用组织培养幼苗制备和饲养轴性昆虫用于叶甲虫的宿主 - 肠道微生物群相互作用研究

肠道细菌可以影响昆虫宿主的多种生理过程。准备和维持轴酸幼虫是研究肠道细菌功能的有力工具。该方案的主要优点是，植物组织培养用于获得无菌叶片以芦叶为食，以昆虫为来源的昆虫表面灭菌卵，并且这种方法不受人工日粮的限制。

这种方法很方便，可以提高维持轴性昆虫的可见性，用于未来的肠道细菌研究，特别是对于没有发达的人造饮食的非模型昆虫。在27摄氏度和70%相对湿度的生长室中保持花斑蚴种群，光照16小时，暗光照8小时。将昆虫放在带有倾斜的湿吸纸的穿孔塑料盒中，并喂它们新鲜的杨树枝。

在吸收的纸张上喷洒清水以保持水分，并每两天更换一次树枝。化蛹后分离成虫产卵，喂它们嫩叶以获得更多的卵。在24小时内，收集新产下的卵并将其放在潮湿的吸收纸上60小时，以制备轴酸幼虫。

在每毫升1毫克α-萘乙酸或NAA储备溶液中制备MS培养基。在生物安全罩中，将50微升NAA储备溶液加入500毫升MS培养基中，并摇匀均匀。然后每个组织培养容器倒入约50毫升并等待凝固。

在生物安全罩中的酒精灯火焰中对手术刀和镊子进行消毒。在生长约一个月时从杨树幼苗中切下具有顶端芽或侧芽的三至四厘米茎段，并将其插入培养基中，每个容器一个或两个茎段。将这些茎段在生长室中孵育约30天。

并用这些无菌的叶子来喂养轴酸幼虫。在含有LB琼脂培养基的培养皿中高压灭菌皿，油漆刷，滤纸，蒸馏水。将带有粘附卵的叶子放入培养皿中。

然后用镊子小心地从叶子上取出卵子，并将它们转移到另一个培养皿中。用75%乙醇洗涤这些鸡蛋八分钟。然后用无菌水重复洗涤四次。

将卵转移到LB琼脂培养基上，以保持孵化的水分。将培养皿放在生长室中，等待卵在24小时内孵化。在生物安全罩中，在培养皿中铺上三张湿滤纸，并将无菌杨树叶放在纸上。

收集幼虫并将其放在叶子上。用Parafilm密封培养皿，并将其在生长室中孵育。每两天更换一次叶子。

对于传统饲养的群体，将卵从叶子转移到含有湿滤纸的培养皿中，并用无菌杨树叶喂养这些幼虫。从无菌和常规饲养的群体中随机选择三种第一，第二和第三龄幼虫。在体视显微镜下用无菌剪刀和镊子解剖三龄幼虫，并将其内脏收集在微量离心管中。

将完整的第一和第二龄幼虫收集在管中。向1.5毫升管中加入100微升PBS和三个钢球，并使用珠打均质机将组织研磨成均质物。使用无菌玻璃铺展棒将100微升匀浆加入LB琼脂培养基和板中。

将板在37摄氏度孵育24小时。然后观察细菌菌落。使用DNA提取试剂盒提取先前获得的组织的总DNA，并用分光光度计测量DNA浓度。

使用具有PCR的通用16S rRNA引物扩增细菌16S rRNA基因，按照文本手稿中所述建立反应。将PCR产物储存在四摄氏度，直到进一步分析。将PCR产物与核酸染料混合，并在1X TAE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上使用电泳对其进行分析。

使用10微升的DNA标记物作为参考。用UV透射仪观察凝胶，并在1， 500个碱基对周围寻找靶片段。虽然在任何无菌组中都没有观察到细菌菌落，但在所有常规饲养的组中都观察到它们，这表明来自喂养组织培养的杨树叶的灭菌卵的幼虫不含细菌。

1， 500个碱基对PCR条带出现在所有常规饲养的组中。相比之下，在无菌组或阴性对照组中未观察到条带，这意味着在轴性幼虫中不存在肠道细菌。对于具有微小卵的昆虫物种，需要优化消毒剂的种类和灭菌时间。

此外，组织培养植物中的内生菌应值得注意。该协议为维持无菌昆虫提供了一种新方法，这是促进昆虫 - 肠道细菌相互作用研究的便捷工具，特别是对于没有发达人工饮食的非模型昆虫。