高吞吐量的单细胞和多细胞微胶囊
June 15th, 2012
结合单分散细胞和颗粒的惯性顺序降代，我们描述了一种方法封装在一个单一千赫率下降所需的细胞或颗粒数。我们证明效率两次超过无序封装的单粒子和双滴。
使用小皮升尺寸液滴封装的细胞的应用通常受到无法控制每滴细胞数量的限制。该协议展示了一种通过结合两种不同的微流体现象、流体动力学细胞排序和在流聚焦微喷嘴处产生液滴来控制细胞封装的方法。在上游通道中，提供足够高的流速的带有悬浮细胞或颗粒的水溶液，以在下游流动方向上形成等间距的列车。
流聚焦液滴发生喷嘴用于在表面活性剂稳定的允许油载体液中以千赫兹速率形成水滴。然后，通过调整水流速和油流速，将有序的细胞颗粒序列与液滴生成相结合，以提供与纵向有序细胞或颗粒到达液滴生成喷嘴同步的液滴生成速率，同时将颗粒用作细胞替代物。为了证明此协议，流速必须足够小以限制流体。
对生物细胞的纯粹压力，细胞顺序液滴生成和细胞活力的重叠。水性流速限制为单个和多个细胞的受控封装提供了理想的作方案。视频显微镜数据分析表明，单细胞和双细胞或颗粒的包埋效率均优于随机包埋效率，并大大减少了不包含所需细胞或颗粒数量的液滴数量。
与大量悬浮液相比，限制细胞和液滴限制了细胞分泌物的稀释，突出了细胞异质性，还控制了细胞间信号。将这些细胞封装成液滴的有效方法为生物学研究人员提供了一个有价值的工具开始此程序。在 AutoCAD 软件中设计一个微通道图案，如下图所示。
长通道截面表示宽度为 27 微米的水性流序通道。放大的喷嘴示意图显示，水排序通道和油通道的通道宽度相等，均为 27 微米，随后喷嘴收缩 22 微米，并突然膨胀为更宽的 61 微米通道。设备高度为 52 微米。
水入口和进油口都有大的碎屑过滤器，其间隙与订购通道宽度大致相同，如这个放大的进油口示意图所示。显示。这是订购通道和注入染料的喷嘴的真实图像。聘请第三方制造商在聚酯薄膜或石英上打印高分辨率透明蒙版，其中通道在深色背景上是透明的。
随后创建用于复制成型的硅和 SU 8 光刻胶母版。将母模粘在培养皿的底部，用于 PDMS 复制成型。复制品成型完成并切出设备轮廓后，使用 0.75 毫米外径的活检打孔器将流路端口打入下图所示的三个圆形区域，将透明胶带打到 PDMS 的图案侧，并在等离子粘合后剥离以去除任何灰尘。
将 PDMS 连接到干净的玻璃显微镜载玻片。将整个设备放入烤箱中，逐渐将烤箱加热至 120 摄氏度。将设备在 120 摄氏度的烘箱中放置过夜，以完成粘合并将 PDMS 恢复到原来的疏水状态。
使通道玻璃表面疏水的另一种方法是将涂层（如 aquae）注入流体端口，然后用空气吹扫。使用 1 毫升注射器和注射器针头吸入数百微升空气，然后小心地吸入少量足以填充金属注射器尖端的 aquil，但用力注入 aqua，然后将吹扫空气吹入流体端口。而不会破坏 PDMS 以积极地进行玻璃粘合。
在所有入口和展望端口上重复空气吹扫，同时擦去多余的水，以避免任何沉积物在干燥时可能堵塞通道。控制细胞浓度对于获得适当数量的细胞和适当的滴数至关重要。这有两个具有挑战性的组成部分。
首先是事先估计适当的浓度，第二个是在实验过程中保持该浓度 对于本研究中使用的特定设备，应充分订购 8 至 15 微米的细胞或颗粒以进行受控封装。在本演示中，将使用 9.9 微米 polys diary 微球作为细胞替代物来制备水颗粒悬浮液浓度，以实现理想的审计包埋，从重量计为 1% 固体的微球储备浓度开始，使用以前的数据进行完整排序。作为指导，通过轻轻离心 1 毫升储备样品，去除 250 微升腌液，然后通过涡旋混合或更温和的混合 Resus 悬浮颗粒，将浓度增加到 1.5%固体。
使用细胞时，细胞和聚苯乙烯颗粒的比重都大于 1，但本视频中未显示。对于持续数分钟到数小时的长期实验，溶液可以通过添加溶质（如颗粒中的氯化钙或细胞的 opti prep）来匹配浮力。细胞或颗粒悬浮液准备好后，在 15 mL离心管涡旋中制备 10 mL 连续氟碳油相样品。
将表面活性剂和氟碳油混合至重量的约 2.5%。在这里，我们获得了 2.4 重量的混合物，这对于设置微胶囊实验是可以接受的。首先，打开倒置光学显微镜和高速相机的电源。
专注于微通道层，检查通道是否有堵塞和任何可能脱落的碎屑。选择没有大碎屑或明显堵塞的通道。剪断三根半透明 tigon PVC 管，用于水入口、油入口和乳化液出口，以最大限度地减少死体积。
剪断刚好足以从注射泵到显微镜的管路。以 45 度角载物台切割管端 为了便于插入流体端口，请使用镊子将管端压入流体端口。然后将 30 号钝头不锈钢注射器针头压入水性进样管的自由端。
对进油管重复上述步骤。使用 20 倍物镜移动设备并将管道连接到显微镜载物台上，对准并聚焦在设备喷嘴上。手动调整显微镜以获得 Kohler 照明，以在焦平面上提供最佳照明。
使用高速相机软件裁剪喷嘴周围的视野以允许更高的帧速率，然后根据需要设置帧速率、曝光时间和其他相机设置，以实现最佳录制。接下来，将先前制备的充分混合的水相溶液填充 1 毫升注射器。将油相溶液填充到 3 毫升注射器中。
垂直倾斜其中一个装满的注射器，然后轻弹以将气泡移动到注射器出口。慢慢按下柱塞足够长的时间，将空气推向垂直固定注射器的注射器尖端。将注射器连接到已连接到设备的相应注射器针头。
按下柱塞，迫使空气通过注射器针头死体积，直到液体通过管道几乎到达设备，将注射器牢固地安装到注射泵上并接合柱塞块。重复连接第二个注射器并将其安装到第二个注射泵上，打开每个注射泵的电源并为每个泵编程。使用制造商的方案，将油相的初始流速设置为 50 微升/分钟，将初始流速设置为每分钟 5 微升。
对于水相启动，泵等待每种流体进入设备并填充通道，推出剩余的死气。使用初始流速，这可能需要几分钟时间。观察喷嘴处液滴的形成。
缓慢增加水流速，以观察长水溶液通道中颗粒的排序。随着流速的增加，不要将流速增加到在喷嘴处触发水性流体流喷射的程度，如本例所示，使用不同的液滴生成喷嘴注释，这里存在不稳定的流动和不一致的液滴。如果颗粒浓度太低，无法提供缺失颗粒相对较少的交变序列，并且样品的浮力不匹配，则将注射泵向注射器出口倾斜，以使颗粒逐渐沉降到注射器出口。
一旦有适当的排序，调整油流速以调整液滴的产生频率和大小。迭代调整两种流速，以获得所需的包埋速率和液滴体积。确认稳定有序的封装后，将出口管从废液储液罐移至收集储液罐中以备将来使用。
可以高效地实现单颗粒和双颗粒或细胞封装。利用此处显示的该方案是单颗粒包埋的代表性结果，油流速为每分钟 60 微升，水性流速为每分钟 9 微升。Lambda，则 drop 的平均粒子数为 0.95。
对于完全有序的交替颗粒，流动方向上的颗粒间距约为 17 至 18 微米。本例中的墨滴生成率为 6.1 KBHZ，平均墨滴尺寸为 24.4 皮升。直方图将单粒子封装的阶数与 plus 的液滴封装粒子效率进行比较。
据统计，对于 517 滴样品量的随机封装，含有一个颗粒的液滴的平均比例为 79.5%，而预测的随机封装比例为 36.7%对于491个颗粒的样本量，观察到最终进入正确封装液滴中的颗粒比例为 83.7%， 而随机包埋分数为 37.3%双颗粒包埋是通过将油流速降低到每分钟 30 微升，同时将水流速保持在每分钟 9 微升来实现的。在这里 lambda，每滴的平均颗粒数为 1.8。类似于单颗粒封装。
对于完全有序的交替颗粒，流动方向上的颗粒间距约为 17 至 18 微米。较大的液滴的平均液滴尺寸为 39.8 皮升，与随机封装相比，其形成速率为 3.8 KBHZ。对于 383 滴的样品量，包含两个颗粒的有序包埋滴的平均分数为 71.5%，而预测的随机包埋分数为 26.8%。观察到在 689 个颗粒的样品量中趋向于正确封装的液滴中的颗粒比例为 79.5%，而随机包封分数为 33.4%。
总之，这些结果表明，单颗粒和双颗粒包埋效率都比随机包埋效率高出两倍以上，并大大减少了不包含所需数量的细胞或颗粒的液滴数量。本实验运行说明了适当的颗粒或细胞浓度对高包埋效率的重要性。虽然油和水的流速与前面所示的双颗粒包埋运行相同，但每滴 lambda 的平均细胞数降低到 1.57。
因此，不会发生完全有序的情况，因此火车上会出现孔洞，留下的太阳滴中的颗粒比预期的要少。此直方图显示了由于 Lambda 值较低，双颗粒封装的效率降低。对于 324 滴的样品量，包含两个颗粒的液滴的平均比例为 55.9%，其中单颗粒液滴的数量几乎与双颗粒液滴的数量相同。
这表明 Lambda 应等于或接近每滴所需的细胞数，以根据每滴细胞数是可容忍的，以最大化正确封装的颗粒或具有所选 lambda 的确切值的细胞。在这个演示中，我们利用浮力失配来实时控制实验过程中的浓度。然而，对于长期实验，在将细胞封装到水滴中后，可能建议进行浮力匹配以获得更一致的结果。
时间依赖性实验可以在离心管中或在显微镜下进行，方法是将液滴重新注入微流体阵列中。
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概述
本协议描述了一种通过结合流体动力学细胞排序与滴液生成来控制皮升量级滴液中细胞封装的方法。该方法允许高频滴液生成，同时保持对每个滴液中细胞数量的控制。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流体学
- 细胞封装
- 滴液生成技术
背景
- 细胞在小滴中的封装对于各种应用至关重要。
- 之前的方法缺乏对每个滴液中细胞数量的控制。
- 微流体技术可以提高细胞封装的精度。
- 结合不同的微流体现象可以提高效率。
研究目的
- 开发一种精确控制滴液中细胞封装的方法。
- 证明结合细胞排序和滴液生成的有效性。
- 实现比无序方法更高的封装效率。
使用的方法
- 利用流动聚焦滴液生成喷嘴。
- 高流速以创建有序的细胞或颗粒队列。
- 同步滴液生成与有序细胞的到达。
- 使用表面活性剂稳定的油载体流体进行滴液形成。
主要结果
- 证明了对每个滴液中细胞数量的控制。
- 实现了千赫兹频率的滴液生成速率。
- 显示出超过无序封装的效率。
- 使用细胞和颗粒替代物验证了该方法。
结论
- 该方法允许在微流体滴液中有效封装细胞。
- 结合细胞排序与滴液生成增强了控制。
- 这种方法可以应用于各种生物学和生物医学应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Controlling the number of cells per drop in microfluidic encapsulation addresses a key limitation in high-throughput screening and single-cell analysis, where random encapsulation leads to inefficient use of samples and increased downstream sorting. By synchronizing drop generation with ordered cell trains, this method significantly improves encapsulation efficiency for defined cell numbers, enhancing predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The approach supports scalable, reproducible workflows for early discovery and assay development, reducing biological variability and improving data quality in compound screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating defined numbers of cells to study homotypic and heterotypic interactions in controlled microenvironments.
- Operational Value: Increases the fraction of drops containing the desired number of cells, reducing waste and improving throughput in screening applications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides monodisperse, cell-confined drops that prevent dilution of biomarkers and amplify signals from cellular secretions, improving assay sensitivity.
- Operational Value: Supports kilohertz drop generation rates with high encapsulation efficiency, enabling scalable and reproducible assay formats for high-content screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of intercellular signaling and cellular heterogeneity in defined group sizes, supporting mechanistic de-risking of lead candidates.
- Operational Value: Allows re-merge of drops for downstream analysis, enabling continuity from discovery through preclinical validation without cross-contamination.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling controlled encapsulation at the assay preparation stage, supporting lead identification through improved signal-to-noise in cellular readouts and reducing false negatives from uneven cell loading.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control over cellular composition in each drop, reducing noise from variable cell numbers.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized drops with quantitative outputs that improve reproducibility across runs and sites.
- Analytics: Generates encapsulation efficiency metrics (Pk=1, Pk=2) that allow teams to compare ordered vs. random encapsulation and assess workflow performance.
- Translational Research: Enables study of controlled cell-cell interactions, supporting biomarker alignment and preclinical continuity for immunomodulatory or co-culture dependent therapies.
- Enterprise Reuse: Represents a modular microfluidic capability adaptable to various cell types and particle surrogates, supporting platform-level investment over single-use techniques.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity from uncontrolled cell heterogeneity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via synchronized drop generation and cell ordering, minimizing batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved data quality and reduced false hits in screening cascades.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by enabling more reliable assessment of compound effects in physiologically relevant cellular contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, flow rate optimization, and particle concentration control to maintain ordered trains.
- Depends on precise instrumentation including syringe pumps, high-speed imaging, and flow focusing nozzles with specific geometries.
- Necessitates cross-team standardization of particle/cell concentration protocols and buoyancy matching for long-term experiments.
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly regarding shear stress sensitivity and cell viability under high flow rates.
- Practical limitations include the need to balance flow rates for ordering versus jetting avoidance and the dependency on consistent particle concentration for optimal encapsulation efficiency.
