Name: 使用简单搅拌容器在藻酸盐珠中的哺乳动物细胞包封 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学习使用简单搅拌容器通过乳液法将哺乳动物细胞包封在藻酸盐珠中的方法。该技术可高效规模化生产，适用于细胞治疗和组织工程应用。

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我们感谢 Jill Osborne 在乳化工艺方面的奠基性工作，以及 Lauren Wilkinson 提供的技术支持。我们感谢 Igor Laçik 博士、Timothy J. Kieffer 博士和 James D. Johnson 博士的宝贵意见与合作。我们感谢 Diabète Québec、JDRF、ThéCell、魁北克功能材料中心（CQMF）、加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）、人类胰岛移植与β细胞再生中心、加拿大干细胞网络、Michael Smith 健康研究基金会、魁北克自然科学与技术研究基金会以及 COST 865 提供的经费支持。

1. 准备海藻酸钠溶液、CaCO3 悬液和酸化油
<ol>
	<li>配制工艺缓冲液和培养基。
	<ol>
		<li>使用 10 mM HEPES 和 170 mM NaCl 配制常规工艺缓冲液，用于制备高浓度海藻酸盐微球，调节 pH 至 7.4。</li>
		<li>使用含 10% 胎牛血清（FBS）、6 mM 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）配制常规培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制海藻酸盐储备液，其浓度为微球中目标终浓度的 1.17 倍。
	<ol>
		<li>首先称取适量海藻酸盐粉末。例如，若目标终浓度为 5% 海藻酸盐（LVM 与 MVG 比例为 50:50），则将 0.583 g LVM 海藻酸盐粉末与 0.583 g MVG 海藻酸盐粉末混合，共称取 1.17 g 海藻酸钠。</li>
		<li>将 20 mL 工艺缓冲液加入置于磁力搅拌器上的可高压灭菌玻璃瓶中，以约 200 rpm 的速度搅拌，并逐步将海藻酸钠粉末加入溶液中。</li>
		<li>低速持续搅拌过夜。如有必要，将瓶子固定在搅拌器上。</li>
		<li>若溶液未完全溶解，将瓶子固定于旋转混合器上，在 37 °C 继续混合 24 小时。</li>
		<li>将海藻酸盐溶液置于装液量不超过容器一半的容器中，高压灭菌 30 分钟以灭菌；取出前需等待温度降至 60 °C 以下。</li>
		<li>如有必要，在高压灭菌后、溶液尚未冷却至室温且黏度仍足够低时，立即过滤以去除颗粒物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制碳酸钙悬浮液，其浓度为内部胶凝所需终浓度的 21 倍。
	<ol>
		<li>称取 CaCO3 粉末。例如，将 1 g CaCO3 加入 20 mL 工艺缓冲液中，以获得终浓度为 24 mM 的凝胶剂 CaCO3。</li>
		<li>将 CaCO3 悬浮液高压灭菌 30 分钟。 
		注意：由于碳酸氢盐–CO2 平衡的存在，CaCO3 浓度会随时间变化。同一份 CaCO3 储备悬浮液使用次数不应超过 10 次包封操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对用于乳化过程的搅拌容器进行高压灭菌。使用前，清除旋转烧瓶中残留的冷凝水。</li>
	<li>在乳化过程开始前立即配制酸化油。在 50 mL 锥形管中，每 11 mL 矿物油加入 44 µL 冰醋酸。 
	注意：常见错误是冰醋酸未完全溶解。应避免移取微量冰醋酸，并通过反复涡旋确保其在油相中完全溶解。 
	警告：冰醋酸为有毒且易挥发的酸。应在通风橱中操作，且在乳化步骤前始终保持冰醋酸/油溶液处于密闭容器中。有关该试剂的更多信息，请参阅其材料安全数据表（MSDS）。</li>
	<li>在进行细胞包封前，确保所有溶液均达到室温。</li>
</ol>
2. 通过乳化和内部凝胶化生成海藻酸盐微珠
<ol>
	<li>在旋转烧瓶中加入10 mL轻质矿物油，并以低转速开始搅拌（例如 250 rpm（本视频中使用的旋转瓶所用转速）。</li>
	<li>若用于该过程的细胞来自贴壁培养物，需使用胰蛋白酶处理以使细胞悬浮。通过添加含胎牛血清（FBS）的培养基或胰蛋白酶抑制剂终止反应，并收集样品进行细胞计数。
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪，按照先前所述方法，通过台盼蓝染色测定细胞浓度和活力32.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以300 × g离心细胞7分钟，并用细胞固定所需的培养基洗涤一次。确保该培养基中含有如FBS或牛血清白蛋白（BSA）等乳化剂。例如，可使用含10% FBS的DMEM。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于相同培养基中，使其浓度为磁珠中目标终浓度的10.5倍。</li>
	<li>将1.1 mL的10.5倍浓缩细胞悬液加入9.9 mL海藻酸钠溶液中。然后加入550 µL CaCO₃3 悬浮并用无菌刮勺搅拌混合，以确保碳酸钙均匀分布3.</li>
	<li>立即转移10.5 mL的海藻酸钠、细胞和CaCO₃混合物3 使用注射器将混合物注入搅拌中的油相。 
	注意：对于高黏性溶液，应极缓慢地吸取和排出混合物，以避免产生气泡。在某些情况下，向烧瓶中加入混合物时宜停止搅拌，以防止海藻酸盐缠绕在搅拌桨轴上。</li>
	<li>加入海藻酸钠后立即进行细胞和CaCO₃的处理3 将混合物加入油中，提高搅拌速率。 
	注意：对于此处使用的5% LVM:MVG海藻酸盐，采用1025 rpm的旋转速度，可生成直径约900 µm、适合于 体外 培养35较高的转速和较低的海藻酸钠浓度将导致平均珠粒直径减小，这与先前发表的研究结果一致。25,32搅拌桨和容器几何形状的微小变化，以及海藻酸盐性质的差异，均可显著影响微珠的平均直径。每次改变容器构型或海藻酸盐批次时，均应建立一条标准曲线，以反映微珠表面积矩平均直径与转速之间的关系。32.</li>
	<li>启动计时器，将海藻酸盐乳化12分钟。</li>
	<li>加入10 mL油和乙酸溶液以酸化乳液，溶解CaCO₃3 从而将海藻酸盐物理交联形成凝胶珠。此酸化步骤需静置8分钟。</li>
</ol>
3. 磁珠回收
<ol>
	<li>将振荡速率降低至400 rpm。加入40 mL工艺缓冲液与10%培养基的混合液，以提高pH值并引发相转变。</li>
	<li>1 分钟后停止搅拌，将混合物转移至 50 mL 离心管中。用额外的 20 mL 培养基冲洗旋转烧瓶，并将冲洗液加入离心管中。在吸除油相之前，先尽可能吸尽旋转烧瓶中的水相，以尽量减少微珠与油相的接触。 
	注意：使用宽口移液管（例如 此步骤及后续操作中，请使用25 mL移液管以避免损伤磁珠。对于较小体积，也可使用剪切过的移液枪头操作磁珠悬液。制备此类枪头时，需佩戴护目镜，用剪刀剪去移液枪头末端。</li>
	<li>将离心管在630 × g下离心3分钟，以加速磁珠沉降和相分离。</li>
	<li>用巴斯德吸管抽吸去除油相和过量的水溶液。</li>
	<li>用培养基至少洗涤磁珠一次。将磁珠悬液通过40 µm尼龙细胞滤网过滤，并从滤网下方抽吸去除与磁珠相关的过量液体。使用无菌刮铲将磁珠转移至已知体积的培养基中。 
	注意：此步骤可根据目标微珠的最小直径选用较小或较大孔径的滤膜。然而，建议采用重力过滤，而非通过亚微米孔径滤膜的压力驱动过滤，以避免损伤微珠。</li>
	<li>通过排液法测量珠子体积（加入珠子后的体积减去加入前的体积），并补充培养基至目标珠子体积与总体积之比，通常为1:5，即1 mL珠子加入4 mL培养基中。此后操作均应使用宽口移液枪，以避免损伤珠子。</li>
	<li>将包封的细胞转移至T形瓶中 体外 培养或移植实验。</li>
</ol>
4. 质量控制与应用
注意：为了确保包封细胞和微珠的质量，应量化微珠的尺寸分布以及该过程后的细胞存活率。通常通过逆转凝胶以从微珠中回收细胞，用于进一步分析。
<ol>
	<li>为评估微珠的粒径分布，使用甲苯胺蓝-O对微珠进行染色。
	<ol>
		<li>将0.5 mL微珠加入含10%完全培养基的4 mL处理缓冲液中。</li>
		<li>加入500 µL用处理缓冲液配制的1 g/L甲苯胺蓝溶液。</li>
		<li>在锥形管中于50 rpm的旋转摇床上孵育60分钟。</li>
		<li>加入5 mL含10%完全培养基的处理缓冲液，并立即将微珠及溶液转移至培养皿中，使用低倍显微镜或手持式数码相机获取图像。如需增强对比度并避免阴影，可在使用手持相机拍摄前将培养皿置于光源箱上。</li>
		<li>进行图像分析以定量微珠粒径分布，方法如前所述32，例如使用图像分析免费软件36。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为定性评估细胞存活情况，使用碘化丙啶同型二聚体（ethidium homodimer）染色以识别死细胞，使用钙黄绿素AM（calcein AM）染色以识别活细胞。
	<ol>
		<li>将1体积的微珠加入4体积含10%完全培养基的处理缓冲液中。</li>
		<li>加入适量的钙黄绿素AM和碘化丙啶同型二聚体储备液，使其终浓度分别为4 µM和2 µM。通过仅向部分微珠样品中加入其中一种试剂，制备单染对照组。</li>
		<li>将微珠置于冰上孵育20分钟。</li>
		<li>使用垫片（如O型圈）将溶液置于载玻片与盖玻片之间，以避免压碎微珠。</li>
		<li>进行荧光显微镜观察。使用单染对照组评估荧光串色。根据钙黄绿素AM（激发/发射波长494/517 nm）和与DNA结合的碘化丙啶同型二聚体（528/617 nm）的激发/发射波长选择合适的荧光滤光片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为从微珠中回收细胞以进行后续分析，使用柠檬酸盐或其他螯合溶液对海藻酸盐进行解胶处理。
	<ol>
		<li>配制含有55 mM柠檬酸盐、10 mM HEPES和95 mM NaCl、pH为7.4的解胶溶液。</li>
		<li>将该溶液与10%培养基混合，然后将1 mL海藻酸盐微珠加入9 mL混合液中。</li>
		<li>在冰上以75 rpm振荡20分钟进行解胶。 
		注意：此时细胞可用于分析，或通过离心从解胶后的海藻酸盐溶液中分离。例如，可通过台盼蓝染色定量解胶后细胞的活力。或者，可将细胞离心并洗涤，随后进行mRNA、DNA和/或蛋白质的取样与分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

各个步骤（如图所示） 图2) 在内凝胶反应过程中可能会限制整体反应动力学。对于粒径大于约 ~2.5 µm，碳酸盐溶解速率已被证明是限速步骤26,44导致细胞内钙释放的酸化步骤也已被证明是影响细胞存活的关键工艺变量32因此，导致内部凝胶化的条件对于微珠质量和细胞存活均至关重要。根据微珠的最终应用，可选择不同的最佳工艺条件。例如，较大的pH下降值（例如 使用10 mM HEPES缓冲海藻酸盐溶液）可能适用于对微球长期稳定性要求较高的移植应用。另一方面，较低的pH下降（例如 使用60 mM MOPS缓冲海藻酸盐溶液可能更为合适 体外 应用。
除了调节酸化的程度和持续时间外，还可以设想其他工艺改进。例如，可采用其他搅拌容器构型、海藻酸钠浓度、工艺缓冲液、有机相和酸化试剂。如前所述，通过改变乳化步骤中的搅拌速率，可轻松调节微珠的平均粒径。此外...

哺乳动物细胞封装已被广泛研究，作为一种保护移植细胞免受免疫排斥的方法1 或为固定化细胞培养提供三维支撑2,3,4胰岛在海藻酸盐微珠中的包封已被用于逆转同种异体移植中的糖尿病5,6 或异种的7,8,9,10,11,12 啮齿类动物。用于治疗1型糖尿病的包封胰岛移植的临床前和临床试验正在进行中13,14,15用于移植应用或大规模生产 体外 固定化细胞制备通常采用基于喷嘴的微珠发生装置。一般将海藻酸盐与细胞的混合物通过喷嘴泵出，形成液滴后落入含二价阳离子的搅拌溶液中，从而实现液滴的外部凝胶化。同轴气体流动16,17，喷嘴振动18，静电排斥19 或旋转导丝20 促进液滴在喷嘴尖端的形成。
传统微珠制备装置的主要缺点是通量有限，且仅在有限的溶液黏度范围内才能形成良好的微珠21在高流速下，从喷嘴流出的液体会分裂成小于喷嘴直径的液滴，从而降低尺寸控制能力。可采用多喷嘴微珠发生器以提高产量，但需确保各喷嘴间流体的均匀分布，并合理使用溶液 &gt;0.2 Pas 存在问题22最后，所有基于喷嘴的装置预计都会对胰岛造成一定程度的损伤，因为所用喷嘴的直径介于 100 µm 和 500 µm，而约15%的人类胰岛可大于 200 µm23.
在本视频中，我们介绍了一种通过单步乳化法形成液滴来包封哺乳动物细胞的替代方法，而非逐滴生成。由于微珠的制备是在一个简单的搅拌容器中完成的，该方法适用于从小规模（约1 mL）到大规模（103 L量级）的微珠生产，且设备成本较低24。该方法可在较短时间（例如 20分钟）内，使用多种不同黏度的海藻酸钠溶液制备出高度球形的微珠。该方法最初由Poncelet et al.25,26开发，曾用于固定化DNA27、蛋白质28（包括胰岛素）29以及细菌30。我们近期已将该方法改进并应用于哺乳动物细胞的包封，包括胰腺β细胞系31,32和原代胰腺组织32。
该方法的原理是生成一种水包油型乳液，其中含有分散在矿物油中的海藻酸盐液滴，随后实现海藻酸盐液滴的内部凝胶化（图1）。首先将封装材料（例如， 细胞被分散于含有细颗粒难溶性钙盐的海藻酸盐溶液中，该钙盐在初始工艺pH下溶解度较低。随后将海藻酸盐混合物加入搅拌中的有机相，通常在表面活性剂存在下形成乳液。在哺乳动物细胞包封的情况下，血清中存在的成分可起到表面活性剂的作用。接着通过加入一种可溶于油且能分配进入水相的有机酸来降低pH，从而使钙盐溶解。乙酸在矿物油/水相之间的分配系数 &lt;0.00533应先在油中预溶解，然后加入乳液中，在油相中混合后迅速分配至水相34. 图2 说明在酸化和内部胶凝步骤中发生的化学反应与扩散过程。最后，通过相转化、经离心加速的相分离、反复洗涤以及过滤回收包封的细胞。随后可对微珠和细胞取样，进行质量控制分析。 体外 细胞培养和/或包封细胞的移植
<img alt="微胶囊化过程示意图；油/碳酸钙-海藻酸盐体系装置；离心、过滤步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55280/55280fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：基于乳化法的哺乳动物细胞封装过程示意图。 首先通过乳化海藻酸钠、细胞和CaCO₃制备微珠3 矿物油中的混合物（示意图中的步骤1和2），通过加入乙酸引发内部凝胶化（步骤3）。然后通过加入水相缓冲液促使相转变，将凝胶珠从油相中分离出来（步骤4），接着进行离心和吸除油相（步骤5），再进行过滤（步骤6）。最后，将滤膜上收集的凝胶珠转移至细胞培养基中 体外 培养或用于移植。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示CH3COOH、CaCO3反应及Ca-海藻酸盐形成过程的静态平衡示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55280/55280fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：内部凝胶化过程中发生的反应与扩散步骤。 （1）将乙酸加入有机相，并通过对流传递至海藻酸盐液滴。（2）乙酸分配进入水相。（3）在水存在下，酸解离并扩散至图中深蓝色所示的CaCO3颗粒。（4）H+离子与CaCO3中的Ca2+离子发生交换，释放出Ca2+离子。（5）钙离子扩散直至遇到未反应的海藻酸盐，从而引发海藻酸盐链的离子交联。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
与传统的基于喷嘴的细胞包封装置不同，由于搅拌乳化过程中液滴形成的机制，该方法预期会产生较宽的微珠粒径分布。对于某些应用而言，这种微珠粒径分布可能存在问题。例如，在较小的微珠中，更大比例的细胞可能暴露于微珠表面。如果营养物质（例如 氧气）限制是一个需要关注的问题，这些限制在较大的微珠中可能会加剧。搅拌乳化法的一个优点是，可通过在乳化步骤中改变搅拌速率，轻松调节微珠的平均粒径。此外，可利用较宽的微珠粒径分布来研究微珠尺寸对包封细胞性能的影响。
对于未配备微珠发生器的实验室而言，通过乳化和内部凝胶化实现哺乳动物细胞包封是一种颇具吸引力的替代方法。此外，该方法还允许用户缩短处理时间，或在极低或极高海藻酸钠浓度下生成微珠。
以下方案描述了如何将细胞包埋于10.5 mL含5%海藻酸钠的溶液中，该溶液使用10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液配制而成。该海藻酸钠由移植级LVM（低黏度、高甘露糖醛酸含量）与MVG（中等黏度、高古洛糖醛酸含量）按50:50比例混合组成。以终浓度24 mM的碳酸钙作为物理交联剂。轻质矿物油作为有机相，乙酸用于酸化乳液并引发内部凝胶化。然而，海藻酸钠的类型与组成以及所选用的工艺缓冲液取决于具体应用需求32。已有多种类型的海藻酸钠（见材料表）被用于本方案制备微球。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂与耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LVM 藻酸盐（移植级）</td><td>Novamatrix</td><td>不适用</td><td>在结果中称为 &quot;藻酸盐 #1&quot;。</td></tr><tr><td>MVG 藻酸盐（移植级）</td><td>Novamatrix</td><td>不适用</td><td>在结果中称为 &quot;藻酸盐 #2&quot;。</td></tr><tr><td>藻酸盐（细胞培养级）</td><td>Sigma</td><td>A0682（低粘度）或 A2033（中等粘度）</td><td>A2033 在结果中称为 &quot;藻酸盐 #3&quot;。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定，源自加拿大</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，经细胞培养测试</td><td>Sigma</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>细颗粒 CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Avantor Materials</td><td>1301-01</td><td>配制 CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 悬浮液后，需进行超声处理，并在一个月内使用。</td></tr><tr><td>轻质矿物油</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O121-4</td><td>使用前需通过孔径为 0.22 &amp;mu;m 的膜进行无菌过滤。</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>操作时需谨慎：请参阅材料安全数据表（MSDS）。</td></tr><tr><td>无菌刮勺</td><td>Sigma</td><td>CLS3004-100EA</td><td></td></tr><tr><td>无菌尼龙细胞筛，40 &amp;micro;m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（2 mL、5 mL、10 mL、25 mL）</td><td>Sarstedt</td><td>86.1252.001、86.1253.001、86.1254.001 和 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝-O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL 微载体搅拌瓶</td><td>Bellco</td><td>1965-00100</td><td>近期型号的搅拌桨构型可能不适合充分乳化。可使用聚四氟乙烯（Teflon）板定制一种能够将油相搅拌至距离瓶底仅 0.5 cm 的叶片。</td></tr><tr><td>带可调转速的磁力搅拌板</td><td>Bellco</td><td>7760-06005</td><td>使用前应校准转速（例如使用转速计）。</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Innovatis</td><td>Cedex AS20</td><td>该系统现由 Roche 销售。此自动细胞计数仪也可用台盼蓝染色后在血细胞计数板上进行手动细胞计数替代。</td></tr><tr><td>LED 光源箱</td><td>Artograph</td><td>LightPad&amp;reg; PRO</td><td>该设备可用其他类型的照明装置替代。</td></tr><tr><td>手持相机</td><td>Canon</td><td>PowerShot A590 IS</td><td>可使用多种手持相机拍摄甲苯胺蓝-O 染色微珠图像。拍摄前应在盛有微珠的培养皿旁放置一把尺子。</td></tr><tr><td>配备相差功能和合适荧光滤光片的荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>实验中使用了多种显微系统对微珠成像。此处展示的结果是使用配备 GFP 和 TRITC 荧光滤光片的 IX81 显微镜获得的。为完整捕获微珠图像，根据搅拌速率选用 4X 至 20X 物镜。活/死染色图像通常使用 20X 至 40X 物镜拍摄。</td></tr><tr><td>图像采集软件</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td>可使用多种图像采集软件获取相差和荧光图像。</td></tr><tr><td>图像分析免费软件</td><td>CellProfiler</td><td>不适用</td><td>可使用多种图像分析软件将微珠识别为对象并分析其大小（例如 ImageJ）。</td></tr></tbody></table>

使用简易搅拌反应器将哺乳动物细胞包封于海藻酸盐微珠中

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

海藻酸盐微珠包封细胞已被用于固定化细胞培养 体外 以及用于免疫隔离 体内胰岛封装已被广泛研究，作为提高同种异体或异种移植中胰岛存活率的一种手段。海藻酸盐封装通常通过喷嘴挤出和外部胶凝实现。采用该方法时，含有细胞的海藻酸盐液滴在喷嘴尖端形成后落入含二价阳离子的溶液中，阳离子扩散进入液滴引发离子交联型海藻酸盐胶凝。由于液滴必须在喷嘴尖端形成，限制了可达到的体积通量和海藻酸盐浓度。本视频介绍一种可放大的乳化方法，用于将哺乳动物细胞封装于0.5%至10%的海藻酸盐中，细胞存活率达70%至90%。在此替代方法中，含有细胞和碳酸钙的海藻酸盐液滴在矿物油中乳化，随后降低pH值，促使内部钙离子释放并引发离子交联型海藻酸盐胶凝。该方法可在乳化后20分钟内完成海藻酸盐微球的制备。封装步骤所需设备仅为大多数实验室常见的搅拌容器。

在乳化和内部胶凝过程结束时，应回收到与初始海藻酸盐和细胞混合物体积相近的微珠体积。微珠应高度呈球形，缺陷极少（图3）。微珠应具有足够的强度，能够耐受通过宽口移液管进行移液操作。在高海藻酸盐浓度下，微珠中可能出现包埋的油滴或气泡。这可能是由于在乳化步骤（油/水/油双重乳液）中油被截留在海藻酸盐液滴中所致。据我们观察，这类微珠仅占微珠总体积的一小部分（&lt;5%），并且由于其密度较低，在回收微珠时通过吸除油相即可去除大部分此类微珠。
<img alt="细胞培养的显微镜图像，突出显示细胞结构和密度，比例尺为 500 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55280/55280fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 ...

本视频和论文描述了一种基于乳液的方法，用于将哺乳动物细胞包裹在0.5%至10%的海藻酸盐微珠中，该微珠可通过简单的搅拌装置大规模制备。包裹后的细胞可用于培养 体外 或用于细胞治疗应用的移植。

海藻酸盐微球中的细胞包封已用于体外固定化细胞培养以及体内免疫隔离。胰岛...

本视频介绍了一种使用简单搅拌容器将哺乳动物细胞（如胰岛细胞）包埋于海藻酸盐微珠中的固定化方法。该方法的原理是通过水相与油相乳化形成海藻酸盐液滴，随后实现海藻酸盐液滴的内部凝胶化。该操作的第一步是制备一种乳化液，其中含有海藻酸盐、细胞和碳酸钙的水相被分散于矿物油有机相中。第二步是通过加入油溶性酸（如乙酸）使乳液酸化，该酸会迅速分配至水相中。pH值的降低导致碳酸钙溶解，并促使海藻酸盐液滴在内部胶凝形成微球。最后一步是通过加入水溶液从乳液中回收微球，经离心分离两相后，对微球进行洗涤和过滤。固定化的细胞随后可在体外培养或用于移植。我们所描述的方法为使用基于喷嘴的细胞包封装置制备海藻酸盐微球提供了一种替代方案。该方法源自Poncelet等人于1992年首次报道的酶和微生物细胞固定化技术。我们最感兴趣的用途是采用海藻酸盐包封技术，以实现移植细胞的免疫隔离，从而减少甚至消除对抗排斥药物的需求。与基于喷嘴的装置相比，基于乳液的方法主要优势在于其可扩展性和稳健性。由于液滴几乎是同时生成的，因此可以在极短时间内从极稀或极高浓度的海藻酸盐溶液中生产出大量微珠。此外，该过程非常稳定，不易失败，即使存在可能堵塞喷嘴的颗粒物也能顺利进行；最后，该工艺设备相当简单，因此对大多数实验室而言易于获取且相对成本较低。关键的加工步骤包括乳化形成海藻酸盐液滴，以及酸化以释放内部的钙源。液滴尺寸主要受搅拌桨设计、搅拌速率和搅拌时间的影响。微珠的机械性能和细胞存活率受到酸化程度和持续时间的影响。在本视频中，我们演示了一种用于将细胞包封于5%海藻酸盐微珠中以进行移植的方法。这些参数可能需要针对其他潜在应用进行优化。为了制备含有LVM和MVG海藻酸盐各半混合物的5%海藻酸盐微珠，称取583毫克LVM和583毫克MVG海藻酸粉末。将20毫升处理缓冲液置于磁力搅拌器上。在移植应用中，我们使用含有170毫摩尔氯化钠、pH为7.4的10毫摩尔HEPES缓冲液。将海藻酸粉末逐步加入溶液中。将溶液置于搅拌器上，低速搅拌过夜。如有必要，将烧瓶固定在搅拌板上。次日，若海藻酸钠未完全溶解，将容器固定于旋转混合器上，在37摄氏度下继续过夜搅拌。待海藻酸钠完全溶解后，将溶液在高压灭菌器中灭菌30分钟。打开高压灭菌器前，需使温度降至50摄氏度以下。通过将1克碳酸钙加入20毫升工艺缓冲液中，制备碳酸钙悬浮液。对碳酸钙悬浮液及用于乳化过程的搅拌容器进行高压灭菌。使用前，从容器中去除所有冷凝水痕迹。乳化过程开始前，立即将44 µL冰醋酸溶解于置于50 mL锥形管中的11 mL矿物油中。常见的错误是醋酸未完全溶解；避免移取小于10 µL的体积，并通过反复涡旋确保醋酸完全溶解。在进行细胞包封前，让所有溶液均达到室温。在旋转烧瓶中加入 10 毫升矿物油，并以 250 转/分钟开始搅拌。若使用贴壁细胞（如 beta-tc3 细胞），需用胰蛋白酶消化细胞。加入完全培养基以终止反应，并取样进行细胞计数。通过手动或自动细胞计数器确定细胞浓度。将细胞在300 ×g条件下离心7分钟，然后将细胞沉淀重悬于完全培养基中。重复离心步骤，随后将细胞重悬于适当体积的完全培养基中，使其浓度达到珠粒中目标终浓度的10.5倍。将9.9毫升海藻酸钠溶液转移至平底管中，然后加入1.1毫升细胞原液和550微升碳酸钙悬浮液。通过轻柔涡旋混合海藻酸钠、碳酸钙和细胞悬浮液。立即用注射器将10.5毫升该混合液转移至搅拌中的油相中。提高搅拌速率，然后启动计时器。为确定搅拌速率，应首先建立珠粒大小与搅拌速率之间的标准曲线。12分钟后，加入10毫升油和乙酸溶液，以酸化乳液，使钙从碳酸盐中释放，并形成凝胶珠粒。此内部凝胶步骤需静置八分钟。注意含有酚红pH指示剂的乳化液滴发生颜色变化。将搅拌速率降低至400 RPM，加入40毫升工艺缓冲液与10%培养基的混合液以中和酸，从而引发相转变。一分钟后停止振荡，将混合物转移至锥形管中。用额外的20毫升培养基冲洗旋转烧瓶，并将冲洗液加入锥形管中。在吸取油相之前，尽可能吸除水相溶液。以 630 g 离心 3 分钟，以加速磁珠沉降和相分离。使用巴斯德移液管抽吸去除油层和过量工艺缓冲液。每次洗涤之间用 630 g 离心，至少用培养基洗涤磁珠一次。使用40微米尼龙细胞滤网过滤珠子悬浮液，并从滤网下方抽吸除去多余的液体。用刮勺将珠子转移至已知体积的培养基中。测量珠子体积，并补充培养基至所需珠子浓度。典型的浓度为每5毫升总体积使用1毫升珠粒。此后，始终使用宽口移液管操作珠粒，以避免损坏。包封的细胞现在可转移至T形培养瓶中，用于体外培养或移植。乳化过程结束后，应获得含有固定化细胞的海藻酸盐微球。过程完成后，应常规评估微球的粒径分布和细胞存活率。为确定微球粒径分布，可用甲苯胺蓝对微球进行染色，随后进行图像分析。此过程将产生较宽的微珠粒径分布。为评估细胞存活率，可将微珠与活/死细胞染料（如钙黄绿素-AM 和碘化丙啶同型二聚体）共同孵育。采用本视频所述方法，测得 beta-tc3 细胞存活率为 76%。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用简单的搅拌系统将哺乳动物细胞固定在海藻酸盐微珠中。本视频展示的基本实验方案适用于采用多种类型的海藻酸盐和浓度，对各类细胞进行固定化。我们建议每次使用新的海藻酸盐或油批次时，均应建立平均微珠粒径与搅拌速率之间的标准曲线。我们所描述的乳化过程为基于喷嘴的细胞封装技术提供了一种颇具前景的替代方案。这是一种稳定且简便的方法，可用于将哺乳动物细胞固定在海藻酸盐微球中。随着我们以及全球其他研究团队在喷嘴细胞治疗领域的不断发展，这类规模化制备技术将有望满足全球数以万计糖尿病患者的需求。我们已发表了将β细胞系移植到5%海藻酸盐微珠中的 promising 结果，并继续探索这种改进的抗移植排斥屏障在体内的表现。

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生物工程

使用简单搅拌容器在藻酸盐珠中的哺乳动物细胞包封

我们介绍了将细胞包封于合成水凝胶中的三维（3D）技术方案。文中概述了两种常用的交联方法（迈克尔加成反应和光引发自由基反应）的包封步骤，以及多种用于评估包封后细胞行为的技术。...

用于组织工程的三维水凝胶细胞包封

在以下章节中，我们概述了用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备方法。我们重点介绍一种用于制备多层海藻酸盐微球的技术，该技术可同时包封细胞和蛋白质，有望用于治疗1型糖尿病。...

用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备

本视频演示了一种制备包封分泌神经毒性β-淀粉样蛋白细胞的聚合物微珠的方法。将细胞-聚合物悬浮液通过微珠制备装置处理，通过钙离子交联实现聚合物凝胶化，从而在细胞周围形成球形微珠。该聚合物可支持细胞增殖，同时允许可控且长期地释放β-淀粉样蛋白，模拟其在阿尔茨海默病中的累积过程。...

用于模拟阿尔茨海默病的β-淀粉样蛋白释放型聚合物微球的制备

本文介绍了一种用于包封消耗脂肪以产生热量的分解代谢细胞的实验方案，这些细胞存在于腹腔内脂肪组织中，并可在肥胖小鼠中增加能量消耗。...

包封产热型前脂肪细胞并移植至脂肪组织库

我们建立了一种利用同轴喷嘴将多能干细胞（PS细胞）包封于海藻酸盐水凝胶微胶囊中的方法。该方法可防止细胞过度聚集，并降低悬浮培养过程中细胞所受的剪切应力。该技术适用于多能干细胞的大规模生产以及干细胞微环境的研究。...

使用同轴喷嘴进行多能干细胞的海藻酸盐封装

本文介绍了共固定化全细胞生物催化剂以实现辅因子再生并提高其可重复利用性的实验方案，以L-木酮糖的生产为例。通过偶联两种表达功能互补酶的Escherichia...

海藻酸钙微珠中多酶共固定化用于辅因子再生及提高重复使用性

具有异质细胞群体的承重组织的构建与分析仍是一项挑战。本文中，我们描述了一种制备双层海藻酸盐水凝胶圆盘的方法，该圆盘可作为在同一结构内共培养不同细胞群体的平台。...

分层海藻酸盐构建体：异质细胞群体共培养平台

本方案通过海藻酸盐的快速物理凝胶化来包封细胞，从而实现细胞的固定化。所获得的微珠能够随时间可控且持续地分泌β-淀粉样蛋白，可用于研究分泌型β-淀粉样蛋白在体外和体内模型中的作用。...

用于阿尔茨海默病建模的β-淀粉样蛋白分泌海藻酸盐微珠的制备

本文介绍了一种利用海藻酸盐作为聚合物对永生化细胞进行微囊化，以实现向啮齿类动物眼部长期递送生物制剂的实验方案。...

用于向小鼠眼部递送生物制剂的包封细胞技术

本文展示了两种在三维培养条件下包封猪卵母细胞的实验方案。第一种方法是将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包封于纤维蛋白-海藻酸盐微珠中；第二种方法是将其与氟化乙烯丙烯粉末颗粒（微型生物反应器）共同封装。这两种系统均可提供最佳条件，以维持卵母细胞的三维结构。...

蛋白酶可降解的海藻酸盐水凝胶与疏水性微型生物反应器用于猪卵母细胞包封

学习使用简单搅拌容器通过乳液法将哺乳动物细胞包封在藻酸盐珠中的方法。该技术可高效规模化生产，适用于细胞治疗和组织工程应用。

使用简易搅拌反应器将哺乳动物细胞包封于海藻酸盐微珠中

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