用于评估缺血性心脏病基因治疗疗效的大动物模型
2021年9月2日
心肌基因治疗在缺血性心脏病的未来治疗中具有广阔前景。本文介绍了一种用于评估基因治疗在缺血性心脏中疗效的大动物模型。
本方案中所采用的方法和成像方式可在开展临床试验前，对缺血性心脏病基因治疗的安全性和有效性提供全面的影像学评估。该技术的主要优势在于缺血模型的侵入性较低，同时能够将基因治疗精准靶向心脏中运动减弱但仍有活性的区域。首先在缺血手术、基因转导及安乐死之前进行经胸超声心动图检查，以评估是否存在可检测到的心包积液，并测定心肌应变。
将换能器置于猪腋下第三或第四肋间，标记指向猪的胸骨，以获取二尖瓣水平、乳头肌水平及心尖水平的胸骨旁短轴切面图像。然后按“采集”按钮保存一段视频。在缺血手术直接开始前进行冠状动脉造影时，需在透视引导下使用6-F导管，结合碘对比剂对右冠状动脉、左冠状动脉主干及左前降支进行成像。
使用自动注射器进行电影成像时，将团注持续时间设为3秒，总容量设为21毫升，然后按下“单次”按钮，并确认通过5-F猪尾导管向左心室注射碘对比剂。首先在动物静息状态下进行电影成像，随后静脉注射多巴酚丁胺，并逐步增加剂量以诱导应激状态。当达到目标心率（每分钟160次）后，进行电影成像，然后移除猪尾导管。
为了计算射血分数，打开测量软件，选择相关图像的心室分析功能。滚动图像以选取一个舒张期和一个收缩期的时间帧，然后选择工具分别绘制每个时间帧的心室轮廓。为诱导慢性心肌缺血，在基因转导前14天，将线圈放置于左冠状动脉，并将狭窄支架滑入左冠状动脉，将支架置于第一对角支远端。
使用球囊扩张导管将支架在动脉内扩张至额定压力，支架与管腔的比例为1.3，以固定狭窄部位。再维持15秒后，回缩支架，将设备从动脉中撤出，并通过血管造影确认支架在狭窄部位的正确位置。在荧光透视引导下完成血管造影及功能测量后，经股动脉鞘将标测导管送入左心室进行电生理解剖标测，从左心室采集至少100个点，并点击“接受”以确认每个标测点。
在最终的心肌活性图中，以超过五毫伏的单极电压作为判断标准。对于运动减退区域，选择尽可能低的局部线性缩短率，至少低于12%，最好低于6%。动物安乐死后，从胸腔内取出心脏。取出心脏并冲洗后，在主动脉瓣上方插入一支18号针头，并将针头连接至灌注泵。
用750毫升1%多聚甲醛灌注心脏。使用锋利的刀片将心脏切成厚度为1厘米的切片，并从基因转导区域采集样本，分别置于4%多聚甲醛和液氮中。将用于染色的样本在4%多聚甲醛中于4°C条件下保存48小时。
通过测量周向应变、射血分数以及使用¹⁵O-水PET扫描评估心肌灌注，来分析基因治疗的疗效。通过将心脏与电生理解剖图谱进行比对，可直接从基因转导区域采集组织样本。通过β-半乳糖苷酶染色后分析阳性细胞数量，以及通过血小板/内皮细胞黏附分子-1染色后分析心肌毛细血管面积，利用免疫组织化学分析评估转基因表达和治疗性血管生成。
通过血管造影确认瓶颈支架的位置，并从基因转导区域采集样本，可通过将心脏与电生理解剖图谱进行比较来验证。总体而言，以最可重复的方式进行所有测量至关重要。
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概述
本文讨论了一种用于评估缺血性心脏病中心肌基因治疗有效性的大型动物模型。所述方法为临床试验前基因治疗的安全性和有效性提供了重要依据。
关键研究组成部分
科学领域
- 心血管研究
- 基因治疗
- 缺血性心脏病
背景
- 心肌基因治疗在治疗缺血性心脏病方面显示出良好的应用前景。
- 大型动物模型对于临床前评估至关重要。
- 在开展人体试验之前，明确基因治疗的疗效十分关键。
- 所提出方法的主要优势在于低侵入性和精准靶向性。
研究目的
- 评估基因治疗在缺血性心脏疾病中的安全性和有效性。
- 建立可靠的大型动物模型，用于未来研究。
- 评估心肌应变及心包积液检测。
使用的方法
- 经胸超声心动图评估心肌应变。
- 在荧光透视引导下使用6-F导管进行冠状动脉造影。
- 使用碘对比剂对冠状动脉进行成像。
- 评估心脏运动减弱但仍有活性的区域，以确定基因治疗靶向部位。
主要结果
- 证明了该缺血模型的低侵入性。
- 清晰展示了基因治疗的安全性和有效性。
- 确定了基因治疗的有效靶向策略。
- 为未来的临床试验建立了框架。
结论
- 心肌基因治疗在缺血性心脏病治疗中具有重要意义。
- 所建立的模型适用于临床前评估。
- 需要进一步研究以在临床环境中验证研究结果。
常见问题
行业重要性概述
该大型动物模型通过模拟临床相关终点并实现治疗性血管生成的精确定位，支持缺血性心脏病基因治疗的临床前评估。该方法通过标准化的影像学和功能评估，使动物实验结果与人体试验预期保持一致，从而降低转化风险。它为在IND申报前研究之前降低基因治疗候选药物的风险提供了一个可重复的框架。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在与疾病相关的猪缺血性心脏模型中验证治疗性血管生成的假设。
- 操作价值：利用电生理解剖标测精确定位基因转导至运动减弱但仍有活性的心肌区域，提高靶区确认的准确性。
- 预测价值：采用周向应变、射血分数和¹⁵O-水PET灌注作为定量终点指标评估疗效，这些指标可预测临床反应。
筛选与检测方法开发
- 检测准备：建立超声成像、冠状动脉造影和正电子发射断层扫描（PET）的标准化操作流程，以确保在不同研究队列中获得可重复的功能性检测结果。
- 定量输出：生成可量化的应变、射血分数和灌注数据，支持检测方法的标准化以及不同实验室之间的数据可比性。
- 可扩展性：支持在同一动物模型中进行多次成像（基线、缺血后、基因转导后），实现纵向评估。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：通过左冠状动脉支架诱导的缺血模拟慢性冠状动脉疾病，与人类病理生理学一致。
- 转化连续性：采用临床公认的影像学方法（超声、血管造影、PET）将临床前研究结果与临床试验设计相衔接。
- 基于风险调整的推进机制：基于多模态影像学和组织学验证得出的预设疗效与安全性阈值，支持做出推进或终止决策。
流程与工作流整合
该模型适用于从发现到临床前研究的连续过程中，在靶点确认之后、先导化合物优化之前提供功能验证，尤其适用于需要体内作用机制证明的基因治疗候选物。
- Discovery Biology：通过实现靶向递送和心肌恢复的长期监测，支持对促血管生成因子的假设验证。
- Screening：提供标准化、定量的成像输出（应变、射血分数、灌注），可用于不同基因治疗载体的比较评估。
- Analytics：提供多模态数据流——功能成像、组织学毛细血管密度和转基因表达，用于综合疗效评估。
- Translational Research：使临床前终点与临床试验指标保持一致，提高对治疗性血管生成策略的预测可信度。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的平台，用于评估缺血性心脏病中的多个基因治疗靶点，减少模型开发的重复性工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过将基因转导部位（借助电生理解剖标测图）与存活但运动减弱心肌的功能改善及毛细血管生长相关联，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化的影像学方案、支架置入位置验证以及对已标测基因转导区域进行盲法组织取样，确保研究的可重复性。
- 战略价值：在推进研究前，要求功能恢复、灌注改善与组织学水平的血管新生之间具有一致性，从而优化“继续/终止”决策过程。
- 项目组合影响：基于临床可预测的大型动物模型中的临床前疗效，实现对基因治疗项目的基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备大型动物外科手术、介入心脏病学和电生理解剖标测方面的专业知识，以实现支架和导管的精确定位。
- 依赖于成像基础设施的支持，包括超声、X射线透视以及能够进行¹⁵O-水灌注成像的PET/CT扫描仪。
- 需要建立标准化的操作流程，用于缺血诱导、基因转导以及多模态终点数据的采集，以确保数据的可重复性。
- 在将该模型扩展至其他缺血模型或基因递送载体（如病毒性与非病毒性载体）时，需考虑相应的适应性调整。
- 由于需要专门的技术人员和设备，与啮齿类动物模型相比，可能增加研究的复杂性和成本。
