Name: 小鼠原发性肝正弦内皮细胞的分离与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习使用胶原酶灌注和CD146磁珠分选技术从小鼠肝脏中分离高纯度肝窦内皮细胞的方法。该方案可获得纯度超过90%、存活率大于94%的细胞，适用于功能研究、分子分析及多组学数据生成，为研究肝脏细胞间通讯和疾病机制提供可靠工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）糖尿病与消化及肾脏疾病研究所（1RO1DK122948，授予SHI）以及NIH Silvio O. Conte 消化系统疾病研究中心核心项目P30资助机制（DK084567）提供支持。KF还获得了日本促进科学学会（JSPS）海外研究奖学金的支持。我们还要感谢Gregory J. Gores博士和Steven Bronk在胶原酶灌注装置的初始设计与优化方面所做的贡献。

动物实验方案经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后实施。八周龄雄性C57BL/6J小鼠购自杰克逊实验室。小鼠饲养于温度可控、12小时光照与12小时黑暗循环的设施中，并可自由进食。
1. 胶原包被培养皿或培养板的制备
<ol>
	<li>配制 50 mL 浓度为 0.02 mol/L 的乙酸溶液：将 0.6 mL 冰乙酸加入 49.4 mL 的 H2O 中。</li>
	<li>用 0.02 mol/L 乙酸溶液配制浓度为 50 µg/mL 的 I 型胶原蛋白溶液。稀释倍数需根据批次浓度进行调整。</li>
	<li>用 3 mL 胶原蛋白溶液包被 10 cm 培养皿，室温（RT）孵育 1 小时。 
	注意：若使用其他规格的培养皿或培养板，需根据培养面积调整包被液体积，通常使用 6–10 µg/cm2。</li>
	<li>去除包被表面多余的液体，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 3 次，然后让培养皿自然风干。</li>
	<li>若胶原蛋白溶液未经过灭菌处理，需将包被后的培养皿置于无菌细胞培养操作台内，用紫外线（UV）照射 10 分钟进行灭菌。</li>
</ol>
2. 仪器设备设置
<ol>
	<li>按照图1B所示设置加热加湿的循环灌注装置。</li>
	<li>先用10%次氯酸钠溶液冲洗灌注系统5分钟，再用无菌水冲洗10分钟。</li>
	<li>在灌注胶原酶溶液前，尽可能排干冲洗液。</li>
	<li>将胶原酶溶液通过灌注系统（如图1B所示）进行循环，以在37 °C预热。将泵速设定为速度控制旋钮上的1档（相当于40 mL/min）。</li>
	<li>在整个操作过程中保持该流速不变。在肝窦内皮细胞（LSEC）分离当天，可将胶原酶溶液在闭路循环中重复使用。 
	&#8203;注意：泵速固定为1，以避免机械压力对LSECs生物学状态造成干扰。</li>
</ol>
3. 手术操作
<ol>
	<li>称量小鼠体重。</li>
	<li>按每公斤体重90 mg的剂量腹腔注射（IP）氯胺酮，同时按每公斤体重10 mg的剂量注射赛拉嗪。</li>
	<li>当小鼠对疼痛刺激无反应时，将小鼠固定在手术台面上，如图1B所示。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠腹部。使用手术剪从腹部下端开始向上至剑突处做一条长约~5 cm的切口。</li>
	<li>接着，使用小型虹膜剪在腹部两侧各做两个横向切口，以充分暴露腹腔器官。</li>
	<li>将静脉（IV）导管的鞘管置于动物背部下方，以抬高并平整腹部。</li>
	<li>使用常规弯头敷料钳，轻轻地将肠管和胃向动物左侧拨开。</li>
	<li>在暴露的左肾下方的下腔静脉（IVC）下方放置一根5-0外科缝线，并在线上打一个松结。</li>
	<li>在脾静脉分叉处上方的门静脉（PV）周围放置另一根5-0外科缝线，并在线上打一个松结。</li>
	<li>利用PV处的缝线施加张力，将20 G静脉导管插入肝门静脉，位置在门静脉分叉为左右肝门静脉下方约1 cm处。</li>
	<li>将导管沿静脉向上推进，但保持在分叉区域下方。让血液沿导管流下，直至开始滴出。</li>
	<li>将装有缓冲液A（表1）的静脉输液瓶置于手术区域上方，通过输液管连接导管，用该溶液冲洗肝脏，同时避免空气进入系统。</li>
	<li>结扎肾脏下方的下腔静脉周围的缝线。这将使肝脏进行逆行灌注。</li>
	<li>在缝线下方剪断下腔静脉，使动物排空血液。 
	注意：此步骤必须迅速完成，以避免肝脏充血。</li>
	<li>用PV处的缝线固定静脉导管。</li>
	<li>开始灌注后，切除与肝脏相连的胃、肠、脾及其他内脏组织。</li>
	<li>切除膈肌及胸腔内的主要血管，取出肝脏并将其放置在灌注托盘上。</li>
	<li>小心移除静脉输液管，并连接循环腔中的胶原酶溶液。 
	注意：&#160;步骤3.16–3.18需在5分钟内完成，以免肝脏被缓冲液A灌注过久。操作时务必小心，避免任何气泡进入肝脏。</li>
	<li>继续灌注肝脏，直至肝脏包膜呈现斑驳状且质地变软（10–15分钟或更长，&#160;时间长短取决于不同批次的胶原酶活性）。</li>
	<li>在肝脏灌注过程中，确保动物已死亡，方可将其放入尸检袋中处理。</li>
	<li>消化完成后，将肝脏从灌注腔中取出，放入一个直径10 cm的培养皿中，加入约20 mL无血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
	<li>用几根移液器吸头轻轻撕开肝脏组织，并弃去胆管结构。</li>
	<li>将肝脏悬液通过70 µm细胞筛过滤至一个50 mL锥形管中。</li>
	<li>在室温下以50 × g离心2分钟，收集含有非实质肝细胞的上清液。 
	&#8203;注意：肝实质细胞会沉淀于沉淀物中，可通过梯度离心进一步纯化，方法如前所述15。</li>
</ol>
4. 非实质肝细胞的分离与肝窦内皮细胞（LSECs）的纯化
注意：按照制造商的说明，使用免疫磁珠纯化 CD146+ 肝窦内皮细胞（LSECs）。
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心上清液 5 分钟。</li>
	<li>收集细胞沉淀，并用 1 mL 分离缓冲液（表 1）重悬，按照制造商说明使用自动细胞计数仪测定细胞数量。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心细胞悬液 10 分钟，彻底吸弃上清液。</li>
	<li>每 107 个总细胞用 90 µL 分离缓冲液重悬沉淀。</li>
	<li>每 107 个总细胞加入 10 µL CD146 磁珠，充分混匀并在 4 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>为洗涤细胞，每 107 个细胞加入 1–2 mL 分离缓冲液，以 300 x g 离心 10 分钟，然后彻底吸弃上清液。</li>
	<li>将最多 109 个细胞重悬于 500 µL 分离缓冲液（表 1）中。 
	注意：若细胞数量更高，应相应增加缓冲液体积。</li>
	<li>准备分离柱，用 3 mL 分离缓冲液冲洗分离柱。</li>
	<li>将细胞悬液加载至装有 70 µm 预分离滤器的分离柱上。</li>
	<li>用 3 mL 分离缓冲液洗涤分离柱 3 次。 
	注意：洗涤分离柱时，应在柱储液腔排空后立即加入分离缓冲液。</li>
	<li>将分离柱从分离装置上取下，置于 15 mL 离心管上，用移液器向柱中加入 5 mL 分离缓冲液。</li>
	<li>为回收磁珠标记的细胞，用力将推杆插入柱中以冲洗出细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心 5 分钟。肝窦内皮细胞（LSECs）即可用于显微镜检查和后续分析。</li>
</ol>
5. 利用流式细胞术对肝窦内皮细胞进行免疫表型分析及纯度评估
<ol>
	<li>按照制造商说明，使用自动细胞计数仪测定分离得到的肝窦内皮细胞（LSECs）的细胞数量。</li>
	<li>以 300 x g 离心 5 分钟，彻底吸除上清液。</li>
	<li>取 1 x 106 个细胞/管，用 90 µL 染色缓冲液（表 1）重悬。</li>
	<li>每管加入 10 µL 小鼠 FcR 封闭剂和 1 µL 活性染料，于 4 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>使用染色缓冲液按 1:50 稀释的 CD45、CD146 和 stabilin-2 抗体组合对细胞进行染色，于 4 °C 孵育 20 分钟。</li>
	<li>用 5 mL 染色缓冲液洗涤细胞，以 300 x g 离心 10 分钟，然后彻底吸除上清液。</li>
	<li>用 300 µL 染色缓冲液重悬细胞，并上流式细胞仪检测。</li>
</ol>
6. 肝窦内皮细胞（LSECs）的培养与检测
<ol>
	<li>在6孔板中每孔接种1 × 106个细胞，并使用含有5%胎牛血清（FBS）、1%内皮细胞生长补充剂和1%普列霉素溶液的内皮细胞生长培养基进行培养。</li>
	<li>通过光学显微镜观察分离得到的肝窦内皮细胞（LSECs），并以10倍放大倍数获取明场图像。</li>
</ol>
7. 利用扫描电子显微镜观察肝窦内皮细胞的形态及窗孔结构
<ol>
	<li>用胶原蛋白溶液预包被细胞培养小室（3 µm 孔径）。</li>
	<li>将分离的肝窦内皮细胞（LSECs，120,000 个细胞）接种于插入式培养小室中，置于 24 孔板内，加入内皮细胞生长培养基，在 37 °C、湿润的培养箱中培养。静置孵育 2 小时，使细胞沉降并贴壁。</li>
	<li>细胞固定时，向细胞培养基中加入等体积、预热至 37 °C 的 Trump 固定液。</li>
	<li>孵育 10 分钟后，将 50% 稀释的 Trump 固定液更换为未稀释的 Trump 固定液。</li>
	<li>在 Trump 固定液中固定细胞 2 小时，随后在 1% 四氧化锇溶液中孵育 1 小时。</li>
	<li>随后进行样品脱水、临界点干燥仪干燥、制样、溅射镀膜，并使用扫描电子显微镜进行观察。</li>
</ol>

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<li>Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+identifies+distinct+subsets+of+endothelial+cells+in+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver.</a> Scientific Reports. 7, 44356(2017).</li>
<li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-cell+sequencing+enables+spatial+gene+expression+mapping+of+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells.</a> Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).</li>
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所有作者均无利益冲突需要披露。

在本论文中，我们描述了一种从小鼠肝脏分离肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案，该方案包括两步胶原酶灌注及随后的磁珠激活细胞分选（MACS）。该方案包含以下三个步骤：（1）先通过门静脉（PV）灌注无钙缓冲液，随后灌注含胶原酶的缓冲液，以实现肝细胞的分散；（2）通过低速离心去除肝实质细胞（即肝细胞）；（3）利用抗CD146磁珠对非实质细胞（NPCs）进行基于MACS的LSEC阳性筛选。整个操作过程可在3小时内完成。此外，包括所有耗材在内的单只小鼠实验成本约为150美元，表明该LSEC分离方法整体上高效且经济。我们同样使用步骤（1）和（2）来分离原代小鼠肝细胞，但该应用不在本论文的讨论范围之内。
门静脉插管和肝脏灌注中有几个关键步骤：（i）&#160;导管定位：导管尖端应置于成年小鼠门静脉（PV）分叉远端至少3 mm处，该位置通常可在肝脏门部识别。若导管尖端插入门静脉过深，将影响部分肝叶的灌注。灌注不良的肝叶表现为无颜色变化，若能及时发现，可通过将导管轻微调整至门静脉更远端来纠正，此操作可能优化肝叶灌注。（ii）气泡：泵与门静脉之间的输注通路必须完全排除气泡。微量空气进入门静脉可导致空气栓...

肝窦内皮细胞（LSECs）排列在肝窦壁上，是肝脏中最丰富的非实质细胞1。与其他部位的毛细血管内皮细胞相比，LSECs 的特征在于其具有窗孔结构，并且缺乏典型的基底膜或隔膜2,3。因此，LSECs 具有独特的表型和结构特征，可增强其通透性和内吞能力，从而清除多种循环大分子物质，包括脂质和脂蛋白。LSECs 在实质细胞与非实质细胞（如星状细胞和免疫细胞）之间的相互作用中发挥关键作用。LSECs 通过维持星状细胞和库普弗细胞处于静息状态，在维持肝脏稳态中起重要作用4。LSECs 还通过介导循环白细胞的黏附和跨内皮迁移，调节肝脏免疫细胞群体的组成5,6。在急性和慢性肝损伤7过程中，包括缺血-再灌注损伤（IRI）8、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）9以及肝细胞癌（HCC），LSECs 会发生称为毛细血管化的表型改变，其特征是窗孔消失和基底膜形成10。这些 LSECs 的表型变化与细胞功能障碍相关，并获得促血栓形成、促炎和促纤维化特性。
已开发出多种从小鼠肝脏中分离肝窦内皮细胞（LSECs）的方法11。一些技术依赖于将非实质细胞与实质细胞分离，随后通过密度梯度离心从非实质细胞组分中纯化LSECs。该方法的局限性在于LSECs分离的最后步骤中可能存在污染性巨噬细胞，从而影响所分离LSECs的纯度12。本实验方案基于胶原酶灌注小鼠肝脏，并利用CD146+磁珠对非实质细胞进行阳性筛选以纯化LSECs。采用该方法分离的LSECs具有高纯度，并保持良好的形态和活力。这些LSECs适用于多种功能研究，包括通透性实验和黏附实验，也适用于对特定信号通路的下游分析。此外，随着临床研究和发现科学中生成大规模数据集的需求日益增长，这些高质量的LSECs（可来源于健康肝脏或患有非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其他疾病的肝脏）可单独使用或混合使用，从而实现多组学数据的生成，并进行健康与疾病状态之间的比较13,14。此外，分离得到的LSECs还可用于构建二维及三维体外模型（如类器官），以解析在不同有害刺激条件下以及在各种治疗干预下LSECs中被激活的信号通路及其与其他肝细胞之间的细胞间通讯机制。

<table><tbody><tr><td>2.0英寸 20 G 静脉（IV）导管</td><td>Terumo，美国新泽西州索默塞特</td><td>SR-OX2051CA</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;ndash;3英寸带中心孔的灌注盘</td><td></td><td></td><td>定制；实验室自制</td></tr><tr><td>405/520 活性染料</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-110-205</td><td></td></tr><tr><td>4英寸普通弯型敷料镊</td><td>Fisher Brand</td><td>FS16-100-110</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Perma-Hand 丝线缝合线</td><td>Ethicon，美国新泽西州拉里坦</td><td>A182H</td><td></td></tr><tr><td>抗-stabilin-2（小鼠）mAb-Alexa Fluor&amp;Atilde; 488</td><td>MBL International，美国马萨诸塞州伍本</td><td>D317-A48</td><td></td></tr><tr><td>BSA 储存液</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD146（LSEC）-PE，抗小鼠</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-118-407</td><td></td></tr><tr><td>CD146（LSEC）MicroBeads，小鼠</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>抗-CD45-Viogreen，抗小鼠</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-110-803</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>Corning，美国纽约州康宁</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基</td><td>ScienCell 研究实验室，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>FcR 封闭试剂，小鼠</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件，版本 10.6</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硬化精细剪刀</td><td>F.S.T，美国加利福尼亚州福斯特城</td><td>14091-11</td><td></td></tr><tr><td>加热（37 &amp;deg;C）加湿循环灌注装置，配备氧气注入系统，压力为 10 psi</td><td></td><td></td><td>定制；实验室自制</td></tr><tr><td>日立 S 4700 扫描电子显微镜</td><td>日立公司，美国加利福尼亚州普莱森顿</td><td>SEM096</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 预分离滤器（70 &amp;mu;m）</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>MACS 洗涤缓冲液</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart Strainer（70 &amp;mu;m）</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant 流式细胞仪</td><td>Miltenyi，德国贝尔吉施格拉德巴赫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell 细胞培养小室</td><td>Millipore Sigma，美国马萨诸塞州伯灵顿</td><td>PITP01250</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom 细胞计数仪</td><td>Nexcelom Bioscience，美国马萨诸塞州劳伦斯</td><td>Cellometer Auto T4 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare，美国伊利诺伊州芝加哥</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>F.S.T，美国加利福尼亚州福斯特城</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>极小弯型敷料镊</td><td>F.S.T，美国加利福尼亚州福斯特城</td><td>11063-07</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

肝窦内皮细胞（LSECs）是一类特殊的内皮细胞，位于血液循环与肝实质之间的界面。LSECs具有独特的形态特征，表现为存在窗孔结构且缺乏基底膜。LSECs在多种肝脏病理过程中发挥关键作用，包括代谢紊乱、炎症、纤维化、血管生成以及癌变。然而，关于LSECs的分离与鉴定方法，目前公开发表的研究仍较为有限。本文介绍了一种从健康小鼠及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠中分离LSECs的实验方案。该方案基于胶原酶灌注小鼠肝脏，并利用磁珠阳性筛选非实质细胞以纯化LSECs。本研究通过流式细胞术检测特异性标记物，并结合扫描电子显微镜观察其典型的表型特征，对分离所得LSECs进行鉴定。按照本方案分离的LSECs可用于功能研究，如细胞黏附和通透性检测，也可用于特定信号通路的下游分析。此外，这些LSECs可合并使用或单独使用，适用于多种组学数据的生成，包括RNA-seq（批量或单细胞）、蛋白质组学或磷酸化蛋白质组学，以及利用测序技术检测转座酶可及染色质（ATAC-seq）等。本方案将有助于研究者深入探究LSECs在生理和病理状态下与其他肝细胞之间的相互作用，并加深对LSECs在急性和慢性肝损伤致病机制中作用的理解。

实验示意图与设备设置： 
在本实验方案中，采用封闭式灌注回路消化小鼠肝脏，随后通过低速离心（50 × g，2 分钟）分离非实质细胞与肝细胞。从非实质细胞组分中，使用 CD146 磁珠分选法分离原代肝窦内皮细胞（LSECs）。实验流程示意图见图 1A。将套管插入门静脉（PV），同时结扎下腔静脉，以确保胶原酶单向流经肝脏（图 1B）。自制灌注腔室配备加热与加湿系统，以维持装置周围空气温度在 37–40 °C，并保持湿润环境。灌注所用胶原酶在封闭系统中循环，可在同一天内重复用于两到三只小鼠，从而提高分离过程的成本效益。
通过流式细胞术评估分离的肝窦内皮细胞纯度及表面标志物： 
采用已明确表征的特异性肝窦内皮细胞（LSEC）表面标志物 CD146 和 stabilin-216,<sup class="xre...

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。

肝窦内皮细胞（LSECs）是位于血液循环与肝实质交界处的一类特殊内皮细胞。

在此，我们展示了小鼠肝窦内皮细胞（LSECs）原代分离的实验方案。该方案包括肝脏胶原酶灌注、低速超速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选。我们的LSEC分离方法效率高，适用于健康及病变的小鼠肝脏。分离得到的肝窦内皮细胞（LSECs）纯度高，并能保持其结构和功能。采用本方案分离的LSECs适用于功能研究、分子研究以及多组学数据的生成。该方案将有助于肝脏内细胞间通讯的研究。首先，用3毫升胶原蛋白溶液包被10厘米的培养皿。然后，在室温下孵育培养皿1小时。1小时后，移除包被表面的多余液体。用 PBS 清洗培养皿三次，并使其自然风干。设置加热且加湿的循环灌注装置。使用 10% 次氯酸钠溶液冲洗灌注系统五分钟。然后，再用无菌水冲洗系统10分钟。在用胶原酶溶液灌注前，尽可能排干冲洗液。通过灌注系统注入胶原酶溶液，并预热至37摄氏度。将泵速调节至速度控制旋钮上的“1”档。在整个操作过程中保持速度不变。称量小鼠的体重以进行操作。然后将其固定在手术台面上。用70%乙醇喷洒小鼠腹部。使用手术剪，从腹部下端开始向上至剑突处，做一个约五厘米长的切口。随后，使用小型虹膜剪在腹部两侧各做两个侧向切口，以充分暴露腹腔器官。将静脉留置针的套管鞘置于动物背部下方，以抬高并拉平腹部。用普通的弯头敷料镊子，轻轻地将肠管和胃向动物左侧拨开。然后，在暴露的左肾下方的下腔静脉（IVC）下方放置一根5-0外科缝线。将缝线打一个松散的结。接下来，在肝门静脉周围放置另一根5-0外科缝线。将缝线置于肠系膜上静脉与门静脉汇合点稍上方，再次在缝线上打一个松散的结。利用门静脉缝线施加张力，将20号静脉留置针插入肝门静脉，进针位置位于门静脉分为左右肝支以下1厘米处。然后，将导管沿静脉向上推进，但需保持在分支区域下方。让血液沿导管向下流动，直至开始滴出。使用门静脉缝线固定静脉导管。使用静脉输液管将装有缓冲液A的输液瓶连接到导管上。然后用该溶液冲洗肝脏，同时避免空气进入系统。在肾脏下方结扎下腔静脉周围的缝线。随后，剪断结扎线以下的下腔静脉，使动物排血。开始灌注后，切除与肝脏相连的胃、肠、脾脏及其他内脏器官。然后，剪除胸腔内的膈肌和主要血管。将肝脏从动物体内取出并放置在灌注托盘上。小心移除静脉输液管，并将循环腔室中的胶原酶溶液连接上。持续灌注肝脏，直至其包膜变软并呈现松软状态。此过程通常需要 10 到 15 分钟。消化完成后，将肝脏从消化腔中取出，置于含有约 20 毫升无血清 DMEM 的 10 厘米培养皿中。用几支移液器吸头轻轻将肝脏组织撕解，弃去胆管树组织。随后，将肝脏悬液通过70微米细胞滤网过滤至50毫升锥形管中。在室温下以50 × g离心细胞悬液2分钟。然后，收集含有非实质肝细胞的上清液。在4°C条件下，以300 × g离心上清液5分钟。随后，收集细胞沉淀，并将其重悬于1 mL分离缓冲液中。按照制造商说明书，使用自动细胞计数仪测定细胞数量。接下来，离心细胞悬液。完全吸除上清液，并按每1000万个细胞加入90微升分离缓冲液的比例重悬细胞沉淀。按每1000万个总细胞加入10微升CD146 MicroBeads。充分混匀，并在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。洗涤细胞时，每 1000 万细胞加入 1 至 2 毫升分离缓冲液。在 300 ×g 条件下离心 10 分钟。随后，彻底吸除上清液，并将最多十亿个细胞重悬于500微升分离缓冲液中。接下来，用3毫升分离缓冲液冲洗分离柱以进行准备。将细胞悬液加入装有70微米预分离滤器的分离柱中。用三毫升分离缓冲液洗涤层析柱三次。随后，将层析柱从分离装置上取下，置于一个15毫升离心管上。用移液器将五毫升分离缓冲液加到层析柱上。为回收磁珠标记的细胞，需用力将柱塞推入色谱柱以冲洗出细胞。最后，在4°C条件下以300 × g离心5分钟。采用流式细胞术检测分离所得LSECs的纯度及表面标志物。基于前向散射和侧向散射数据，对门控的肝窦内皮细胞（LSECs）和单细胞进行数据分析和设门策略。分离的LSECs使用活力染料以及CD45、CD146和Stabilin-2抗体组合进行染色。通过CD45阴性群体圈选活的LSECs，并分析其CD146和Stabilin-2的表达情况。根据这些数据，确认分离得到的肝窦内皮细胞（LSECs）活力超过94%，纯度超过90%。通过光学显微镜和扫描电子显微镜进一步验证了分离细胞的LSEC特异性表型。分离的LSECs在完全培养基中培养6小时后，进行光学显微镜观察。扫描电镜图像中的白色箭头指示肝窦内皮细胞（LSEC）的窗孔结构，这是LSEC的典型形态学特征。确保肝脏组织完全灌注的关键步骤包括：正确固定导管胶带位置、避免将空气引入导管，以及胶原酶消化的最佳时机。采用本方案获得的高质量LSEC将有助于阐明LSEC功能的分子机制，并增进我们对LSEC在肝脏生理与疾病状态下细胞间通讯作用的理解。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

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