原原小鼠肝细胞的分离和3D胶原蛋白三明治培养，研究细胞骨架在胆汁形成中的作用

这里介绍的是一个协议，使用改良的胶原酶灌注技术从成年小鼠肝脏分离小鼠肝细胞。还描述了肝细胞在3D胶原蛋白夹层设置中的长期培养，以及细胞骨骼成分的免疫标签，以研究胆汁癌形成及其对治疗的反应。

该协议有助于小鼠肝细胞在3D胶原蛋白夹层环境中的分离和可重复的长期培养，以研究规范结构的形成及其对体外治疗的反应。一旦掌握了这项技术，它是获取大量高可行和纯小鼠肝细胞种群用于体外研究的快速方法。演示该程序将是伦卡萨诺娃，一个技术人员从我们的实验室。

原发性肝细胞分离前一天，在500微升中加入100微升10X DMEM、485微升蒸馏水，以及15微升1微升1微升的1微升氢氧化钠，加入鼠尾胶原蛋白1。检查中和胶原蛋白的 pH 值。应该是 7.5 。

使用预冷的 200 微升移液器尖端，将 100 微升中和胶原蛋白溶液铺在冰上每个直径为 3.5 厘米的塑料培养盘上，并在标准培养条件下放置餐具过夜。第二天早上，每盘37摄氏度PBS的一毫升补充水合，在37摄氏度下至少3小时。为了分离肝脏，在确认对手趾捏没有反应后，将麻醉小鼠放在解剖垫上，放在上部位置，然后将下肢和上肢胶带固定到垫子上。

用 70% 乙醇擦拭腹部，从区域到每个前肢进行 V 形切口。将皮肤折叠在胸前以发现腹腔，将垫子置于解剖显微镜下。将小肠和结肠在结膜方向上移动，以暴露 IVC，并加载一个两毫升注射器，其中 2.5 毫升的 37 摄氏度溶液 C. 将注射器连接到管，并使用 PBS 浸泡棉签将肝脏压到隔膜上。

在肝脏下方的 IVC 周围放置一个浸泡的缝合线。然后使用装有30量针弯曲到45度角的胰岛素注射器，将每毫升肝素5000单位的10微升注射到门户静脉中。为了使肝脏凝固，使用显微手术剪刀在肝脏旁边的 IVC 中做一个小切口，并将管插入切口。

用缝合线和两个手术结固定管，并切断入口静脉，让灌注缓冲液从肝脏流出。然后缓慢压抑注射器柱塞，用两毫升溶液在约15秒内将肝脏用两毫升溶液进行足量。交付所有溶液后，预先为内维泵加注新鲜 37 摄氏度溶液 C，并检查灌注装置，确保系统中没有气泡。

小心地将管子与注射器断开，并快速但小心地将正在运行的近位泵的管子连接到管。立即以每分钟 2.5 毫升的流速开始灌注。两分钟后，切换到解决方案 D 并继续灌注 10 分钟。

灌注结束时，小心地将肝脏收获成一个50毫升的圆锥管，含有20毫升37摄氏度溶液E.To分离原发性肝细胞，用导管握住肝脏，将管壁周围的组织揉入缓冲液中。当所有组织都捣碎后，将组织浆料转移到70微米孔尼龙过滤器中，将分离的细胞过滤成新的50毫升管。通过离心沉淀肝细胞，并在DMEM中将颗粒重新悬浮在20毫升40%Percoll中。

通过离心分离活细胞和死细胞，并在溶液E的20毫升中重新给颗粒。在再次离心细胞后，将颗粒重新在10毫升新鲜溶液E中重新下水进行计数。计数后，将原肝细胞计数调整为3.75倍10，以每毫升肝细胞培养基的5个可行细胞。要培养3D胶原蛋白三明治中分离的原发性肝细胞，请使用一毫升移液器将两毫升细胞均匀地分配到每个胶原蛋白涂层的3.5厘米直径的培养皿上。

将细胞放在细胞培养箱中三小时。在孵育过程中，准备100微升中和鼠尾胶原蛋白，每盘一个溶液，如证明。在孵育结束时，小心地用每盘100微升中和胶原蛋白替换中和未连接的细胞，将板回细胞培养箱一小时。

当胶原蛋白凝固后，在每道菜中仔细添加两毫升新鲜肝细胞培养基，并将培养物返回孵化器，每天在显微镜下检查培养物。对于3D胶原蛋白三明治中原生肝细胞的免疫标记，用37摄氏度的PBS仔细清洗每个三明治，并在室温下用每盘PBS中4%的半基甲醛固定培养物30分钟。在固定结束时，用两毫升 PBS 洗三次 10 分钟，每次洗涤 0.1% Tween 20。

上次洗涤后，在PBS中用1毫升0.1摩尔甘氨酸和0.2%Triton X-100渗透细胞，在室温下渗透一小时，随后在PBS和Tween 20中进行三次洗涤，正如刚刚证明的。接下来，使用连接到真空的 10 微升负载尖端轻轻干扰胶原蛋白的顶层，并阻止任何非特异性结合与 PBS Tween 中一毫升 5%牛血清白蛋白结合两个小时。在孵育结束时，将主要抗体稀释在每道菜的阻断溶液中，并在37摄氏度下孵育过夜。

第二天早上，用PBS Tween洗三个15分钟的盘子，然后用适当的二次抗体在37摄氏度下标记5个小时。在孵化结束时，用PBS Tween洗涤两次，用蒸馏水洗涤一次，在用抗褪色安装介质进行显微镜安装之前，演示。在3D胶原蛋白三明治播种的一天内，小鼠原发性肝细胞形成集群，并在大约常规的胆汁管中形成集群和自组织。

在三到六天内，通常观察到5至10个细胞的簇，完全偏振的肝细胞形成一个运河网络。使用毒素或细胞骨架改变药物的治疗会导致肝细胞骨架和胆汁的宽度、形状和数量发生变化。虽然乙醇处理对角蛋白8的组织只表现出轻微的影响，但它增加了胆汁管宽度的折磨和分布。

与未经处理的对控相比，ZO-1染色的信号强度在乙醇处理胆汁中降低，表明乙醇处理后类型结会丧失。与布莱比斯塔汀的可延美性抑制诱导形成无序形状、厚、圆的胆汁。此外，使用冈田酸治疗可抑制磷酸盐，严重影响角蛋白的物理特性，导致胆碱与未经治疗的对法相比明显缩小。

此外，乙醇治疗显著提高丙氨酸和阿斯巴酸氨基转移酶的水平，表明严重的肝细胞损伤，而布莱比斯塔汀治疗不导致任何考虑变化的转氨酶水平和冈田酸治疗触发轻微的生化变化的丙氨酸氨基转移酶，但无一糖核酸氨基转移酶表达的变化。在灌注过程中和灌注开始时保持相对快速的工作，避免气泡进入灌注系统，这一点很重要。细胞酸盐可以在重复的井中收集感兴趣的蛋白质，以确定在治疗过程中是否发生蛋白质表达和/或活化阶段的变化。