突变体至关重要。 Figure 1 展示了质粒A和B的示例，这些质粒用于在集胞藻（Synechocystis）的cpcC1和cpcC2基因中构建缺失突变体。 Synechocystis genes cpcC1 and cpcC213在这两种情况下，5' 和 3' 侧翼区域均约为 900-1,000 bp。虽然我们成功试验过的最小侧翼区域约为 500 bp，但也可以使用更短的侧翼区域。质粒 B 还可以在 5' 和 3' 侧翼区域（约 1 kb）之间包含一个基因盒，或是天然基因序列的修饰版本。&#39; and 3&#39; 侧翼区域长度约为900-1000 bp。虽然我们已成功验证的最小侧翼区域长度约为500 bp，但也可使用更短的侧翼区域。质粒B的5'端和3'端约1 kb侧翼区域之间还可包含一个基因盒。&#39; and 3&#39; 约1 kb的侧翼区域或经修饰的天然基因序列版本。
<p class="jove_conte...

向蓝细菌中引入多种基因组修饰是开发用于工业和基础研究菌株的关键工具。本文描述了一种在模式蓝细菌物种集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）中产生无标记突变体，以及在聚球藻（Synechococcus sp. PCC7002）中产生有标记突变体的系统。

蓝细菌是具有重要生态意义的生物，也是生产生物燃料和有用工业产品的潜在平台。遗传操作……

本实验的总体目标是展示一种在集胞藻属 PCC6803（Synechocystis species PCC6803）中产生无标记突变体，以及在聚球藻属 PCC7002（Synechococcus species PCC7002）中产生标记突变体的系统。该方法有助于回答蓝细菌遗传学领域的关键问题，例如如何将染色体修饰引入菌株中。通过插入一个抗生素抗性基因，随后利用负筛选标记将该盒式结构移除。该技术的主要优势在于可对菌株进行反复的遗传操作，从而能够根据需要向菌株中引入任意数量的修饰。根据文本方案，在制备好培养基、蓝细菌菌株和质粒后，取一环蓝细菌细胞接种于30至50毫升BG11培养基中，建立新鲜培养物。将培养物置于30摄氏度光照条件下培养2至3天，使其OD750达到0.2至0.6。孵育结束后，取1至2毫升培养物，在2,300×g下离心5分钟。弃去上清液后，用BG11培养基洗涤沉淀一次，轻轻吹打重悬细胞。注意避免使用涡旋振荡，因为涡旋可能导致对DNA摄取至关重要的菌毛丢失。再次离心收集细胞并去除上清液后，加入 BG11 培养基至终体积 100 微升，并将细胞转移至 14 毫升圆底管中。接着，向细胞中加入 1 微克先前制备的质粒 A，轻轻敲击混匀。然后将试管水平放置于30摄氏度的培养箱中，培养4至6小时。培养结束后，将细胞培养物质粒DNA混合液的等分试样涂布于不含抗生素的BG11琼脂平板上，并在30摄氏度下培养。约24小时后，用含有卡那霉素的水配制0.6%的琼脂溶液，并使其冷却至42摄氏度。然后将2.5至3毫升该溶液加入培养皿的边缘，并倾斜培养皿，使溶液在表面形成一层均匀的顶层琼脂层。将平板培养约七天，直至菌落可见。然后将一块新的添加了卡那霉素的 BG11 琼脂平板分为六个区域，用钝头牙签挑取单菌落进行划线分离。为了进行PCR以确认显著的基因敲除，将少量细胞转移至含有50 µL水和约20个直径为425至600 µm玻璃珠的离心管中。在约2,000 rpm条件下振荡细胞与玻璃珠5分钟，随后在15,700 ×g下离心5分钟。然后取5 µL上清液用于制备50 µL的PCR反应体系，使用tack DNA引物。为了验证突变体，在根据文本方案设计引物后，使用以下程序扩增产物，并设置野生型对照。通过凝胶电泳验证敲除转化子的基因型，应显示出一条约四千碱基对的条带，且无野生型条带。更多细节请参见文字版实验方案。如果仍然存在野生型条带，则需将菌株重新划线接种至新鲜培养板上，并重复PCR检测。重复验证过程，直至突变体完全分离，且PCR反应中不再观察到野生型条带。对于表现出明显突变特征的菌株，需在新鲜平板上重新划线，用于构建无标记敲除突变体。为构建无标记的集胞藻（Synechocystis）突变体，取含有标记的敲除菌株，用接种环挑取大量细胞接种于30至50毫升BG11培养基中，制备新鲜培养物。将培养物培养两至三天，使其OD750达到0.2至0.6。将10毫升培养物在2,300 ×g下离心5分钟，弃去上清液。然后用BG11培养基轻轻洗涤细胞。加入BG11培养基至终体积为200微升，将细胞转移至14毫升圆底管中，向细胞中加入1微克质粒B DNA，轻轻敲击混匀。然后将试管水平放置于培养箱中，孵育4至6小时。孵育结束后，加入1.8毫升BG11培养基，并将样品在振荡条件下继续孵育，总时间为4天。这段时间足以使多个染色体拷贝之间发生重组。将转化后的培养物分别取 50、10 和 1 微升点种于添加 5% 蔗糖的 BG11 琼脂平板上，培养约七天以获得单菌落。随后，使用钝头牙签从平板上挑取 30 至 50 个单菌落，转接至含卡那霉素的 BG11 平板进行划线培养。然后将其影印至添加 5% 蔗糖的 BG11 平板上。在 BG11 加蔗糖培养基上生长但在含卡那霉素的平板上不生长的菌落，可能是无标记敲除子。在两种平板上均能生长的菌落，可能由于 sacB 基因发生突变而具有蔗糖抗性。采用本视频前面展示的 PCR 方法验证无标记敲除子，其扩增产物在凝胶电泳中应显示一条对应于野生型大小减去缺失区域的条带。如果菌株表现出无标记突变特征，则将其重新划线接种于不含抗生素的新鲜BG11琼脂平板上。为长期保存菌株，取该菌株的单菌落接种于30至50毫升BG11培养基中，制备新鲜培养物。将培养物培养三至四天，直至其OD750达到0.4至0.7。使用 BG11 洗涤细胞一次后，将沉淀重悬于约两毫升 BG11 中。取 0.8 毫升浓缩细胞加入一个离心管中，然后加入 0.2 毫升 80% 经滤膜除菌的甘油。向另一管中加入 0.93 毫升浓缩细胞和 0.07 毫升 DMSO。将两管均于 -80 °C 保存。复苏菌株时，取出冻存管，用钝头牙签刮取少量细胞接种至不含抗生素的琼脂平板上。然后使用无菌接种环按常规方法进行划线分离。该图展示了用于构建缺失突变体的质粒A和质粒B的示例。在每种情况下，5′端和3′端的侧翼区域长度均约为900至1,000个碱基对。质粒B在5'端和3'端约一千个碱基对的侧翼区域之间，也可包含一个基因盒，或天然基因序列的修饰版本。用质粒A转化后，平板上将在7至10天后出现数百个菌落。如果基因为非必需基因，且突变体表现出与野生型菌株相似的生长状态，则通过PCR检测应发现所有染色体均含有插入的 npt1/sacB 序列拷贝。如果基因为非必需基因，但突变体生长缓慢，则需要进行多轮随着卡那霉素浓度递增的重新划线培养，以获得已分离的标记突变体。若经过反复划线培养后仍无法获得标记突变体，则该基因很可能为生存所必需。通过质粒B转化获得的大多数单菌落将对卡那霉素敏感且对蔗糖具有抗性。如本实验所示，对这些菌落中靶区域进行PCR扩增的结果表明，几乎100%的菌落具有无标记突变特征。一旦掌握该技术，若操作得当，可在六周时间内于数小时内完成整个流程。在进行该实验操作时，重要的是要牢记使用无菌技术。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如测量氧气产生量或气相色谱-质谱联用分析，以回答更多科学问题，例如测定光合作用速率或代谢物的生成。该技术建立后，为蓝细菌遗传学领域的研究人员开辟了新的研究途径。为了研究该门类中的关键生物化学和生理过程，并开发用于工业目的的菌株。观看本视频后，您应能够充分理解如何在集胞藻 PCC6803 中生成无标记的基因敲除突变体。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在型号蓝藻种类标记和无标记突变体的产生

来源：Weber, N., 等，丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白表达与低温保存。J. Vis. Exp.

丝状蓝细菌Phormidium lacuna中的自然转化与GFP表达

来源： Lea-Smith, D. J., et al. 模式蓝细菌物种中标记型与无标记突变体的构建. J. Vis. Exp.

通过同源重组在蓝细菌中产生抗生素标记突变体

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