Name: 半乳糖凝集素-3 - U1 snRNP复合物在珠子上的剪接活性的补充 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解半乳糖凝集素-3与U1 snRNP复合物在珠子上的剪接活性重组方法。该方案通过免疫选择技术实现U1 snRNP耗竭与功能重建，为研究RNA剪接机制提供重要实验依据。

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本工作得到了美国国家科学基金会资助项目MCB-0092919和密歇根州立大学校内研究资助项目09-CDFP-2001（授予RJP）以及美国国立卫生研究院资助项目GM-38740和密歇根州农业生物研究所项目MICL02455（授予JLW）的支持。
剪接实验中使用的MINX前体mRNA底物由苏珊·伯格特博士（Dr. Susan Berget，美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院）惠赠。

1. 一般操作的注意事项
<ol>
	<li>确保所有化学品（缓冲液组分、酶等）均无核糖核酸酶（RNase）污染。将所有 commercially 购买的试剂瓶与常规实验室使用区分开。实验操作的每一步均需佩戴手套。仅使用经过烘烤处理（见下文步骤 1.2）的玻璃器皿和工具，以及经过预处理（见下文步骤 1.3）的溶液。</li>
	<li>将所有玻璃器皿（烧杯、锥形瓶、试剂瓶、移液管等）在 177 °C 下至少烘烤 4 小时。其他工具（药匙、磁力搅拌子等）需先用铝箔包裹，再在相同条件下进行烘烤。</li>
	<li>用双蒸水（ddH2O）配制 0.1%（体积/体积）的焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液。使用磁力搅拌子搅拌过夜，然后进行高压灭菌。使用经 DEPC 处理的 H2O 配制所有含 Tris 的溶液，随后使用瓶顶式真空滤器过滤除菌。配制其他不含 Tris 的溶液时，使用普通的 ddH2O，然后加入 DEPC 至终浓度 0.1%（体积/体积），再进行高压灭菌。 
	注意：本组实验步骤中所用缓冲液按字母顺序列于表 1中。</li>
</ol>
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液名称</td>
			<td>成分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>硼酸盐缓冲液</td>
			<td>0.2 M 硼酸钠，pH 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缓冲液 C</td>
			<td>20 mM HEPES，pH 7.9，25% (vol/vol) 甘油，0.42 M NaCl，1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA，0.5 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)，0.5 mM 二硫苏糖醇 (DTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缓冲液 D</td>
			<td>10 mM HEPES，pH 7.9，20% (vol/vol) 甘油，0.1 M KCl，0.2 mM EDTA，0.5 mM PMSF，0.5 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60%D</td>
			<td>60% 缓冲液 D 和 40% H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙醇胺</td>
			<td>0.2 M 乙醇胺，pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 结合缓冲液</td>
			<td>20 mM HEPES，pH 7.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 洗涤缓冲液</td>
			<td>20 mM HEPES，pH 7.9，0.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 上样缓冲液</td>
			<td>90% 甲酰胺，20 mM EDTA，pH 8，0.05% (w/v) 溴酚蓝</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE 缓冲液</td>
			<td>25 mM Tris，169 mM 甘氨酸，0.1% 十二烷基硫酸钠 (SDS)，pH 8.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS 样品缓冲液</td>
			<td>62.5 mM Tris，pH 6.8，2% SDS，10% 甘油，5% 2-巯基乙醇，0.1% (w/v) 溴酚蓝</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>用于 RNA 凝胶的 TBE 缓冲液</td>
			<td>89 mM Tris，89 mM 硼酸，2.5 mM EDTA，pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE 缓冲液</td>
			<td>10 mM Tris，pH 8，1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转膜缓冲液</td>
			<td>25 mM Tris，1.92 M 甘氨酸，20% 甲醇，pH 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-TBS 缓冲液</td>
			<td>10 mM Tris，0.5 M NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX 洗涤缓冲液</td>
			<td>60%D 中含 0.05% Triton X-100 (TX)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：缓冲液名称与成分

2. 缺失U1 snRNP的核提取物（U1 ΔNE）的制备
<ol>
	<li>用于免疫吸附的抗U1珠的制备
	<ol>
		<li>将50 mg Protein A-Sepharose CL-4B珠加入过量的DEPC处理过的H2O中预溶胀，以获得约200 µL溶胀后的珠，并用HEPES洗涤缓冲液洗涤。</li>
		<li>在此次及所有后续洗涤步骤中，通过离心（在4 °C下，摆桶转子中1,000 x g离心10–15秒）使珠沉淀，然后用微量移液器移除未结合的洗涤液并弃去。</li>
		<li>将150 µL洗涤后的珠与150 µL针对U1 snRNP的特异性人自身免疫血清混合（抗体体积与珠体积之比为1:1）。</li>
		<li>根据上述第2.1.3步的总体积（约300 µL），将混合物调整至20 mM HEPES、pH 7.9，使其符合HEPES结合缓冲液的条件；将此混合物在室温下持续振荡孵育60分钟。</li>
		<li>用1 mL硼酸盐缓冲液（0.2 M硼酸钠，pH 9）洗涤与抗体结合的珠，并重悬于1 mL相同的硼酸盐缓冲液中。</li>
		<li>为将结合在Protein A-Sepharose珠上的抗体共价偶联，加入二甲基戊二咪酯至终浓度为20 mM，并在室温下振荡孵育60分钟。</li>
		<li>用1 mL硼酸盐缓冲液洗涤珠。</li>
		<li>为封闭任何未反应的交联试剂，加入1 mL 0.2 M乙醇胺（pH 8），并在室温下振荡孵育60分钟。</li>
		<li>用0.5 mL TX洗涤缓冲液（含0.05% Triton X-100的60% D）将抗体偶联的珠（此后称为抗U1珠）洗涤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从核提取物（NE）中去除U1 snRNP（见图1A） 
	&#8203;注意：从HeLa细胞制备核提取物（NE）的方法最初由Dignam等人建立20。我们已描述了用于剪接分析的核提取物制备的材料和详细方法19（参见该文献中的步骤2.1和3.1）。最初制备的NE处于Buffer C中，此后称为NE(C)。经透析并用Buffer D平衡的NE将称为NE(D)。
	<ol>
		<li>将200 µL NE(C)与上述第2.1.9步制备的100 µL抗U1珠共同孵育。</li>
		<li>向混合物中加入5 µL RNasin&#160;。</li>
		<li>在4 °C下将微量离心管头尾翻转旋转1小时。</li>
		<li>通过离心（在4 °C下，摆桶转子中1,000 x g离心10–15秒）使混合物沉淀，使用Hamilton注射器收集未结合的上清液（U1ΔNE）。</li>
		<li>将全部体积的U1ΔNE以及另外50 µL未经耗竭的原始&#160;NE(C)分装至微型透析器的不同腔室中，使用截留分子量为8 K的透析膜，在60% D中搅拌透析75分钟。</li>
		<li>透析完成后立即分别将这些样品（U1ΔNE和处于60% D中的NE）分装为20 µL等份，迅速在干冰/乙醇浴中冷冻，并&#160;于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析U1ΔNE及结合在抗U1珠上的物质的RNA和蛋白质组成
	<ol>
		<li>在移除未结合物质（U1ΔNE）（第2.2.4步）后，通过加入0.5 mL TX洗涤缓冲液洗涤结合在抗U1珠上的物质。通过离心（在4 °C下，摆桶转子中1,000 x g离心10–15秒）使混合物沉淀，用微量移液器移除上清液并弃去。</li>
		<li>重复第2.3.1步的洗涤操作两次。</li>
		<li>向100 µL珠中加入100 µL 2x SDS样品缓冲液，室温孵育10分钟，以洗脱结合在抗U1珠上的物质。</li>
		<li>通过离心（在4 °C下，摆桶转子中1,000 x g离心10–15秒）使混合物沉淀；用Hamilton注射器移取上清液，并在干冰/乙醇浴中迅速冷冻。于-80 °C保存。</li>
		<li>比较未耗竭的NE、耗竭后的NE（U1ΔNE）以及结合在珠上的物质（通过上述第2.3.3和2.3.4步所述的SDS样品缓冲液从珠上洗脱）。进行RNA分析时遵循第2.3.6–2.3.8步，进行蛋白质分析时遵循第2.3.9–2.3.10步。</li>
		<li>对每个样品，用200 µL苯酚-氯仿（50:50, v/v）提取RNA；再用180 µL氯仿-异戊醇（25:1, v/v）再次提取。提取后加入300 µL冷的无水乙醇，颠倒混匀，将沉淀的RNA在-20 °C下保存过夜。</li>
		<li>将乙醇沉淀的RNA离心（4 °C下12,000 x g离心10分钟）。用150 µL冷的70%乙醇洗涤沉淀。再次在4 °C下以12,000 x g离心15分钟。用微量移液器移除上清液，并在无加热条件下用真空浓缩仪干燥沉淀10–15分钟。</li>
		<li>将干燥的RNA沉淀重悬于10 µL RNA上样缓冲液中，轻轻涡旋，75–85 °C加热90秒，然后在冰上孵育2分钟。通过13%聚丙烯酰胺-8.3 M尿素凝胶电泳分离snRNA（16 mA恒流电泳2小时），随后可用溴化乙锭染色或进行Northern印迹分析10,16。</li>
		<li>将第2.3.5步中含SDS样品缓冲液的蛋白质样品上样至12.5%聚丙烯酰胺凝胶，在SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）缓冲液中以200 V电泳约45–50分钟。&#160;</li>
		<li>在转移缓冲液中以400 mA电流将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜2小时。转移后，在含10%脱脂奶粉的T-TBS中孵育过夜以封闭膜。然后进行免疫印迹以检测特定蛋白质8,21。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用抗 Gal3 抗体对甘油梯度中 10S 组分进行免疫沉淀
<ol>
	<li>用于免疫吸附的抗Gal3珠的制备 
	&#8203;注意：针对兔子#24的Gal3兔多克隆抗血清的制备与表征21 以及兔子 #4910&#160;已经&#160;如前所述。
	<ol>
		<li>使用兔#49的前免疫血清作为对照。</li>
		<li>制备抗Gal3珠时，请参照抗U1珠的制备步骤（步骤2.1），但与步骤2.1.3相对应的操作中，抗血清（如抗Gal3，#49）与珠的体积比为3:1。</li>
		<li>使用前，用 0.5 mL TX 洗涤缓冲液将抗体偶联的磁珠（下文简称抗 Gal3 磁珠）洗涤两次。先用微量移液器吸除大部分上清液，再用 Hamilton 注射器彻底吸出磁珠中的液体；弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蔗糖梯度组分的抗Gal3免疫沉淀（参见 图1B)
	<ol>
		<li>在12%-32%的甘油梯度中对NE(D)进行分级分离10将蔗糖梯度组分3、4和5（从梯度顶部开始编号）混合，这些组分位于梯度约10S区域附近。</li>
		<li>准备两个样品，每个样品加入150 µL合并的梯度组分3-5（步骤3.2.1），并置于50 µL抗Gal3珠中。</li>
		<li>同时，分别准备两份样品，每份含有150 µL的第1组分（包含未与U1 snRNP形成复合物的Gal3）10；步骤3.2.1）加入50 µL抗Gal3磁珠中。</li>
		<li>作为对照，将150 µL的60% D加入另一含有50 µL抗Gal3珠的微量离心管中。</li>
		<li>轻轻敲击离心管混匀，然后在4℃下头尾翻转旋转微量离心管°37°C 下孵育 1 小时。</li>
		<li>通过轻柔离心（1,000 x g 在4 °C条件下，使用摆桶式转子离心10-15秒。</li>
		<li>使用 Hamilton 注射器移除上清液（未结合物质）。不要洗涤磁珠，并立即用于添加剪接反应（第 4.2 节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10S 梯度组分中抗 Gal3 沉淀物的未结合与结合组分的 RNA 和蛋白质含量分析
	<ol>
		<li>为分析10S梯度组分经抗Gal3沉淀后结合与未结合组分，收集未结合组分（步骤3.2.6后的上清液），转移至新的微量离心管中，并于-20 °C保存。</li>
		<li>将步骤 3.2.6 中的沉淀珠（含有与抗 Gal3 结合的物质）用 0.5 mL TX 洗涤缓冲液洗涤。</li>
		<li>通过温和离心（1,000 x g）使混合物沉淀 g 在4 °C下以摆桶转子离心10–15秒；用微量移液器吸除上清液并弃去。重复洗涤步骤两次。</li>
		<li>向洗涤并离心收集的抗Gal3珠中加入50 µL 2X SDS样品缓冲液。</li>
		<li>轻轻混匀珠子，并在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>通过温和离心（1,000 x g）使混合物沉淀 g 在4 °C下以摆桶转子离心10–15秒，用汉密尔顿注射器收集上清液，并转移至新的微量离心管中，于-20 °C保存。</li>
		<li>比较抗Gal3沉淀的未结合部分（第3.3.1节）与结合部分（第3.3.6步）中的RNA和蛋白质组分，分别采用第2.3.6至2.3.10步所述的操作步骤进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 剪接反应的组装及产物分析
<ol>
	<li>剪接底物的制备 
	&#8203;注意：前体mRNA底物（指定为MINX）包含来自腺病毒的两个外显子序列和一个内含子序列22质粒中的MINX DNA序列受T3、T7或SP6 RNA聚合酶启动子的调控。线性化MINX质粒DNA所用材料及详细方法包括：使用BamHI限制性内切酶进行消化，随后在α-存在条件下由SP6 RNA聚合酶进行转录32P[GTP] 及其纯化 32用于剪接实验的P标记MINX已在先前文献中描述19 （参见该参考文献中的步骤 2.2 和 3.2）。
	<ol>
		<li>将放射性标记的MINX以乙醇沉淀形式于-20 °C保存；标记的剪接底物应在体外转录后4–6周内使用。</li>
		<li>使用前立即离心乙醇沉淀物 32P标记的MINX在12,000 x下 g 4 °C下离心10分钟；用移液器吸除上清液并弃去。</li>
		<li>加入150 µL 70%乙醇，于12,000 x g离心 g 4 °C下离心15分钟。弃去上清液，将沉淀物在无热条件下用真空浓缩仪干燥15分钟。</li>
		<li>在50 µL的DEPC水中重悬沉淀。取2 µL分别点在两张GF/C滤膜上；将滤膜浸入冷的5%三氯乙酸（TCA）中10分钟。用冷的5% TCA冲洗，再用180-proof乙醇在真空抽滤瓶中冲洗。将滤膜空气干燥，然后在4 mL Safety-Solve中进行液体闪烁计数。</li>
		<li>稀释 32P标记的MINX在60% D中至104 剪接实验中的每微升计数（cpm/µL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剪接反应的组装（参见 图1C)
	<ol>
		<li>在冰上组装，&#160;在总体积为24 µL的体系中进行剪接反应（含8 µL U1ΔNE（来自步骤2.2.6）、3.5 mM MgCl₂）2, 1.5 mM ATP，20 mM 磷酸肌酸，0.5 mM DTT，20 单位 RNasin，4 µL 32P标记的MINX剪接底物（104 cpm/µL），60% D），并加入至3.2.7节中的每管磁珠中。另配制一组完全相同的剪接反应体系，总体积为24 µL，但不加入U1ΔNE，同样加入至3.2.7步骤中的每管磁珠中。</li>
		<li>在12 µL总体积中配制对照剪接反应体系（4 µL NE(D)，3.5 mM MgCl₂，150 mM NaCl，1 mM DTT，5%甘油，0.1 mM ATP，0.1 U/µL RNase抑制剂，20 U RNase抑制剂，0.1 µg/µL酵母tRNA，以及2.5 nM质粒DNA模板）2，1.5 mM ATP，20 mM 磷酸肌酸，0.5 mM DTT，20 单位 RNasin，2 µL 32P标记的MINX剪接底物（104 cpm/µL），60% D）</li>
		<li>轻轻敲击离心管混匀，并以30次/分钟的转速颠倒混匀°C 下孵育 90 分钟。在 1,000 x g 条件下轻轻离心收集沉淀 g 在4 °C条件下，以摆桶转子离心10-15秒。</li>
		<li>通过向含有珠子的离心管中加入24 µL的2x SDS上样缓冲液，向不含珠子仅含NE的对照管中加入12 µL的2x SDS上样缓冲液，以终止反应并洗脱珠子上的蛋白质。将各管在100 °C加热7分钟。</li>
		<li>轻轻离心试管，1,000 x g g 在4 °C条件下，以摆桶转子离心10-15秒。</li>
		<li>将上清液（洗脱液）转移至新的微量离心管中：从珠子管中转移约 48 µL，从 NE 对照管中转移 24 µL。</li>
		<li>加入蛋白酶K（20 mg/mL）以消化并溶解蛋白质：向珠子洗脱液48 µL中加入5 µL，向NE对照24 µL中加入2.5 µL。</li>
		<li>37℃孵育试管°40 分钟，4 °C</li>
		<li>轻轻离心试管，1,000 x g g 在4 °C下以摆桶转子离心10 s。</li>
		<li>将珠子洗脱液用39.5 µL TE和10 µL 3 M乙酸钠稀释。将NE对照用63.5 µL TE和10 µL 3 M乙酸钠稀释。</li>
		<li>按照下文所述方法提取并分析RNA（第4.3节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剪接反应产物的分析
	<ol>
		<li>用酚-氯仿提取各样品中的RNA，随后用氯仿-异戊醇进行抽提；用乙醇沉淀RNA，离心，洗涤沉淀，弃上清，干燥沉淀，操作步骤同2.3.6和2.3.7所述。</li>
		<li>将干燥的RNA沉淀重悬于10 µL RNA上样缓冲液中，轻轻涡旋，75–85 °C加热90秒，然后冰上孵育2分钟。</li>
		<li>配制20 mL含13%聚丙烯酰胺（双丙烯酰胺:丙烯酰胺，1.9:50 [wt/wt]）的8.3 M尿素溶液；用此溶液制备长度为15 cm的凝胶。</li>
		<li>凝胶制备完成后，使用TBE作为电泳缓冲液，在400 V电压下空跑电泳20分钟。此步骤结束后，用TBE电泳缓冲液冲洗加样孔。</li>
		<li>将RNA样品加入RNA上样缓冲液中，用TBE电泳缓冲液在400 V条件下电泳3.5至4小时。电泳结束后，将凝胶浸入蒸馏水中，摇动10分钟以去除尿素。</li>
		<li>将凝胶在3 M滤纸上真空干燥，先在80 °C下干燥2小时15分钟，然后在不加热条件下继续干燥30分钟以缓慢冷却。将干燥后的凝胶进行放射自显影，以检测放射性组分迁移的位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本报告提供了实验细节，证明被固定在抗Gal3包被的磁珠上的Gal3-U1 snRNP复合物能够结合pre-mRNA底物，并且该三元复合物可恢复U1 snRNP耗竭的核提取物（NE）中的剪接活性。Gal3是凝集素蛋白家族的一个成员，最初因其对半乳糖特异的碳水化合物结合活性而被分离出来23。早期的免疫荧光和亚细胞分级研究表明Gal3可能与剪接机器的组分相关：其与snRNP的Sm核心多肽以及丝氨酸-精氨酸富集（SR）剪接因子家族在核内斑点（nuclear speckles）中共定位24,25，并在氯化铯梯度离心中以与hnRNP和snRNP一致的密度（1.3–1.35 g/mL）沉降24。随后的耗竭-重建实验进一步表明，在无细胞剪接体系中，Gal3（以及凝集素家族的另一成员galectin-1（Gal1））是必需但功能冗余的因子7,<sup class="xref"...

大多数真核生物信使RNA（mRNA）的生成涉及在细胞核中进行的前体mRNA剪接过程，该过程通过切除内含子并将外显子连接起来完成1。两类核糖核蛋白复合物（RNPs）通过剪接体复合物介导前体信使RNA向成熟mRNA的加工。第一类为新生前体信使RNP，它在转录过程中由异质性核RNP蛋白及其他RNA结合蛋白（包括部分SR家族成员）结合形成，产生hnRNP复合物2。第二类为富含尿嘧啶的小核RNP（U snRNP，包含U1、U2、U4、U5和U6 snRNA），其与U特异性蛋白和核心蛋白相关联3,4。在内含子被切除、外显子被连接形成成熟mRNP的动态重排过程中，U snRNP以有序的方式与前体信使RNP的特定区域相互作用5。许多其他核蛋白也参与这些加工事件6。
半乳糖凝集素-1（Gal1）和半乳糖凝集素-3（Gal3）是剪接通路中的两个必需因子，这一点已在去除-重建研究中得到证实7,8。从具有剪接活性的核提取物（NE）中同时去除这两种半乳糖凝集素，会导致剪接体组装和剪接活性在早期阶段即被完全抑制。向这种双重去除了半乳糖凝集素的核提取物中添加任一类型的半乳糖凝集素，均可恢复上述两种活性。Gal1和Gal3是活性剪接体的组成成分，这可通过使用特异性针对Gal1或Gal3的抗血清沉淀前体mRNA、剪接中间产物以及成熟mRNA的结果得以证实9。重要的是，Gal3可在剪接通路之外与核提取物中含内源性U型小核RNA（snRNA）的颗粒结合，这一点已通过抗Gal3抗血清沉淀snRNP的实验得到证实10。最后，在HeLa细胞中沉默Gal3会改变多种基因的剪接模式11。
在用于解离预先形成的剪接体的核提取物（NE）预孵育体系中12，snRNP存在于多种复合物中，这些复合物在甘油梯度离心中沉降系数范围从7S至超过60S。尽管甘油梯度分级是分离剪接体复合物及其组分的常用技术（例如参见文献13,14,15），我们通过使用抗体进行免疫沉淀对特定组分进行了表征，拓展了该方法的应用。沉降系数为10S的snRNP仅含有U1 snRNA以及Gal3。利用针对Gal3或U1 snRNP的特异性抗血清对10S组分进行免疫沉淀，可共沉淀U1和Gal3，表明部分U1 snRNP单粒子与Gal3结合10。由于U1 snRNP是剪接体组装过程中首个结合前体mRNP的复合物1,5，该步骤代表了Gal3进入剪接通路的一个潜在切入点。基于此，我们证明了与含抗Gal3的磁珠结合的10S Gal3-U1 snRNP单粒子能够恢复U1 snRNP耗竭的核提取物（NE）中的剪接活性，从而确立该复合物是Gal3被招募进入剪接体通路的一种机制16。这与试图在剪接反应的特定阶段分离剪接体并鉴定其相关因子的研究形成对比17,18。在后一类研究中，仅能确定某些因子在某一时间点的存在，而无法揭示其被加载至剪接体的机制。
我们先前已在关于半乳糖凝集素在pre-mRNA剪接中作用的文献中详细描述了核提取物（NE）的制备、剪接底物的制备、剪接反应体系的组装以及产物分析方法19。本文中，我们进一步描述了对核提取物进行分级分离以获得富含Gal3-U1 snRNP复合物的组分，以及通过免疫筛选该复合物，从而在U1缺失的核提取物中重建剪接活性的实验步骤。
<img alt="显示U1 snRNP、Gal3相互作用及甘油梯度分级的剪接重建示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61990/61990fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：核提取物中U1 snRNP缺失后，通过珠上Gal3-U1 snRNP复合物恢复剪接活性的示意图。（A）在缓冲液C中的核提取物（NE(C)）与共价偶联抗U1 snRNP抗体的Protein A-Sepharose珠（αU1珠）孵育。未结合组分即为U1 snRNP耗竭的提取物（U1ΔNE）。（B）在缓冲液D中的核提取物（NE(D)）经12%-32%甘油梯度超速离心分级。对应10S区段的组分（第3–5组分）被合并，并与共价偶联抗Gal3抗体的珠（αGal3珠）混合。结合在珠上的物质包含Gal3-U1 snRNP单颗粒。（C）将（B）部分获得的Gal3-U1 snRNP复合物与（A）部分获得的U1ΔNE混合，使用32P标记的MINX前体mRNA作为底物进行剪接反应，通过凝胶电泳和放射自显影分析剪接反应的中间产物和终产物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61990/61990fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>抗U1 snRNP</td><td>结合位点</td><td>Hu ENA-RNP #33471</td><td>针对U1 snRNP的人自身免疫血清</td></tr><tr><td>瓶顶式真空滤器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Corning 431153 (0.22 &amp;mu;m; PES 150 ml)</td><td>用于过滤含Tris的溶液</td></tr><tr><td>离心机</td><td>国际设备公司</td><td>IEC Model PR-6</td><td>用于免疫沉淀中沉淀Sepharose珠</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>159220-5G</td><td>用于处理配制所有溶液所用水</td></tr><tr><td>二甲基戊二亚胺酸（DMP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490-5G</td><td>用于将抗体交联至Sepharose珠</td></tr><tr><td>电泳槽</td><td>BioRad Laboratories, Inc</td><td>Mini-Protean II</td><td>用于蛋白质的SDS-PAGE分离</td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411000-100ml</td><td>用于交联反应后的封闭</td></tr><tr><td>凝胶电泳系统</td><td>Hoefer, Inc</td><td>HSI SE 500系列</td><td>用于通过凝胶电泳分离snRNA</td></tr><tr><td>凝胶板干燥仪</td><td>BioRad</td><td>Model 224</td><td>用于干燥凝胶板以进行放射自显影</td></tr><tr><td>Hybond ECL膜</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN3032D (0.2 &amp;mu;m; 30 cm x 3 m)</td><td>用于膜上蛋白质的免疫印迹</td></tr><tr><td>微量透析仪（12 x 100 &amp;mu;l样品容量）</td><td>Pierce</td><td>Microdialyzer System 100</td><td>用于更换核提取物的缓冲液&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微量透析膜（8K截留分子量）</td><td>Pierce</td><td>66310</td><td>用于更换核提取物的缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Spartan Stores</td><td>Spartan Instant Non-fat Dry Milk</td><td></td></tr><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GE 17-0780-01</td><td>用于将抗体偶联至珠</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P2308-5mg</td><td>用于终止剪接反应以分离RNA</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td>用于抑制核糖核酸酶活性</td></tr><tr><td>摇床/旋转器</td><td>Lab Industries, Inc&amp;nbsp;</td><td>Labquake Shaker 400-110</td><td>用于偶联反应和免疫沉淀中混合蛋白质溶液</td></tr><tr><td>Safety-Solve</td><td>Research Products International Corp.</td><td>编号 111177</td><td>用于测定剪接底物中放射性的闪烁计数液</td></tr><tr><td>闪烁计数器</td><td>贝克曼仪器公司</td><td>LS6000SC</td><td>用于测定放射性的闪烁计数器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Savant</td><td>SVC 100H</td><td>用于干燥乙醇沉淀的RNA沉淀</td></tr><tr><td>Transphor电泳转印装置</td><td>Hoefer, Inc</td><td>Hoefer TE系列Transphor</td><td>用于将蛋白质从SDS-PAGE转移至印迹膜</td></tr></tbody></table>

通过珠粒上galectin-3与u1 snrnp复合物对剪接活性的互补作用

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

经典的耗竭-重建实验表明，半乳糖凝集素-3（galectin-3）是核提取物中必需的剪接因子。本文探讨了galectin-3进入剪接通路的机制。将HeLa细胞核提取物在12%–32%甘油梯度中进行沉降，可获得富含内源性约10S颗粒的组分，该颗粒包含galectin-3和U1 snRNP。本文现描述一种耗竭核提取物中U1 snRNP并同时丧失剪接活性的实验方案。在U1耗竭的提取物中，剪接活性可通过固定在琼脂糖珠上的galectin-3–U1 snRNP复合物恢复，该珠子共价偶联了抗galectin-3抗体。结果表明，galectin-3–U1 snRNP–前体mRNA三元复合物是一种功能性E复合物，可生成剪接反应的中间产物和终产物，且galectin-3通过与U1 snRNP的结合进入剪接通路。利用珠子上亲和或免疫筛选的复合物来重建特定剪接因子耗竭提取物中的剪接活性，这一策略可能普遍适用于其他系统。

将不含U1 snRNP的核提取物（来自第2.2.6节的U1ΔNE）与通过抗Gal3抗体免疫沉淀得到的10S区甘油梯度中的Gal3-U1 snRNP复合物（步骤3.2.7）混合进行剪接反应。该反应体系中含有U1 snRNA（图2A，第3道），以及U1特异性蛋白U1-70K（图2B，第3道）。如预期所示，抗Gal3抗体沉淀出了Gal3蛋白（图2B，第3道）。这些组分（U1 snRNA、U1-70K蛋白和Gal3）在前免疫血清（PI）对照沉淀中均未检测到（图2A、图2B，第2道）。与作为阳性对照的未耗竭核提取物相比（图2C，第1道），U1ΔNE未表现出剪接活性（图2C</strong...

本文描述了以下实验步骤：（a）从核提取物中去除U1 snRNP，同时伴随剪接活性的丧失；（b）通过与共价连接抗半乳糖凝集素-3抗体的磁珠结合的半乳糖凝集素-3—U1 snRNP颗粒，在U1耗竭的提取物中重建剪接活性。

通过珠粒上Galectin-3与U1 snRNP复合物对剪接活性的互补作用

经典的耗竭-重建实验表明，半乳糖凝集素-3 是核提取物中必需的剪接因子。其掺入机制……

本报告提供了实验依据，证明半乳糖凝集素-3（galectin-3）与U1 snRNP形成的复合物能够结合前体mRNA底物，构成具有功能的复合体，并产生剪接反应的产物。本方案利用固定在磁珠上的抗galectin-3抗体共价偶联后免疫筛选出galectin-3 U1 snRNP复合物，以此启动剪接反应，并可使反应进行至完成。该方案的关键步骤在于：在沉淀含有galectin-3 U1 snRNP复合物的磁珠后，需仔细去除上清液，并立即用于启动剪接反应。为了从核提取物中去除U1 snRNP，将200微升核提取物与100微升抗U1磁珠孵育。向混合物中加入5微升RNA，在4摄氏度下将微量离心管头尾旋转孵育1小时。通过离心收集沉淀物，并使用汉密尔顿注射器收集未结合的组分。将U1耗竭的核提取物的全部体积与另一份50微升未耗竭的原始核提取物分别置于微型透析器的不同隔室中，在4°C条件下，用60%缓冲液D透析75分钟，并持续搅拌。使用截留分子量为8K的透析膜。透析完成后立即将其分成每份20微升的等分试样，然后在干冰乙醇浴中快速冷冻，并于-80°C保存。使用前，用 0.5 毫升 TX 洗涤缓冲液将抗 gal3 磁珠洗涤两次。每次洗涤时，加入洗涤缓冲液后离心，先用移液器吸除上清液，再用 Hamilton 注射器将液体从磁珠中彻底移除。将核提取物在12%至32%的甘油梯度中进行分级分离。收集并混合靠近10S区域的甘油梯度组分三、四和五。取两份各150微升的第三至第五组分混合液，分别加入50微升抗gal3珠中。同时，取两份样品，每份加入150 µL的第一组分，并分别加入50 µL抗gal3珠中。作为对照，将150 µL 60%缓冲液D加入50 µL抗gal3珠中。轻轻敲击管壁混匀，然后在4°C下以头尾翻转的方式旋转孵育1小时。使用低速离心沉淀样品。用微量移液器移除大部分上清液。使用Hamilton注射器，将针尖小心插入磁珠底部，彻底去除上清液。立即使用磁珠进行剪接反应。按照文稿中所述组装剪接反应体系，并将其加入其中一组磁珠样品中。在总体积为24 µL的条件下组装另一组相同的剪接反应体系，但不加入U1耗竭的核提取物，并将其加入另一组磁珠中。准备一个剪接对照反应，在无任何珠粒的情况下进行，总体积为12微升。该对照反应包含核提取物、60%缓冲液D和放射性标记的剪接底物。轻轻弹击离心管混匀，于30°C旋转（头尾颠倒）孵育90分钟，然后通过轻柔离心沉淀反应混合物。通过向含有珠子的离心管中加入24微升2×SDS上样缓冲液，以及向不含珠子但含有核提取物的对照管中加入12微升2×SDS上样缓冲液，终止反应并洗脱珠子上的蛋白质。涡旋振荡各管。将各管在100摄氏度下加热七分钟。将离心管在室温下以1,000 × g的转速在摆桶转子中离心10至15秒。将上清液转移至新的微量离心管中。加入20毫克/毫升的蛋白酶K以消化并溶解蛋白质。将试管在37摄氏度下孵育40分钟。孵育结束后，轻轻离心试管。用39.5微升TE缓冲液和10微升3摩尔醋酸钠稀释珠子洗脱液。将核提取物对照用 63.5 微升 TE 和 10 微升醋酸钠稀释。按照文本稿件中所述方法提取并分析 RNA。将通过抗 gal3 抗体免疫沉淀甘油梯度 10S 区域获得的、去除了 U1 snRNP 和 gal3 U1 snRNP 复合物的核提取物混合，用于剪接反应。该反应混合物含有U1 snRNA以及U1特异性蛋白U1-70K。正如预期，抗gal3抗体沉淀了gal3。在前免疫对照沉淀中未检测到U1 snRNA、U1-70K蛋白和gal3。与作为阳性对照的非耗竭型核提取物相比，耗竭了U1 snRNP的核提取物未表现出剪接活性。在U1耗竭的核提取物中，剪接活性可通过珠粒结合的gal3 U1 snRNP复合物恢复。剪接反应的两种产物——连接的外显子和切除的内含子套索，以及反应中间体均被检测到。第三至第五组分在恢复U1耗竭核提取物的剪接活性中起关键作用。当这些组分仅被缓冲液替代时，无法观察到任何剪接活性，这表明抗-gal3珠子本身并非导致U1耗竭核提取物中剪接活性恢复的原因。更有说服力的是，当在免疫沉淀过程中用第一组分替代第三至第五组分，再将其加入U1耗竭的核提取物时，未检测到任何剪接反应的中间产物或终产物。在执行该实验方案时，应由一人完成免疫沉淀操作，同时另一人尽可能快速地准备剪接反应，以减少延迟。对能够恢复U1耗竭核提取物剪接活性的半乳糖凝集素-3 U1 SNRP的多肽组成进行蛋白质组学分析将具有重要意义。

complementation-splicing-activity-galectin-3-u1-snrnp-complex-on

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

半乳糖凝集素-3 - U1 snRNP复合物在珠子上的剪接活性的补充

串联剪接事件发生在相距不到12个核苷酸的位点之间。利用绝对定量PCR方法可以实现对这类剪接变异体比例的定量分析。本文描述了如何对STAT3基因的剪接变异体进行定量，该基因存在两个剪接事件，导致丝氨酸-701的包含或缺失以及α/β型C末端的产生。...

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本报告介绍了一种生物工程技术，用于设计和构建新型人工剪接因子（ASFs），以特异性调控哺乳动物细胞中靶基因的剪接过程。该方法可进一步拓展，用于构建多种人工因子，以操控RNA代谢的其他方面。...

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使用生物素-链霉亲和素策略纯化的RNA/蛋白质复合物在变性条件下洗脱至溶液中，其形式不适合进一步的纯化和功能分析。在此，我们描述了该策略的一种改进方法，该方法在RNA中利用光裂解接头并结合温和的紫外洗脱步骤，从而获得天然且完全具有功能的RNA/蛋白质复合物。...

使用与生物素及光裂解连接子相连的RNA一步纯化大分子复合物

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利用E1A微基因工具研究mRNA剪接变化

本方案描述了一种微型基因报告基因检测方法，用于监测5´剪接位点突变对剪接的影响，并开发了用于挽救突变所致剪接抑制的抑制性U1 snRNA。将报告基因和抑制性U1...

基于报告基因的细胞检测法用于监测剪接效率

ACT1-CUP1检测确定芽殖酵母剪接体突变体对底物特异性的敏感性

包含高度密集的微米级组分的巨大囊泡是有效的细胞模型。水包油乳液离心法是一种制备包封材料的巨大囊泡的简单而强大的工具。...

通过油包水乳液离心法制备包封微球的巨型囊泡

了解半乳糖凝集素-3与U1 snRNP复合物在珠子上的剪接活性重组方法。该方案通过免疫选择技术实现U1 snRNP耗竭与功能重建，为研究RNA剪接机制提供重要实验依据。

通过珠粒上Galectin-3与U1 snRNP复合物对剪接活性的互补作用

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