Name: 封装固体材料的细菌纤维素球体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: 学习利用红茶、蔗糖和微生物培养物制备可重复生产的细菌纤维素球体的方法。该技术可将生物炭、聚合物微球等固体颗粒有效封装于球体内，适用于环境修复与控释系统。

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本工作是阿道夫·马丁内斯（Adolfo Martinez）、凯瑟琳·马伦兰（Catherine Mulholland）、泰勒·萨默维尔（Tyler Somerville）和劳蕾尔·比特曼（Laurel Bitterman）在蒙大拿理工学院研究助理导师计划中开展项目的延续。本研究由美国国家科学基金会（资助号：OIA-1757351）以及美国陆军能力发展司令部陆军研究实验室（合作协定编号：W911NF-15-2-0020）资助。本文所表达的观点、发现、结论或建议均为作者个人观点，不一定反映美国国家科学基金会或陆军研究实验室的立场。我们还要感谢艾米·昆齐（Amy Kuenzi）、李·理查兹（Lee Richards）、凯特琳·艾利（Katelyn Alley）、克里斯·加蒙斯（Chris Gammons）、马克斯·沃尔根特（Max Wohlgenant）和克里斯·博世（Kris Bosch）所做出的贡献。

1. 细菌纤维素启动菌种的制备与维护
<ol>
	<li>获取约 50 g 的细菌纤维素起始培养物，形式为 SCOBY。可通过商业途径购买（例如，从 Cultures for Health 购买）。将 SCOBY 放入一个 1 L 的烧杯中，并用纸巾覆盖。</li>
	<li>将 700 mL 去离子水煮沸，转移至另一个与 SCOBY 分开的容器中，加入 85 g 蔗糖。</li>
	<li>待蔗糖完全溶解后，加入 2 袋红茶（4.87 g）。浸泡茶叶 1 小时，然后用搅拌棒小心取出茶包。</li>
	<li>向茶液中加入 200 mL 蒸馏白醋。让混合物冷却至 25 °C。冷却后，将 700 mL 室温茶液加入含有 SCOBY 的烧杯中。 
	​警告：若在茶液温度过高时加入酸性茶液，可能会损害 SCOBY 中的微生物。</li>
	<li>用纸巾覆盖烧杯，并用橡皮筋固定，然后将烧杯置于保持 25 °C 温度的储存区域。该容器通常被称为储备培养物或“菌种酒店”（hotel）。</li>
	<li>为保持 SCOBY 健康，每月需进行约 2 次维护。
	<ol>
		<li>戴上手套固定 SCOBY 膜，将“菌种酒店”中的液体倒入另一个烧杯中。在盛有液体的容器中，加入足量的酸性茶液，使溶液总体积达到 700 mL。</li>
		<li>在酸性茶液容器中溶解 65 g 蔗糖。在等待蔗糖溶解期间，用去离子水小心冲洗 SCOBY 膜。</li>
		<li>待蔗糖完全溶解后，可将液体加入含有已冲洗 SCOBY 膜的烧杯中。盖上烧杯，并放回培养区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细菌纤维素球的制备
注意：使用沸水时需谨慎操作。确保玻璃器皿能够耐受沸水温度，无缺陷，并且尺寸合适。细菌纤维素（BC）球体生产的示意图见图1。
<ol>
	<li>使用烧水壶将 350 mL 去离子水煮沸。将热水转移至 500 mL 烧杯中，用玻璃棒搅拌溶解 42.5 g 颗粒蔗糖。</li>
	<li>待蔗糖完全溶解后，将 1 袋红茶（2.54 g）浸入含有蔗糖和水的烧杯中，浸泡 1 小时。之后用玻璃棒取出茶包，注意避免弄破茶包，然后将其丢弃至垃圾桶中。</li>
	<li>向烧杯中加入 100 mL 蒸馏白醋，充分搅拌混合物。将 80 mL 酸性茶混合液转移至 250 mL 带挡板锥形瓶中。让茶混合液冷却至室温（20 - 25 °C）。 
	注意：此时可将混合液静置过夜，或直至准备进行下一步操作。</li>
	<li>当液体温度降至室温（20 - 25 °C）后，向带挡板锥形瓶中加入 20 mL 微生物起始培养液。该培养液可从 SCOBY 培养液中获得。用封口膜覆盖瓶口。</li>
	<li>将带挡板锥形瓶置于摇床平台上，设置转速为每分钟 125 转（rpm）。在温度为 20 - 25 °C 的室温环境或培养箱中振荡培养 3 天，以生成细菌纤维素（BC）球体。 
	注意：若瓶内出现不规则形状，或纤维素团块附着在瓶壁上，应将其移除，以防止进一步形成不规则的 BC 团块。使用镊子去除不需要的 BC 团块，包括细丝、环状、管状及其他明显非球形的结构。</li>
	<li>待球体形成后，轻柔地将它们从锥形瓶中倾倒出，并进行分析、处理或用于本文未描述的其他用途。</li>
</ol>
3. 利用细菌纤维素微球包封颗粒或污染物
<ol>
	<li>按照上述步骤 2.1-2.5进行操作。</li>
	<li>振荡3天后，向带挡板的烧瓶中加入约0.01 g精细研磨的颗粒物。合适的固体材料包括生物炭（260 ± 140 µm）、矿山废弃物（350 ± 140 µm）和聚苯乙烯微珠（3 µm）。这些材料的数据在代表性结果部分中列出。有关生物炭、矿山废弃物和微珠的进一步描述，请参见附带的材料表。</li>
	<li>再次用封口膜覆盖烧瓶，并将其放回摇床，以相同转速和室温（20 - 25 °C）继续振荡3天。之后取出BC包埋的颗粒用于分析、处理或其他用途。</li>
</ol>
<img alt="发酵过程示意图；从菌种培养到在锥形瓶中进行固液分离，历时3天。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62286/62286fig01.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Figure 1"> 
图1．细菌纤维素球体制备及固体颗粒的包封。第1步是将细菌菌种培养物与红茶、糖和醋酸培养基混合加入带挡板的锥形瓶中。菌种培养物中的圆片代表细菌纤维素（BC）膜。随后，将带挡板的锥形瓶置于摇床中振荡培养3天。中间步骤显示在细菌纤维素球体形成后向瓶中加入固体颗粒，并继续振荡培养3天。最后一步中，细菌纤维素球体进一步增大，并将固体颗粒包封在内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62286/62286fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案概述了易于操作且成本效益高的细菌纤维素（BC）球体制备与包封方法。通过对原始方案进行多种优化，已确定出合适的工艺流程。必须遵循关键步骤以确保获得具有活性的球体。参与BC形成的全部成分均对球体的健康状态和耐久性起着关键作用：蔗糖为微生物提供营养，茶叶提供氮源，而醋则降低pH值至适宜范围，从而防止不需要的污染物滋生28。本方法中的另一个重要变量是温度。在加入微生物起始培养物之前，必须将茶液冷却至室温（约25 °C）。若微生物暴露于高温下，BC球体的生长可能受到抑制。培养瓶所处环境的室温也会影响球体的生长3, 28, 29。当振荡培养温度超过30 °C时，会形成不规则形状的BC结构（图4A）。在包封过程中，一个关键步骤是在添加固体颗粒之前，先让BC球体充分形成。这是因为观察发现，若烧瓶中存在异物，会抑制BC的生长。
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细菌纤维素（BC）因其机械强度高、纯度高、结晶度高、保水能力强以及复杂的纤维结构，被认为在工业应用方面具有巨大潜力1,2,3,4这些特性使BC成为多种应用中的理想生物材料，包括生物医学、食品加工和环境修复领域1BC薄膜的形成可使用单一微生物培养物或混合培养物（如用于康普茶的培养物）来完成。5，一种发酵茶饮料。制作康普茶依赖于一种 &#34;细菌与酵母的共生培养&#34;，通常称为SCOBY。利用这种共生微生物培养物，可采用类似技术制备细菌纤维素（BC）微球。该生物材料可用于帮助分离环境污染物，并固定生物炭等农业改良剂，以实现更高效的农作物生产。
先前的文献已讨论了在振荡条件下产生的细菌纤维素（BC）与在静止培养条件下产生的细菌纤维素之间的特性差异。静止培养会在液-气界面形成一层膜，而振荡培养则产生悬浮于液体中的不同形态的细菌纤维素颗粒、纤维束和球状结构6。许多研究指出，在动态条件下进行细菌纤维素的商业化生产更具可行性6,7，这为本论文所采用方法的应用提供了依据。此外，已有多种关于细菌纤维素球状结构及其特性的研究。Toyosaki 等人6比较了在振荡条件下使用带挡板和光滑壁的锥形瓶进行细菌纤维素生产的效果。Hu 和 Catchmark 的一项研究4确定了细菌纤维素球形成的条件，这些条件被用作当前细菌纤维素球制备过程的指导参数，其结果表明，球体尺寸在培养60小时后不再继续增大。Mohammad 等人1对细菌纤维素生产的综述指出，振荡培养可确保氧气的均匀供应与分布，这对于细菌纤维素的成功生长至关重要。Holland 等人8利用X射线衍射和傅里叶变换红外光谱技术研究了细菌纤维素的结晶度和化学结构。可以推测，细菌纤维素微胶囊将表现出类似的特性，未来的研究将进一步探讨其结构特性。此外，已有研究探索了利用细菌纤维素制备性能更优的生物复合材料的有益效果。以环氧树脂为基体，研究人员已证明添加细菌纤维素可改善材料的疲劳寿命、断裂韧性以及拉伸和弯曲强度9,10。如过去和当前的研究所示，目前许多人对推动细菌纤维素的商业化应用表现出浓厚兴趣。
许多研究人员已对细菌纤维素在控释系统中的应用进行了研究，本文所述方法制备的微胶囊可作为控释系统使用。这些研究大多集中于生物医学领域的控释应用，同时也探索了其在控释肥料（CRF）施用中的潜力。基于细菌纤维素（BC）成功实现阿莫西林11、利多卡因12和布洛芬13的控释，BC可能对其他物质（如颗粒状肥料）也表现出类似的递送特性。Shaviv和Mikkelsen14对控释肥料（CRF）的综述指出，与传统施肥方式相比，CRF效率更高、节省劳动力，且通常对环境造成的破坏更小。细菌纤维素可能是一种适用于CRF的理想包封材料。肥料可通过BC膜渗出，或在BC生物降解过程中释放15,16。BC具有高吸水溶胀能力，也可作为有益的土壤改良剂17,18,19，因为通过施用BC微球，肥料养分和水分均可逐步释放至土壤中。具备这些特性后，由BC微球包封形成的控释肥料可能优于其他肥料包膜材料——后者在生产和废弃阶段可能带来负面影响。将BC应用于肥料包膜有望进一步提升CRF技术。通过降低肥料释放速率，作物将有充足时间吸收养分，避免过量养分流入水体，从而减少水体富营养化及缺氧区域的形成。已有研究采用聚合物包膜制备并试点应用了类似的缓释肥料20。
与以往研究中所述的方案不同，本方案侧重于制备均匀且结构完整的球形颗粒，而非追求高纤维素产率。此外，尽管已有研究利用纤维素薄膜实现对其他固体物质的包封，但尚未见有关球形结构包封的报道21。通过拓展细菌纤维素球形颗粒的研究，可进一步推动细菌纤维素的商业化生产，这得益于细菌纤维素环境友好的特性。本细菌纤维素球体制备方法采用价格低廉且易于获取的食品级原料。在初始组装完成后，无需干预，细菌纤维素球体即可在2天内开始形成。该策略制备细菌纤维素球体所需空间小，并产生一种可食用副产物——发酵茶“康普茶”（kombucha）。其他研究中提到的包封技术包括通过相转化技术形成的涂层22,23、基质形成法24、喷雾干燥法25以及合成过程中的直接包封法26。本文所述的直接包封方法适用于希望采用简便、低成本且原料易得工艺的研究者。
通过本项研究，成功建立了一种用于细菌纤维素（BC）微球制备与包封的实验方案。BC微球可在其独立结构中包封生物炭、矿山尾矿和聚苯乙烯微珠等固体颗粒。尽管目前在工业中尚未广泛应用，但BC是一种实用、可持续制备且天然存在的材料，具有未来应用的潜力。

<table><tbody><tr><td>100 mL 量筒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 mL 烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL 量筒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL 带挡板锥形瓶</td><td>Chemglass</td><td>CLS-2040-02</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物炭</td><td></td><td></td><td>花旗松在氩气环境下热处理，以每分钟 15 &amp;deg;C 的速率升温至 800 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>红茶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸馏白醋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>橡皮筋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微生物起始培养物</td><td>Cultures for Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>矿山废弃物</td><td></td><td></td><td>采自蒙大拿州巴特：46.001978,-112.582465。矿山废弃物包含源自以往铜矿开采的土壤和金属。通过X射线衍射分析，测得其中含量最高的五种元素为 Mn、Si、Ca、Al 和 Fe。</td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td></td><td></td><td>使用多个品牌</td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微珠</td><td>Polybead</td><td>17138</td><td>直径 3 微米</td></tr><tr><td>搅拌棒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>烧水壶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGA</td><td>TA Instruments</td><td>TA Q500</td><td>以每分钟 400 &amp;deg;C 的速率升温至 800 &amp;deg;C，氮气流速 100 mL/min</td></tr><tr><td>温度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XRF 分析仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131166</td><td></td></tr></tbody></table>

包封固体材料的细菌纤维素微球

Bacterial Cellulose Spheres that Encapsulate Solid Materials

自细菌纤维素（BC）作为一种新型材料普及以来，BC微球的研究日益增多。本实验方案介绍了一种经济且简便的BC微球制备方法。除了制备这些微球外，还开发了一种用于固体颗粒包封的方法。制备BC微球时，将水、红茶、糖、醋和细菌培养物加入带挡板的锥形瓶中，并对内容物进行振荡培养。在确定了适宜的BC微球形成培养条件后，采用生物炭、聚合物微珠和矿山废弃物测试了微球对固体颗粒的包封能力。利用ImageJ软件和热重分析（TGA）对所制得的微球进行了表征。结果表明，直径为7.5 mm的微球可在7天内形成。添加不同颗粒可增加BC微胶囊的平均尺寸范围。微球包封量可达其干重的10–20%。该方法展示了利用易得材料实现低成本微球制备与包封的可行性。未来，BC微球可望用于污染物去除辅助剂、控释肥料包衣或土壤改良剂。

在培养的前48小时内，细菌纤维素球体的生长速度最快（图2）。图2还显示，球体往往达到一个平均最大尺寸后便保持稳定。在本实验中，球体的平均直径达到7.5 ± 0.2 mm。尽管细菌纤维素球体在整个10天的生长期中从未完全退化，但从第8天左右开始，它们逐渐从球体主干部分伸出细长的须状结构。这一点在图2E中可以观察到，尤其是左上角较大的球体最为明显。
采用本文所述的包封方法，可得到平均57 ± 4个细菌纤维素球体，其直径范围为3至12 mm（图3）。从图3中还可以看出，向细菌纤维素球体中添加固体物质对球体的大小或数量并无一致的影响。轨道摇床转速、环境温度以及不规则颗粒的形成似乎是影响球形颗粒形态、大小和数量的主要因素。图4显示，过高的...

本方案介绍了一种简单且低成本的细菌纤维素（BC）微球制备方法。该生物材料可作为固体物质的包封介质，包括生物炭、聚合物微球和矿山废弃物。

细菌纤维素（BC）微球自BC作为一种新型材料被广泛研究以来，受到越来越多的关注。本实验方案介绍了一种……

本方案具有重要意义，因为它拓展了当前制备可生物降解、天然存在的生物材料的方法。我们的方法侧重于可重复地制备细菌纤维素微球。该技术的主要优势在于所需材料易于获取：糖、水、茶、醋、细菌培养启动剂、带挡板的锥形瓶和轨道摇床。初次进行该技术操作的研究人员可能无法准确识别球体，或难以去除不规则的细菌纤维素团块。我们在视频中已演示了这些步骤，但如果首次尝试未能成功，也不必气馁。该方法的可视化演示通常有助于研究人员直观了解理想与非理想的细菌纤维素团块的大小、数量和形态。首先，使用烧水壶将350毫升去离子水煮沸。然后将热水转移至一个500毫升的烧杯中。操作时需佩戴隔热手套，并确保玻璃棒能够耐受沸水温度。使用玻璃棒将42.5克颗粒蔗糖完全溶解于热水中。将装有2.54克红茶的茶包放入含有蔗糖溶液的烧瓶中，浸泡1小时。用玻璃棒取出茶包，注意不要将其弄破，并将其丢弃至垃圾桶中。向烧杯中加入 100 毫升蒸馏白醋，并充分搅拌混合物。将 80 毫升配制好的酸性茶混合液转移至一个 250 毫升带挡板的锥形瓶中，静置冷却至 20 至 25 摄氏度。当液体达到室温时，向该锥形瓶中加入 20 毫升微生物菌种液体，并用封口膜覆盖瓶口。将带挡板的锥形瓶置于摇床平台上，于20至25摄氏度下以每分钟125转的速度振荡三天，以生成细菌纤维素（BC）球体。用镊子去除形状不规则的非球形BC团块，防止进一步形成不规则的BC团块。待BC球体形成后，轻轻将它们从锥形瓶中倒出，以供后续使用。在本实验方案中，BC 球体在培养的前 48 小时内表现出较高的生长速率，达到最大尺寸后大小保持稳定。BC 球体在培养约第八天时开始形成卷须状结构。测试了将生物炭、聚合物微珠和矿山废弃物等固体污染物包封后球体的尺寸分布情况。观察到向BC球体中添加固体对球体的大小或频率并无一致影响。轨道摇床速度、环境温度以及不规则颗粒的形成似乎是影响球形颗粒形态、大小和频率的主要因素。注意到过高的室温或不恰当地去除不规则团块会使得完整的BC球体形态转变为星状颗粒或纤维状聚集体。为了确定BC球中包封固体的比例，进行了热重分析。热分析与显微观察结果共同证实了固体颗粒在BC球内的有效包封。纯BC的微分TGA曲线与含聚苯乙烯微球的BC曲线在数值上几乎完全相同。然而，观察到一个额外的峰，对应于聚苯乙烯微球的热分解。最重要的是，在茶冷却至室温后，再加入微生物起始培养物。此外，我们必须确保培养物中含有活性且健康的微生物。该方法可用于环境修复中的污染物去除。这些微球还可用于目标物质的可控释放。该技术使我们能够将环境材料包封于细菌纤维素微球内。这可能对可生物降解的控释或修复平台具有应用价值。

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科研

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工程

封装固体材料的细菌纤维素球体

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由产纤维素细菌制备细菌纳米纤维素膜

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使用同轴喷嘴进行多能干细胞的海藻酸盐封装

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使用简易搅拌反应器将哺乳动物细胞包封于海藻酸盐微珠中

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通过油包水乳液离心法制备包封微球的巨型囊泡

本研究介绍了一种利用细菌制备钨酸钠和钼酸钠微胶囊及其相应纳米颗粒的实验方案。...

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肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

学习利用红茶、蔗糖和微生物培养物制备可重复生产的细菌纤维素球体的方法。该技术可将生物炭、聚合物微球等固体颗粒有效封装于球体内，适用于环境修复与控释系统。

包封固体材料的细菌纤维素微球

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