使用简易搅拌反应器将哺乳动物细胞包封于海藻酸盐微珠中

本视频介绍了一种使用简单搅拌容器将哺乳动物细胞（如胰岛细胞）包埋于海藻酸盐微珠中的固定化方法。该方法的原理是通过水相与油相乳化形成海藻酸盐液滴，随后实现海藻酸盐液滴的内部凝胶化。该操作的第一步是制备一种乳剂，其中含有海藻酸盐细胞和碳酸钙的水相被分散在矿物油有机相中。

第二步是通过加入油溶性酸（如乙酸）使乳液酸化，该酸会快速分配至水相中。pH 值的下降导致碳酸钙溶解，并使海藻酸盐液滴在内部发生胶凝形成微球。最后一步是通过加入水溶液从乳液中回收微球，经离心分离各相，随后对微球进行洗涤和过滤。

固定化的细胞随后可在体外培养或用于移植。我们所描述的方法为使用基于喷嘴的细胞包封装置制备海藻酸盐微球提供了一种替代方案。该方法源自Poncelet等人于1992年首次报道的用于酶和微生物细胞固定的方案。

我们最感兴趣的應用是利用海藻酸鹽包封技術來實現移植細胞的免疫隔離，從而減少甚至消除對抗排斥藥物的需求。與基於噴嘴的裝置相比，乳化法的主要優勢在於其可擴展性和穩定性。由於液滴幾乎是同時生成的，因此可以在極短時間內從極稀或極濃的海藻酸鹽溶液中生產出大量微珠。

此外，该过程具有很高的稳健性，不易失败，即使存在可能堵塞喷嘴的颗粒也能正常进行；最后，该工艺设备相当简单，因此大多数实验室均可获得，且相对成本非常低。关键的加工步骤包括乳化以形成海藻酸盐液滴，以及酸化以释放内部的钙源。液滴尺寸主要受搅拌桨设计、搅拌速率和搅拌时间的影响。

微珠的机械性能和细胞存活率受到酸化程度和持续时间的影响。在本视频中，我们演示了一种用于将细胞包埋于5%海藻酸盐微珠中以进行移植的方法。这些参数可能需要针对其他潜在应用进行优化。

为了制备含有LVM和MVG海藻酸盐各半混合物的5%海藻酸盐微珠，称取583毫克LVM和583毫克MVG海藻酸粉末。将20毫升处理缓冲液置于磁力搅拌器上。在移植应用中，我们使用含有170毫摩尔氯化钠、pH为7.4的10毫摩尔HEPES缓冲液。

逐步将海藻酸粉末加入溶液中。将溶液在低速下持续搅拌过夜。如有必要，将烧瓶固定在搅拌台上。

次日，如果海藻酸未完全溶解，将容器固定在旋转混合器上，在37摄氏度下继续混合过夜。待海藻酸完全溶解后，将溶液在高压灭菌器中灭菌30分钟。打开高压灭菌器前，需使温度降至50摄氏度以下。

通过将1克碳酸钙加入20毫升工艺缓冲液中制备碳酸钙悬浮液。对碳酸钙悬浮液及用于乳化过程的搅拌容器进行高压灭菌。使用前，从容器中彻底清除冷凝水残留。

在乳化过程开始前，将44 µL冰醋酸溶解于置于50 mL锥形管中的11 mL矿物油中。常见的错误是冰醋酸未完全溶解，应避免移取小于10 µL的液体，并通过反复涡旋确保酸完全溶解。在进行细胞包封前，让所有溶液均达到室温。

在旋转烧瓶中加入10毫升矿物油，并以250 RPM的速度开始搅拌。若使用贴壁细胞（如beta-tc3细胞），需用胰蛋白酶消化细胞。加入完全培养基以终止反应，并取样进行细胞计数。

通过手动或自动细胞计数仪确定细胞浓度。将细胞在 300 g 条件下离心 7 分钟，然后将细胞沉淀重悬于完全培养基中。重复离心步骤，随后将细胞重悬于适当体积的完全培养基中，使其浓度达到磁珠中所需最终浓度的 10.5 倍。

将9.9毫升海藻酸钠溶液转移至平底管中，然后加入1.1毫升细胞储备液和550微升碳酸钙悬浮液。通过轻柔涡旋混合海藻酸钠、碳酸钙和细胞悬浮液。立即用注射器将10.5毫升该混合物转移至搅拌中的油相中。

提高搅拌速率，然后启动计时器。为确定搅拌速率，应首先建立珠粒大小与搅拌速率之间的标准曲线。12分钟后，加入10毫升油和乙酸溶液，以酸化乳液，使钙从碳酸盐中释放，并形成凝胶珠。

此内部凝胶步骤需静置八分钟。注意含有酚红pH指示剂的乳化液滴发生颜色变化。将搅拌速率降低至400 RPM，加入40毫升工艺缓冲液与10%培养基的混合液以中和酸，从而引发相转变。

一分钟后停止振荡，将混合物转移至锥形管中。用额外的20毫升培养基冲洗旋转瓶，并将冲洗液加入锥形管中。在吸除油相之前，尽可能吸除大部分水相溶液。

将离心管在630 g条件下离心3分钟，以加速磁珠沉降和相分离。使用巴斯德吸管抽吸去除油层和过量工艺缓冲液。每次洗涤之间以630 g离心，用培养基至少洗涤磁珠一次。

使用40微米尼龙细胞滤网过滤珠子悬浮液，并从滤网下方抽吸除去多余的液体。用刮勺将珠子转移至已知体积的培养基中。测量珠子体积，并补充培养基至所需珠子浓度。

典型的浓度为每5毫升总体积使用1毫升珠子。从此步骤开始，始终使用宽口移液管操作珠子，以避免损坏珠子。包封的细胞现在可转移至T形培养瓶中，用于体外培养或移植。

乳化过程结束后，应获得含有固定化细胞的海藻酸盐微球。过程完成后，应常规评估微球的粒径分布和细胞存活率。为确定微球粒径分布，可用甲苯胺蓝对微球进行染色，随后进行图像分析。

此过程将产生较宽的微珠粒径分布。为评估细胞存活率，可将微珠与活/死细胞染料（如钙黄绿素-AM 和碘化丙啶同型二聚体）共同孵育。采用本视频所述方法，测得 beta-tc3 细胞存活率为 76%。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用简单的搅拌系统将哺乳动物细胞固定在海藻酸盐微珠中。本视频展示的基本实验方案适用于使用多种类型的海藻酸盐和钙化条件来固定不同种类的细胞。我们建议每次使用新的海藻酸盐或油批次时，均应建立一条标准曲线，以反映微珠平均粒径与搅拌速率之间的关系。

我们所描述的乳化过程是对基于喷嘴的细胞封装技术的一种有前景的替代方案。这是一种稳定且简便的方法，可用于将哺乳动物细胞固定在海藻酸盐微球中。随着我们以及全球其他研究人员开发基于喷嘴的细胞治疗技术，此类规模化方法将有望服务于成千上万的糖尿病患者。

我们已发表了将β细胞系移植到5%海藻酸盐微珠中的 promising 结果，并继续探索这种改进的抗排斥屏障在体内的表现。