Name: 一种改进的小鼠原代肝细胞分离时间和劳动效率方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 学习一种改进的小鼠原代肝细胞分离方案，使用蠕动泵和胶原酶消化液，显著提高时间与劳动效率。该方法适用于肝脏代谢、葡萄糖代谢及药物测试研究，可获得高纯度肝细胞并验证胰岛素敏感性。

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本研究由美国国立卫生研究院（资助号：5R01HD095512-02，授予 S.W.）提供支持。

所有实验程序均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。本研究使用8周龄C57BL/6雌性小鼠。
1. 准备：
<ol>
	<li>将 William's E 培养基（含 GlutaMAX 补充剂）与 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素-抗真菌素溶液混合，配制成培养液。</li>
	<li>将25 mL胶原酶-分散酶培养基（例如，Liver Digest Medium）通过0.45 µm注射器滤器过滤，以去除颗粒碎片。</li>
	<li>将50 mL双蒸水加热2O (ddH₂O)2O）、35 mL 灌注培养基（例如 Liver Perfusion Medium）（首次使用本方案时为 50 mL）以及 25 mL 过滤的胶原酶-分散酶培养基，置于 45 °C 水浴中预热 30 分钟。</li>
	<li>在无菌细胞培养操作台内，将 2 mL 10x HBSS 与 18 mL Percoll 混合于 50 mL 离心管中，配制成 20 mL 1x Percoll-HBSS，置于冰上或 4 °C 保存。 
	注意：1x Percoll-HBSS 可在 4 °C 保存至少 6 个月。</li>
	<li>在无菌细胞培养操作台内，将30 mL洗涤液（例如，肝细胞洗涤液）倒入洁净的培养皿中，并置于冰上保存。</li>
	<li>将泵管浸入45 °C水浴的水中。若室温为25 °C，结果最为可靠。</li>
	<li>通过混合225 µL盐酸氯胺酮、93.75 µL赛拉嗪和1681 µL 1x PBS，配制2 mL 1x麻醉剂。</li>
	<li>使用批准的方法麻醉一只小鼠。此处采用腹腔注射150 µL 1x麻醉剂。通过检测反射消失（如脚趾夹捏反应）以确认小鼠已完全麻醉。</li>
	<li>将小鼠仰卧固定在解剖垫上，四肢可用大头针、防水胶带或其他机构动物护理与使用委员会（或同等机构）批准的方法固定。</li>
	<li>准备无菌的镊子和剪刀用于解剖。为避免可能的污染，所有步骤均应在无菌操作台内进行。</li>
</ol>
2. 实验步骤：
<ol>
	<li>使用蠕动泵，以 4 mL/min 的速度泵入预热的 ddH2O，持续 5 分钟。将泵管从水中更换为预热的灌注培养基。</li>
	<li>用 70% 乙醇对麻醉小鼠的腹部进行消毒，用剪刀剪开腹腔，暴露肝脏、门静脉和下腔静脉（IVC）。</li>
	<li>停止蠕动泵。将一根 24 G 导管（例如：封闭式静脉导管，24 G，0.75 英寸）插入下腔静脉（IVC）。启动泵液，并剪开门静脉。</li>
	<li>继续泵液，直至流出液体变澄清（约 3–5 分钟）。每隔一分钟按压一次门静脉，使液体流经肝脏各个区域。注意避免气泡进入下腔静脉。 
	注意：此步骤旨在尽可能将肝脏中的血液冲洗干净。</li>
	<li>将泵管从灌注培养基更换为胶原酶-分散酶培养基。在执行步骤 2.6 的同时，继续泵液，直至 25 mL 胶原酶-分散酶培养基完全注入。</li>
	<li>每隔一分钟按压一次门静脉，使液体流经肝脏各个区域。 
	注意：在此阶段，小鼠若完全失血将导致死亡。实验结束后可通过心跳是否停止确认小鼠死亡。按照机构规定妥善处理尸体。</li>
	<li>将不含胆囊的完整肝脏分离，并转移至冰上培养皿中的 30 mL 清洗培养基中。</li>
	<li>用镊子将肝脏撕成小块，使原代肝细胞释放到溶液中。此步骤会使清洗培养基变为浑浊的溶液，其中含有大量释放的原代肝细胞和细小肝组织碎片。</li>
	<li>将步骤 2.8 中的浑浊溶液通过 70 µm 细胞筛过滤，收集至冰上 50 mL 离心管内的 20 mL 1× Percoll-HBSS 溶液中。轻轻倒置离心管 20 次以混匀。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>在组织培养超净台内，吸除上清液。用 30 mL 冷的清洗培养基重悬沉淀。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 50 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，在组织培养超净台内用 25 mL 培养基（或其他适当体积）重悬沉淀。</li>
	<li>计数细胞数量，并根据实验设计将细胞接种至所需的培养板中。 
	注意：从一只 8 周龄小鼠中成功分离的原代肝细胞，通常足以接种于四个 6 孔板或四个 12 孔板。</li>
</ol>

<ol><li>Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+metabolism+from+a+liver-centric+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).</li>
<li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes%3A+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cell+polyploidization%3A+a+pivotal+role+for+binuclear+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li>
<li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> Elife. 4, 11214(2015).</li>
<li>Bruening, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+enters+liver+cells+using+the+CD81+receptor+complex+proteins+calpain-5+and+CBLB%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).</li>
<li>Silvie, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+CD81+is+required+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+yoelii+sporozoite+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity.</a> Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).</li>
<li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+as+immunological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes as immunological agents.</a> Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).</li>
<li>Liu, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TR4+orphan+nuclear+receptor+reduces+phosphoenolpyruvate+carboxykinase-mediated+gluconeogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis.</a> Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotrope+androgen+receptor+mediates+pituitary+responsiveness+to+hormones+and+androgen-induced+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility.</a> JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).</li>
<li>Santos, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+transthyretin+neuroprotection+in+a+mouse+model+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).</li>
<li>Pinhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Fas+and+FasL+is+associated+with+infectious+complications+and+severity+of+experimental+severe+acute+pancreatitis+by+promoting+apoptosis+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes.</a> Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).</li>
<li>Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mannose+and+asialoglycoprotein+receptor+expression+determines+glycoprotein+hormone+half-life+at+critical+points+in+the+reproductive+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).</li>
<li>Tanowitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+mediates+productive+uptake+of+N-acetylgalactosamine-conjugated+and+unconjugated+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides+into+liver+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).</li>
<li>Manczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralization+of+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+decreases+amyloid+beta+1-42+and+suppresses+microglial+activity+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK1-dependent+transphosphorylation+of+JAK2+limits+the+antifibrotic+effects+of+selective+JAK2+inhibitors+on+long-term+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+angiogenesis+markers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of angiogenesis markers.</a> American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-147%2C+a+microRNA+that+is+induced+upon+Toll-like+receptor+stimulation%2C+regulates+murine+macrophage+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+expressing+minimally+humanized+CD81+and+occludin+genes+support+Hepatitis+C+virus+uptake+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo.</a> Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).</li>
<li>Renshaw, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+impaired+Toll-like+receptor+expression+and+function+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+l-azidohomoalanine+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+Journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar Journal. 6, 169(2007).</li>
<li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation%3A+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).</li>
<li>Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf</a> (2021).</li>
<li>Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+cell+of+origin%2C+molecular+class%2C+and+effects+on+patient+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis.</a> Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).</li>
<li>Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+location+and+distribution+of+hepatic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Differential location and distribution of hepatic immune cells.</a> Cells. 6 (4), 48(2017).</li>
<li>Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes%3A+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).</li>
<li>Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History%2C+heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).</li>
<li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+Physiology+and+role+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li>
<li>Peter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD95+receptor%3A+apoptosis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD95 receptor: apoptosis revisited.</a> Cell. 129 (3), 447-450 (2007).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).</li>
<li>Willoughby, J. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+GalNAc-siRNA+conjugate+activity+in+pre-clinical+animal+models+with+reduced+asialoglycoprotein+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression.</a> Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).</li>
<li>Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+cells+protect+liver+sinusoidal+endothelial+cells+from+Fas-dependent+apoptosis+in+sepsis+by+down-regulating+gp130%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已开发出多种原代肝细胞分离方案，并根据不同需求持续优化和调整（表1）。分离方案通常包括两个部分：灌注（含酶消化）和纯化。
灌流可在整个肝脏体内2,20,21,22,23条件下进行，也可在分离的肝叶上进行24。出于操作便利性考虑，分离肝叶的灌流通常仅限于左叶和中叶。理论上，由于使用了包含所有肝叶的完整肝脏，体内灌流应能获得更多的原代肝细胞。在灌流过程中保持肝脏原位，也可能减少细胞死亡，因为在此步骤期间，体内的肝细胞可始终浸润于液体（血液或灌流缓冲液）中。
维持无菌条件在此步...

肝脏是脊椎动物体内最重要的器官之一，因其在食物消化、血液循环和解毒等多种维持生命的功能中发挥关键作用。小鼠原代肝细胞的应用 体外 培养在碳水化合物代谢和肝细胞癌研究中日益受到关注。因此，建立一种简便的小鼠原代肝细胞分离方法，同时维持其固有的生理功能，显得尤为重要。由于肝脏在葡萄糖代谢中发挥枢纽作用，它在葡萄糖的生成与储存过程中也处于核心地位1原代肝细胞实验 体外 是大多数葡萄糖代谢研究中必不可少的。因此，多年来，多个研究团队已开发出多种小鼠原代肝细胞分离方案。
小鼠肝细胞分离的一般步骤是首先使用等渗液体（如磷酸盐缓冲液（PBS）或Hanks平衡盐溶液（HBSS））灌注肝脏以清除血液，然后使用含胶原酶的溶液解离肝细胞。这些方案具有相似的总体流程，但根据不同的实验需求，在试剂和具体步骤上有所差异。然而，配制所需试剂并执行分离过程通常耗时较长。在制定本方案时，效率被列为首要目标，所有试剂均为市售即用型，且操作步骤尽可能简化。本方案的总体目标是提供一种快速、省力的小鼠原代肝细胞分离方法，同时不损害所分离原代肝细胞的纯度和活性。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td>无需包被</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td>无需包被</td></tr><tr><td>抗AKT抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2920S</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌溶液（100倍浓度，稳定型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>抗FOXO1抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>97635S</td><td></td></tr><tr><td>抗GAPDH抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>抗p-AKT（S473）抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9271L</td><td></td></tr><tr><td>抗PEPCK抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-166778</td><td></td></tr><tr><td>抗p-FOXO1（S256）抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>84192S</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤筛，70 &amp;micro;m</td><td>CELLTREAT</td><td>229483</td><td></td></tr><tr><td>封闭式静脉导管，24号，0.75英寸</td><td>Becton Dickinson</td><td>383511</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（无葡萄糖、无谷氨酰胺、无酚红）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1443001</td><td></td></tr><tr><td>EnzyChrom葡萄糖检测试剂盒</td><td>BioAssay Systems</td><td>EBGL-100</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林（Forskolin）</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3917-10MG</td><td></td></tr><tr><td>胰高血糖素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2044</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG二抗</td><td>LI-COR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG二抗</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞洗涤培养基</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Cell Signaling</td><td>13630S</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Lilly</td><td>NDC 0002-8215-01</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮（100 mg/mL）</td><td>Hospira Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>肝脏消化液</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td>在超净台中分装至50 mL离心管中，每管25 mL，置于-20 &amp;deg;C冰箱保存</td></tr><tr><td>肝脏灌注液</td><td>Gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 2</td><td>可实现4 mL/min的流速</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td>可在4 &amp;deg;C条件下离心50 mL离心管</td></tr><tr><td>L-乳酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，PVDF膜，0.45 &amp;micro;m，直径30 mm</td><td>CELLTREAT</td><td>229745</td><td></td></tr><tr><td>注射器，0.5 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>注射器，60 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>离心管，15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>离心管，50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>水浴槽</td><td>Corning</td><td>CLS6783</td><td>或任何可加热至45 &amp;deg;C的水浴槽</td></tr><tr><td>William&amp;rsquo;s E培养基（含GlutaMAX补充剂）</td><td>Gibco</td><td>32551020</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Xylozine，100 mg/mL）</td><td>Vetone Anased LA</td><td>NDC13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

一种改进的小鼠原代肝细胞分离的省时高效方案

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

原代肝细胞被广泛用于肝脏研究 体外 研究，尤其是在葡萄糖代谢研究中具有重要意义。根据不同需求（如时间、人力、成本和原代肝细胞的使用）对基础技术进行了调整，从而产生了多种原代肝细胞分离方案。然而，原代肝细胞分离过程中步骤繁多以及耗时的试剂配制，严重影响了实验效率。在比较了不同方案的优缺点后，整合各方案的优势，建立了一种快速高效的原代肝细胞分离方案。该方案仅需约35分钟，即可获得与其它方法相当甚至更多的健康原代肝细胞。利用所分离的原代肝细胞进行的葡萄糖代谢实验，进一步验证了该方案在相关研究中的实用性 体外 肝脏代谢研究。我们还全面回顾和分析了本研究中每一步骤的意义与目的，以便未来的研究人员能够根据需要进一步优化该方案。

为了检测效率，本研究采用8周龄雌性C57BL/6小鼠进行了当前的原代肝细胞分离方案。检测了分离所得原代肝细胞的贴壁能力与纯度。原代肝细胞分离广泛应用于肝脏生理学相关的多种实验，如肝脏药物效应、葡萄糖代谢、药物生物标志物活性2、胰岛素敏感性以及葡萄糖生成等。因此，本研究通过以下实验检测了采用该方案分离得到的原代肝细胞的活性。
本方案中，原代肝细胞贴壁无需包被处理 
分离得到的原代肝细胞以每孔 5 × 105 个细胞的密度接种于 6 孔板中。接种 1 小时后观察到细胞已牢固贴附，并在接种后 12 小时完全铺展（图 3）。这表明接种 12 小时后，细胞已准备好用于后续实验。根据小鼠肝组织内肝细胞的细胞核形态特征，单核肝细胞多分布于边缘区域，而双核或多核肝细胞（终末分化的标志）则主要位于中央区域3,4。显微...

原代肝细胞是研究肝脏反应和代谢的有力工具 体外利用市售试剂，开发出一种改进的小鼠原代肝细胞分离方案，该方案更加节省时间和劳动力。

原代肝细胞被广泛应用于肝脏体外研究，尤其是在葡萄糖代谢研究中。一种基础技术已根据……进行改良

小鼠原代肝细胞在肝脏研究中具有重要意义，尤其是在葡萄糖代谢和肝脏药物测试方面。然而，其分离过程耗时较长，且能量消耗较大。该方案可提供一种高效分离小鼠原代肝细胞的方法。该方法节省时间和劳力，所需步骤极少，且所有试剂均可商业获取。首先使用蠕动泵以每分钟 4 mL 的速度泵入预热的双蒸水，持续 5 分钟。随后将泵管从双蒸水切换至预热的灌注培养基，并注意观察水与灌注培养基之间的气泡。有助于追踪灌注液在系统中的流动情况。接下来，用70%乙醇对一只8周龄C57黑6J雌性小鼠的腹部进行消毒。然后使用剪刀切开腹部，暴露肝脏、门静脉和下腔静脉。然后停止蠕动泵。在确认泵管中充满灌注液而非水后，将一根24号导管插入下腔静脉。重新启动泵并切开门静脉。在灌注液泵入的同时，每隔一分钟按压一次门静脉，以使液体到达肝脏的每个角落。持续泵入约三到五分钟，或直至流出的液体变得澄清为止。接下来将灌注管从灌注培养基更换为胶原酶-分散酶培养基。每隔一分钟按压一次门静脉，使液体到达肝脏的每个角落。持续灌注，直至25 mL胶原酶-分散酶培养基完全用尽。接下来，分离出不含胆囊的完整肝脏，并将其置于冰上的培养皿中含30 mL洗涤液的环境中。用镊子将肝脏撕碎，以释放原代肝细胞进入溶液中。在此阶段，洗涤液会变成含有释放出的原代肝细胞和小块肝组织的浑浊溶液。将此浑浊溶液通过70微米细胞滤器过滤，收集至冰上预冷的50 mL离心管中含20 mL 1×PBS缓冲液的溶液中。然后通过轻轻颠倒离心管20次以混匀溶液。接下来离心该溶液。然后在组织培养罩内吸除上清液，并用30 mL冷洗涤培养基洗涤沉淀。再次通过离心收集细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于25 mL培养基中。计数细胞，并将其接种至所需的培养板中。根据实验设计，接种后，分离的原代肝细胞在1小时后已牢固贴壁，并在12小时后完全伸展。与全肝组织相比，分离肝细胞中肝细胞标志物（如转甲状腺素蛋白、CD95、ASGR1和ASGR2）的mRNA水平显著升高。相比之下，免疫细胞、星状细胞和内皮细胞的存在较少。这由 CD45、胶原蛋白 I 型 α1 和内皮细胞 2 激酶 2 的 mRNA 水平显著降低所证实，表明该方案可大幅减少其他肝细胞的干扰。接种后，ASGR1 和 ASGR2 的水平随时间下降，但在 12 小时时间点之前仍与全肝水平相当，尤其是 ASGR1。膜结合型 CD81 的表达水平在 48 小时内保持稳定。相比之下，Toll样受体4的表达量总体增加，并在48小时后超过体内水平。胰岛素敏感性检测表明，胰岛素可显著促进肝细胞中丝氨酸473位点的AKT以及丝氨酸256位点的叉头框蛋白01的磷酸化。表明原代肝细胞对胰岛素具有敏感性。经胰高血糖素处理后，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶蛋白水平显著升高，提示葡萄糖生成途径被激活。这种激活作用进一步通过葡萄糖生成增加得到证实，并且在与其他葡萄糖生成刺激剂（如Forskolin+IBMX）联用时，该方案可为使用小鼠原代肝细胞的研究节省时间和精力。按照本方案，可开展相关的实验，例如假想的葡萄糖代谢和药物生物标志物检测。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一种改进的小鼠原代肝细胞分离时间和劳动效率方案

本文展示了一种从成年小鼠分离原代肝细胞的酶法，并描述了使用ELISA和实时PCR定量炎症反应的方法。...

小鼠原代肝细胞培养物中炎症反应的诱导

本实验方案的目的是从肝脏中获得高活力和高产量的肝细胞及肝窦内皮细胞。通过门静脉灌注IV型胶原酶溶液，随后进行差速离心，从而分离得到肝细胞和肝窦内皮细胞。...

小鼠肝脏灌注法分离肝细胞和肝窦内皮细胞

本文介绍了一种分离健康且具有功能的小鼠原代肝细胞的实验方案。同时提供了利用非放射性标记底物检测肝脏新生蛋白质合成的方法，以帮助理解肝脏在能量代谢稳态背景下蛋白质合成的相关机制。...

通过非放射性L-叠氮高丝氨酸标记法分离原代小鼠肝细胞用于新生蛋白质合成分析

本文介绍了一种利用改良的胶原酶灌注技术从成年小鼠肝脏中分离小鼠肝细胞的实验方案。同时描述了在三维胶原三明治结构中对肝细胞进行长期培养的方法，以及对细胞骨架成分进行免疫标记，以研究胆小管的形成及其对处理的响应。...

分离与三维胶原三明治培养原代小鼠肝细胞以研究细胞骨架在体外胆小管形成中的作用

本方案详细介绍了使用特殊静脉导管、标准化的一次性无菌管路、结合实时监测的温度控制以及报警系统，进行两步胶原酶灌注，以提高分离的原代大鼠肝细胞的活力、得率和功能的一致性。...

通过多参数灌注控制分离大鼠原代肝细胞

脂肪酸β-氧化是一种重要的代谢途径，在包括肝细胞在内的多种细胞类型中负责能量生成。本文介绍一种利用14C标记的棕榈酸测定 freshly isolated primary...

新鲜分离小鼠肝细胞悬液中脂肪酸β-氧化的测定

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。...

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

本方案描述了从小鼠肝脏中分离原代肝细胞，并通过电穿孔将CRISPR-Cas9以核糖核蛋白复合物和mRNA形式导入细胞，以破坏与遗传性肝代谢疾病相关的治疗靶基因的技术。所述方法在电穿孔后可实现高细胞存活率和高效的基因修饰水平。...

电穿孔介导的Cas9核糖核蛋白和mRNA递送至新鲜分离的小鼠原代肝细胞

富含脂质的肝细胞在肝脏再生过程中具有内在作用，但通常在密度梯度离心过程中丢失。本文介绍了一种优化的细胞分离方案，可保留脂肪变性肝细胞，从而在小鼠部分肝切除术后获得具有代表性的再生肝细胞群体。...

小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

学习一种改进的小鼠原代肝细胞分离方案，使用蠕动泵和胶原酶消化液，显著提高时间与劳动效率。该方法适用于肝脏代谢、葡萄糖代谢及药物测试研究，可获得高纯度肝细胞并验证胰岛素敏感性。

一种改进的小鼠原代肝细胞分离的省时高效方案

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