在型号蓝藻种类标记和无标记突变体的产生

该程序的总体目标是展示一种在蓝藻集胞藻属 PCC6803 中产生未标记突变体的系统，并在 PCC7002 集球藻属中产生标记突变体的系统。这种方法可以帮助回答蓝藻遗传学领域的关键问题。例如如何将染色体改变引入菌株中。

通过插入抗生素耐药基因，然后使用阴性选择标记去除该盒。该技术的主要优点是菌株可以反复进行基因作。允许根据需要将尽可能多的交替引入菌株中。

根据文本方案制备培养基、蓝藻菌株和质粒后。通过将装满蓝藻细胞的环接种到 30 至 50 mil 的 BG11 培养基中来构建新鲜培养物。将培养物在 30 摄氏度的光照下培养 2 到 3 天，达到 OD 7500，等于 0.2 到 0.6。

孵育后，将 1 至 2 毫升培养物以 2， 300 g 离心 5 分钟。然后在弃去上清液后，使用 BG11 培养基洗涤沉淀一次，轻轻移液以重悬细胞。因为涡旋可能导致菌毛丢失，而菌毛对 DNA 摄取至关重要。

再次沉淀细胞并去除上清液后，加入 BG11 培养基至最终体积为 100 μL，并将细胞转移至 14 mL圆底管中。接下来，向细胞中加入 1 μg 先前制备的质粒 A。然后轻轻敲击混合。

然后将试管水平放置在 30 摄氏度的培养箱中，孵育 4 到 6 小时。孵育后，将细胞培养质粒 DNA 混合物的等分试样涂布在不含抗生素的 BG11 琼脂平板上。并在 30 摄氏度下孵育。

大约 24 小时后，在含有卡那霉素的水中制备 0.6% 琼脂溶液。并让它冷却到 42 摄氏度。然后在培养板的边缘加入 2.5 至 3 毫升并倾斜板，使溶液在表面形成均匀的顶部琼脂层。

将板孵育大约 7 天，以便可以看到菌落。然后将新鲜的 BG11 琼脂加卡那霉素板分成六个扇区。并使用钝端牙签划出单个菌落。

为了进行 PCR，为了确认标记的敲除，将少量细胞转移到含有 50 μL 水和大约 20 425 至 600 μm 玻璃珠的试管中。以大约 2， 000 rpm 的速度摇动细胞和磁珠 5 分钟，然后以 15， 700 g 的速度旋转 5 分钟。然后使用 5 μL 上清液制备 50 μL PCR 反应和粘性 DNA 初步反应。

为了验证突变体，在根据文本方案设计引物后，使用以下程序扩增产物，并包括野生型对照。通过 gelelektroforeses，验证敲除转化体的基因型。显示大约 4 千碱基对的条带，缺少野生型条带。

有关更多详细信息，请参阅文本协议。如果仍然存在野生型条带，请在新板上重新划线菌株并重复 PCR。重复验证过程，直到分离突变体，并且在 PCR 反应中未观察到野生型条带。

对于显示标记突变体特征的菌株，在新板上重新划线以用于生成未标记的敲除。为了产生未标记的集胞藻突变体，通过将充满细胞的环接种到 30 至 50 mL BG11 培养基中来建立标记敲除的新鲜培养物。将培养物培养 2 到 3 天至 OD 750，等于 0.2 至 0.6。

10 毫升培养物以 2， 300 g 离心 5 分钟，然后弃去上清液。然后我们用 BG11 培养基轻轻洗涤细胞。将 BG11 加入最终体积为 200 μL 并将细胞转移到 14 mL圆底管中后，向细胞中加入 1 μg 质粒 B DNA，然后轻轻敲击混合。

然后将试管水平放在培养箱中，孵育 4 到 6 小时。孵育后，加入 1.8 mL BG11 培养基，并在振荡下将样品孵育总共 4 天。这是允许在多个染色体拷贝中发生重组的足够时间。

将 50、10 和 1 微升转化的培养物等分试样接种到 BG11 加 5% 蔗糖琼脂平板上，孵育约 7 天以产生单个菌落。接下来，使用平头牙签，在 BG11 加卡那霉素平板上孵化 30 到 50 个单独的菌落。然后贴在 BG11 加 5% 蔗糖上。

在 BG11 加蔗糖上生长但不在含卡那霉素的平板上生长的菌落是潜在的无标记敲除。由于 sacB 基因突变，在两个平板上生长的菌落可能具有蔗糖抗性。按照本视频前面演示的 PCR 方法，验证未标记的敲除，这将产生对应于野生型大小减去缺失区域的凝胶条带。

如果菌株显示未标记的突变体谱，则在不含抗生素的新鲜 BG11 琼脂上重新划线。为了长期储存菌株，通过将充满细胞的环接种到 30 至 50 毫升 BG11 培养基中来建立菌株的新鲜培养物。将培养物培养 3 到 4 天，OD 750 等于 0.4 到 0.7。

使用 BG11 洗涤细胞一次后，将沉淀重悬于大约 2 毫升的 BG11 中。将 0.8 毫升浓缩的细胞加入到一根试管中。然后加入 0.2 毫升 80% 过滤灭菌甘油。

向另一根试管中加入 0.93 毫升浓缩细胞和 0.07 毫升 DMSO。将两根试管存放在零下 80 摄氏度。为了恢复菌株，请取出试管并使用钝端牙签将一些细胞刮到不含抗生素的琼脂平板上。

然后像往常一样使用无菌定量环划线。该图显示了用于生成缺失突变体的质粒 A 和 B 的示例。在每种情况下，五个素素和三个素区域大约是 900 到 1， 000 个碱基对。

质粒 B 也可包含五个引物和三个引物之间约 1 kb 对侧翼区域的基因盒。或者是天然基因序列的修改版本。用质粒 A 转化后，7 到 10 天后，数百个菌落会出现在平板上。

如果基因是非必需的并且突变体表现出生长，类似于野生型菌株，那么所有染色体都应包含一个拷贝 npt1/sacB 插入序列，通过 PCR 确定。如果基因是非必需的，并且突变体生长缓慢，则需要用增加浓度的卡那霉素进行几轮重新划线，以获得分离的标记突变体。如果在重新划线时未获得标记突变体，则该基因可能是生存所必需的。

通过质粒 B 转化获得的大多数单个菌落对卡那霉素敏感且对蔗糖具有抗性。如此处所示，这些菌落中靶区的 PCR 扩增表明，几乎 100% 的未标记突变体谱。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在六周内的几个小时内完成。

在尝试此程序时，请务必记住使用无菌技术。按照此程序，可以执行其他方法，例如测量氧气生成或气相色谱质谱法，以回答其他问题，例如测量光合速率或代谢物产生。开发后，这项技术为蓝藻遗传学领域的研究人员铺平了道路。

探索该门的关键生化和生理过程，以及用于工业目的的发育菌株。观看此视频后，您应该对如何在 Synechococcus 物种PCC6803中生成无标记的敲除有很好的了解。