使用简单搅拌容器在藻酸盐珠中的哺乳动物细胞包封

本视频介绍了一种使用简单搅拌容器将哺乳动物细胞（例如胰岛）固定在藻酸盐珠中的方法。该方法的原理是通过水和油乳化生成藻酸盐液滴，然后使藻酸盐液滴内部凝胶化。该程序的第一步包括生成乳液，其中含有藻酸盐细胞和碳酸钙的水相分散在矿物油有机相中。

第二步是通过添加油溶性酸（如乙酸）来酸化乳液，该酸会迅速分配到水相中。pH 值下降导致碳酸钙溶解，海藻酸盐液滴内部凝胶化成珠子。最后一步包括通过添加水溶液从乳液中回收珠子，通过离心分离相，然后洗涤和过滤珠子。

然后可以将固定的细胞在体外培养或用于移植。我们描述的方法是使用基于喷嘴的细胞封装器生成藻酸盐珠的替代方法。这源自 Poncelet 等人于 1992 年首次报道的酶和微生物细胞固定方法。

我们最感兴趣的应用是藻酸盐包封作为免疫分离移植细胞的一种手段，从而减少甚至消除对抗排斥药物的需求。与基于喷嘴的设备相比，基于乳液的工艺的主要优势在于其可扩展性和稳健性。由于液滴几乎同时产生，因此可以在非常短的时间内从非常稀或非常浓的藻酸盐溶液中产生非常大量的珠子。

此外，该工艺非常稳健，不易出现故障，即使存在可能阻塞喷嘴的颗粒，最后，工艺设备相当简单，因此对于大多数实验室来说，它很容易获得，成本非常低。关键的加工步骤是乳化形成藻酸盐液滴，酸化以释放内部钙源。液滴大小主要受叶轮设计、搅拌速率和搅拌持续时间的影响。

磁珠的机械性能和细胞存活率受酸化程度和持续时间的影响。在本视频中，我们演示了一种用于将细胞封装在 5% 藻酸盐珠中用于移植的方法。这些参数可能需要针对其他潜在应用进行优化。

要生成含有 LVM 和 MVG 海藻酸盐混合物的 5% 海藻酸盐珠，请称取 583 毫克 LVM 和 583 毫克 MVG 海藻酸粉末。将 20 mL 过程缓冲液放在磁力搅拌板上。对于移植应用，我们使用含有 170 毫摩尔氯化钠（pH 值为 7.4）的 10 毫摩尔 HEPES 缓冲液。

逐渐将海藻酸粉加入溶液中。让溶液以低速搅拌过夜。如有必要，将培养瓶固定在搅拌板上。

第二天，如果藻酸盐未完全溶解，请将罐子固定在旋转混合器上，并在 37 摄氏度下继续混合过夜。藻酸盐完全溶解后，通过高压灭菌 30 分钟对溶液进行消毒。在打开高压灭菌器之前，让温度降至 50 摄氏度以下。

通过将 1 克碳酸钙添加到 20 mL工艺缓冲液中来制备碳酸钙悬浮液。高压釜碳酸钙悬浮液和用于乳化过程的搅拌容器。使用前，请清除容器中的任何冷凝水痕迹。

在乳化过程之前，将 44 微升冰醋酸溶解在 11 毫升矿物油中，置于 50 毫升锥形管中。一个常见的错误是乙酸溶解不完全，避免移液量小于 10 μL，并通过反复涡旋确保酸完全溶解。在进行细胞封装之前，让所有溶液达到室温。

将 10 毫升矿物油放入旋转瓶中，以 250 RPM 的速度开始搅拌。如果使用贴壁细胞（如 β-tc3 细胞），则对细胞进行胰蛋白酶消化。通过添加完全培养基结束反应，并取样品进行细胞计数。

手动或使用自动细胞计数仪测定细胞浓度。将细胞以 300 g 离心 7 分钟，然后将细胞托盘重悬于完全培养基中。重复离心步骤，然后将细胞重悬于适当体积的完全培养基中，以获得珠子中所需最终浓度的 10 倍和 1/2 倍。

将 9.9 毫升海藻酸盐溶液转移到平底管中，然后加入 1.1 毫升细胞原液和 550 微升碳酸钙悬浮液。通过轻微涡旋混合藻酸盐、碳酸钙和细胞悬液。立即使用注射器将 10.5 毫升这种混合物转移到搅拌油中。

增加搅拌速率，然后启动计时器。为了确定搅拌速率，应首先生成将微珠大小与搅拌速率相关联的标准曲线。12 分钟后，加入 10 毫升油和乙酸溶液以酸化乳剂，从碳酸盐中释放钙，并获得凝胶珠。

让这个内部凝胶化步骤停留 8 分钟。注意含有酚红 pH 指示剂的乳化液滴的颜色变化。将搅拌速率降低到 400 RPM，加入 40 毫升与 10% 培养基混合的工艺缓冲液来中和酸，这会导致相反转。

一分钟后停止搅拌，将混合物转移到锥形管中。再加入 20 mL 培养基冲洗离心瓶，然后加入试管中。在吸出油相之前，尽可能多地吸出水溶液。

将试管以 630 g 离心 3 分钟，以加速磁珠沉降和相分离。用巴斯德移液管吸液去除油和多余的工艺缓冲液。在两次洗涤之间使用 630 g 离心用培养基洗涤珠子至少一次。

过滤 40 微米尼龙细胞过滤器上的微珠悬浮液，并从下方吸出过滤器中多余的液体。使用刮刀将珠子转移到已知体积的培养基中。测量微珠体积并加注培养基以获得所需的微珠浓度。

典型浓度为每 5 毫升总体积 1 毫升珠子。从这时起，请始终使用大口径移液器处理珠子，以避免损坏珠子。封装的细胞现在可以转移到 T 瓶中，用于体外培养或移植。

在乳液过程结束时，应获得含有固定细胞的藻酸盐珠。该过程后，应定期评估磁珠大小分布和细胞存活率。为了确定珠子大小分布，可以用甲苯胺蓝对珠子进行染色，然后进行图像分析。

预计该工艺会带来较宽的磁珠尺寸分布。为了评估细胞存活率，可以将微珠与活死染料（如钙黄绿素-AM 和乙锭同型二聚体）一起孵育。使用本视频中描述的过程，测量了 76% 的 β-TC3 细胞存活率。

观看此视频后，您应该对如何使用简单的搅拌系统将哺乳动物细胞固定在藻酸盐珠中有了很好的了解。本视频中所示的基本方案应适用于使用多种藻酸盐类型和钙化物固定各种细胞类型。我们建议生成一条标准曲线，将每批新海藻酸盐或油的平均珠粒大小与搅拌速率相关联。

我们描述的乳化过程是基于喷嘴的细胞封装器的一种很有前途的替代方案。这是一种将哺乳动物细胞固定在藻酸盐珠中的可靠而简单的方法。随着我们和世界各地的其他人开发喷嘴细胞疗法，成千上万的糖尿病患者将需要如此大规模的方法。

我们已经发表了在 5% 藻酸盐珠中移植 β 细胞系的有希望的结果，并继续探索这种改进的移植排斥屏障的体内性能。