小鼠原发性肝正弦内皮细胞的分离与表征
2021年12月16日
在这里，我们概述并演示了原代小鼠肝脏正弦内皮细胞（LSEC）分离方案。该方案基于肝胶原酶灌注、低速离心纯化非实质细胞和CD146磁珠选择。我们还使用流式细胞术和扫描电子显微镜对这些分离的LSECs进行表型和表征。
在这里，我们展示了我们的原代小鼠肝脏正弦细胞分离或LSECs分离方案。该方案包括肝胶原酶灌注和用于非实质细胞纯化的低速超速离心和CD146磁珠选择。我们的LSEC分离方法非常高效，适用于健康和患病的小鼠肝脏。
分离的LSECs具有高纯度，并保持了结构和功能。使用此协议分离的LSECs是功能和分子研究以及多组学数据生成的最佳选择。该方案将有助于研究肝脏中的细胞间通讯。
首先在10厘米培养皿上涂上三毫升胶原蛋白溶液。然后，将培养皿在室温下孵育一小时。一小时后，从涂层表面除去多余的液体。
用PBS清洗碗碟三次，让它们风干。设置加热加湿的再循环灌注装置。使用10%漂白剂冲洗灌注系统五分钟。
然后，再次用无菌水冲洗系统10分钟。在用胶原酶溶液灌注之前，请尽可能多地沥干冲洗液。通过灌注系统注入胶原酶溶液，将其预热至37摄氏度。
在速度控制拨盘上将泵速设置为速度 1。在整个过程中保持相同的速度。称量鼠标以进行该过程。
然后将其固定在手术表面上。用70%乙醇喷洒小鼠腹部。使用手术剪刀，从腹部下部开始到xiphoid过程，做一个大约五厘米的切口。
之后，在腹部两侧使用小虹膜剪刀进行两次横向切口，以完全暴露腹部器官。将静脉导管的鞘放在动物的背部下方，以抬起并平整腹部。使用常规的弯曲敷料镊子，轻轻地将肠道和胃拉到动物的左侧。
然后，在下腔静脉或IVC下放置5-0的手术缝合线，就在暴露的左肾下方。在缝合线中系上松散的挂钩。接下来，在肝门静脉周围再放置一个5-0的手术缝合线。
将缝合线放在肝门静脉的脾静脉分支点的正上方。再次，在缝合线中系上松散的挂钩。使用门静脉缝合线作为张力，将 20 号静脉导管插入肝门静脉以下 1 厘米处，该导管向右和左肝门静脉分支。
然后，将导管向上滑动静脉，但将其保持在分支区域下方。让血液沿着导管向动，直到它开始滴出。用门静脉缝合线固定静脉导管。
使用IV线将带有缓冲液A的IV瓶连接到导管上。然后，用这种溶液冲洗肝脏，同时避免空气进入系统。将肾下方IVC周围的缝合线绑起来。
之后，将IVC切到缝合线下方，让动物流血。灌注后，切除附着在肝脏上的胃，肠，脾脏和其他内脏。然后，从胸腔切除隔膜和主要血管。
从动物身上取出肝脏并将其放在灌注盘上。小心地取出静脉输液管线，并将胶原酶溶液连接到再循环室中。让肝脏灌注，直到胶囊变得模型化并呈现糊状。
这通常需要 10 到 15 分钟。消化后，从腔室中取出肝脏并将其放在10厘米的培养皿上，其中含有约20毫升无血清DMEM。用几个移液器吸头轻轻挑开肝脏，丢弃胆道树。
之后，通过70微米的细胞过滤器将肝脏悬浮液过滤到50毫升的锥形管中。在室温下以50倍G离心细胞悬浮液两分钟。然后，收集含有非实质肝细胞的上清液。
将上清液在4摄氏度下以300倍G离心五分钟。之后，收集细胞沉淀并将其重悬于一毫升分离缓冲液中。按照制造商的说明使用自动细胞计数器确定细胞编号。
接下来，离心细胞悬浮液。完全吸出上清液，并用每1000万个细胞90微升的分离缓冲液重悬沉淀。每1000万个细胞中加入10微升CD146微珠。
充分混合，在4摄氏度下孵育15分钟。为了洗涤细胞，每1000万个细胞加入1至2毫升的分离缓冲液。将溶液以300倍G离心10分钟。
之后，完全吸出上清液，并在500微升的分离缓冲液中重悬多达10亿个细胞。接下来，通过用三毫升分离缓冲液冲洗来制备分离柱。将细胞悬浮液涂在堆叠有70微米预分离过滤器的色谱柱上。
用三毫升分离缓冲液洗涤色谱柱三次。之后，从分离器中取出色谱柱并将其放在15毫升离心管上。将五毫升分离缓冲液移液到色谱柱上。
要恢复磁珠标记的细胞，请用力将柱塞推入色谱柱以冲洗出细胞。最后，在4摄氏度下以300倍G离心细胞5分钟。用流式细胞术评估分离的LSECs纯度和表面标志物。
门控LSEC和单线的数据分析和门控策略基于前向散射和侧散射数据。用活性染料和CD45，CD146和稳定素-2抗体的组合染色分离的LSECs。对CD45阴性人群进行活LSECs门控，并分析CD146和稳定素-2的表达。
从这些数据中可以证实，分离出的LSECs具有大于94%的生存能力和大于90%的纯度。使用光学显微镜和扫描电子显微镜进一步证实了分离细胞的LSAC特异性表型。分离的LSECs在完整的生长培养基中培养六小时，并通过光学显微镜检查。
SEM图像中的白色箭头表示LSE开窗，这是LSEC的特征性形态特征。确保肝脏组织完全灌注的关键步骤是正确的导管胶带定位，避免在导管中引入空气，以及胶原酶消化的最佳时机。使用我们的方案获得的高质量LSEC将有助于鉴定LSEC功能的分子机制，并将提高我们对它们在肝脏，健康和疾病中细胞间通讯中的作用的理解。
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概述
本研究展示了一种使用肝脏胶原酶灌流和磁珠选择高效分离小鼠肝脏窦内皮细胞（LSECs）的协议。分离出的LSECs保持高纯度和活力，适合用于各种功能和分子研究。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 肝脏生理学
- 内皮细胞功能
背景
- LSECs在肝脏生物学和细胞间通讯中起着关键作用。
- 分离高纯度LSECs对于研究肝脏功能和相关疾病至关重要。
- 该协议为从健康和患病的小鼠肝脏中分离LSECs提供了可靠的方法。
使用的方法
- 肝脏胶原酶灌流后进行低速超速离心。
- 以小鼠肝脏为生物系统。
- 流式细胞术和扫描电子显微镜用于细胞表征。
主要结果
- 该协议获得的LSECs纯度超过90%和活力超过94%。
- 分离的LSECs保留其结构和功能，适合后续分析。
- 该方法促进了肝脏功能和细胞相互作用的高级研究。
结论
- 本研究提出了一种从小鼠肝脏中分离LSECs的有效方法。
- 该协议显著有助于理解肝脏生物学和疾病机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-purity isolation and characterization of mouse liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) enables robust investigation of liver microenvironment mechanisms relevant to metabolic, inflammatory, and fibrotic disease models. This protocol supports predictive confidence in early discovery and target validation by providing standardized, reproducible access to primary LSECs from both healthy and disease states. The approach facilitates translational continuity for multi-omics and functional studies across the preclinical pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LSEC-specific pathways implicated in liver disease mechanisms.
- Supports biological de-risking by providing functionally validated primary endothelial cells.
- Facilitates mechanistic studies of intercellular communication within the hepatic niche.
- Improves predictive confidence for target selection in metabolic and fibrotic disease models.
Screening & Assay Development
- Provides a validated source of primary LSECs for quantitative adhesion and permeability assays.
- Enables assay standardization and reproducibility through high-purity cell preparations.
- Supports downstream screening workflows requiring disease-relevant endothelial systems.
- Facilitates platform reuse for multi-omics and pathway-specific analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant model systems for NAFLD and chronic liver injury studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using primary cell-based assays.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into LSEC function.
- Facilitates biomarker discovery and validation in translational liver research.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality LSECs for hypothesis testing, pathway analysis, and multi-omics profiling.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking and pathway clarification in liver disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for functional and molecular assays.
- Analytics: Enables flow cytometry and electron microscopy-based characterization for comparative studies.
- Translational Research: Provides primary cell systems for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for LSEC isolation across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in liver research.
- Operational Value: Standardizes LSEC isolation for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in perfusion techniques and primary cell isolation.
- Needs access to flow cytometry, electron microscopy, and magnetic bead separation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for consistent cell purity and viability metrics.
- Adaptable to both healthy and disease model systems for broad research applicability.
- Dependent on precise perfusion and digestion timing for optimal cell yield and quality.
