半乳糖凝集素-3 - U1 snRNP复合物在珠子上的剪接活性的补充

本报告为半乳糖凝集素-3 U1 snRNP 复合物与前体 mRNA 底物结合形成功能复合物并导致剪接反应产物的文件提供了实验证据。该方案利用与抗 gal3 抗体共价偶联的珠子上免疫选择的半乳糖凝集素-3 U1 snRNP 来启动剪接反应，该反应可以进展到完成。该方案中的一个关键步骤是在沉淀含有半乳糖凝集素-3 U1 snRNP 复合物的珠子后小心去除液体，并立即用于引发剪接反应。

为了从核提取物中去除 U1 snRNP，将 200 微升核提取物与 100 微升抗 U1 珠子一起孵育。在混合物中加入 5 微升 RNA，并在 4 摄氏度下将微管头对尾旋转 1 小时。通过离心沉淀混合物，并使用 Hamilton 注射器收集未结合的材料。

微量透析器的不同隔室中，用 60% 缓冲液 D 在 4 摄氏度下搅拌 75 分钟，将全体积的去除 U1 的细胞核提取物与单独的 50 微升原始未去除的细胞核提取物等分试样一起透析。使用截留分子量为 8K 的透析膜。透析后，立即将制剂分成 20 微升等分试样，然后在干冰乙醇浴中快速冷冻，并在零下 80 摄氏度下储存。

使用前，用 0.5 ml TX 洗涤缓冲液洗涤抗 gal3 珠子两次。对于每次洗涤，添加洗涤缓冲液并离心。先用微量移液管去除上清液，然后用 Hamilton 注射器去除上清液，以将液体从珠子中取出。

在 12% 至 32% 甘油梯度上分离核提取物。合并并混合靠近 10S 区域的甘油梯度馏分 3、4 和 5。准备两个 150 微升的梯度组分 3 到 5 的等分试样，并将它们放入 50 微升的抗 gal3 珠子中。

同时，制备两个样品，每个样品含有 150 μL 馏分 1，并将它们放入 50 μL 抗 gal3 珠中。作为对照，将 150 微升 60% 缓冲液 D 置于 50 微升抗 gal3 微珠中。轻敲试管轻轻混合，然后在 4 摄氏度下将它们头对尾旋转 1 小时。

通过温和离心沉淀样品。用微量移液器去除大部分上清液。使用 Hamilton 注射器小心地将针尖插入珠子底部，去除上清液。

立即使用珠子进行剪接反应。按照文本手稿中的描述组装剪接反应，并将其添加到一组珠子样品中。组装一组总体积为 24 微升但不含 U1 耗尽的核提取物的相同剪接反应，并将其添加到另一组珠子中。

准备一个对照剪接反应，在没有任何珠子的情况下进行，总体积为 12 微升。该对照反应包含核提取物、60% 缓冲液 D 和放射性剪接底物。轻敲轻轻混合试管，并在 30 摄氏度下头对尾旋转 90 分钟，然后通过轻轻离心使混合物沉淀。

向含有微珠的试管中加入 24 μL 2X SDS 样品缓冲液，向含有核提取物但不含微珠的对照试管中加入 12 μL 2X SDS 样品缓冲液，终止反应并从微珠上洗脱蛋白质。涡旋每根试管。将试管在 100 摄氏度下加热 7 分钟。

试管在水平转头中以 1， 000 倍 G 离心 10 至 15 秒。将上清液转移到新鲜的微管中。每毫升添加 20 毫克蛋白酶 K 以消化和溶解蛋白质。

将试管在 37 摄氏度下孵育 40 分钟。孵育后，轻轻离心试管。用 39.5 μL TE 和 10 μL 三摩尔乙酸钠稀释磁珠冲出物。

用 63.5 μL TE 和 10 μL 乙酸钠稀释细胞核提取物对照。按照文本手稿中的描述提取和分析 RNA。在剪接反应中混合抗 gal3 免疫沉淀的甘油梯度 10S 区去除 U1 snRNP 和 gal3 U1 snRNP 复合物的核提取物。

该反应混合物含有 U1 snRNA 以及 U1 特异性蛋白 U1-70K。正如预期的那样，抗 gal3 沉淀了 gal3。在免疫前对照沉淀中未发现 U1 snRNA 、 U1-70K 蛋白和 gal3 。

与作为阳性对照进行的未耗尽的核提取物相比，去除 U1 snRNP 的核提取物不表现出剪接活性。U1 耗尽的核提取物中的剪接活性可由珠结合的 gal3 U1 snRNP 复合物重构。发现剪接反应的产物都连接了外显子和切除的内含子套索以及中间体。

级分 3 到 5 的组分对于恢复 U1 耗尽的核提取物的剪接至关重要。当这些组分单独被缓冲液替换时，无法观察到剪接活性，表明抗 gal3 珠不负责去除 U1 的核提取物中剪接活性的恢复。更有说服力的是，当在免疫沉淀程序中将馏分 3 到 5 替换为馏分 1，然后添加到 U1 耗尽的核提取物中时，未发现剪接反应的中间体或产物。尝试此方案时，一个人应完成免疫沉淀，而另一个人应尽可能延迟地准备剪接反应。

半乳糖凝集素-3 U1 SNRP 的多肽组成的蛋白质组学分析将引起人们的极大兴趣，该 SNRP 可恢复 U1 耗尽的核提取物的剪接活性。