Name: 用组织培养幼苗制备和饲养轴性昆虫用于叶甲虫的宿主 - 肠道微生物群相互作用研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学习利用组织培养无菌叶片饲养表面消毒卵孵化的轴性叶甲幼虫的方法。该技术无需人工饲料，适用于非模式昆虫的肠道微生物群相互作用研究。

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本工作由国家自然科学基金（31971663）和中国科协青年人才托举工程（2020QNRC001）资助。

1. 昆虫饲养
<ol>
	<li>维持&#160;的 P. versicolora 在27 °C、相对湿度70 ± 5%、光周期16小时光照/8小时黑暗的培养室条件下饲养种群。将昆虫置于底部打孔的塑料盒中，盒内铺有湿润的吸水纸并提供新鲜的杨树枝条作为食物。定期向吸水纸喷洒清水以保持湿度，每两天更换一次枝条。</li>
	<li>羽化后将成虫隔离进行产卵，饲以嫩叶以获得更多的卵。</li>
	<li>收集24小时内新产的卵。将卵置于湿润的吸水纸上孵化60小时，以获得无菌幼虫。 
	&#8203;注意：新产的卵约72小时后孵化。对卵表面进行消毒的最佳时间为孵化前一天；否则，成功孵化的卵数量将减少。</li>
</ol>
2. 无菌杨树培养
<ol>
	<li>配制 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基以及 1 mg/mL 的 α-萘乙酸 (NAA) 储备液（参见材料表）。</li>
	<li>在生物安全操作台中，将 50 µL 的 1 mg/mL NAA 储备液加入 500 mL MS 培养基中，充分振荡混匀，每瓶组织培养容器倒入约 50 mL，静置待其凝固。</li>
	<li>准备好解剖刀、酒精灯和镊子；在生物安全操作台内，用酒精灯火焰对解剖刀和镊子进行灭菌处理。</li>
	<li>从生长约 1 个月的杨树幼苗（无菌组织培养苗）上切取带有顶端芽或侧芽的 3–4 cm 茎段，每瓶培养容器插入 1 至 2 段茎段。</li>
	<li>将这些茎段置于培养室中，在 25 °C、光照强度为 50 ± 10 cd、光周期为 16 小时光照/8 小时黑暗的条件下培养约 30 天。使用无菌叶片饲喂无菌幼虫。</li>
</ol>
3. 卵表面消毒及无菌幼虫培养
<ol>
	<li>将培养皿、毛笔、滤纸、蒸馏水以及含有LB（Luria-Bertani）琼脂培养基的培养皿进行高压灭菌。</li>
	<li>将带有附着卵的叶片放入培养皿中，用镊子小心地将卵从叶片上取下，并转移至另一个培养皿中。 
	注意：此步骤应极为小心，因为卵牢固地附着在叶片上。</li>
	<li>用75%乙醇清洗这些卵8分钟，并用无菌水重复清洗四次。</li>
	<li>将卵转移至LB琼脂培养基上，以保持湿度促进孵化。 
	注意：使用LB琼脂培养基有助于验证消毒后的卵是否无菌。</li>
	<li>将培养皿置于培养箱中，在24小时内等待卵孵化。</li>
	<li>在生物安全柜中，于培养皿内铺三层湿润的滤纸，将无菌杨树叶片放置于滤纸上，收集幼虫并将其置于叶片上，用封口膜密封培养皿，并在培养箱中于27 °C、70 ± 5%相对湿度、16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下培养。 
	注意：组织培养的叶片较为脆弱，容易快速失水。因此，在将叶片转移至培养皿时，使用湿润的滤纸是必要的。</li>
	<li>每两天更换一次叶片。</li>
	<li>对于常规饲养组，将卵从叶片转移到含有湿润滤纸的培养皿中，并用无菌杨树叶片饲喂这些幼虫。</li>
</ol>
4. 通过依赖培养的检测方法验证无菌幼虫
<ol>
	<li>从无菌组和常规饲养组中随机选取三只1st、2nd和3rd龄幼虫。</li>
	<li>在体视显微镜下使用无菌剪刀和镊子解剖3rd龄幼虫，并将其肠道收集至微量离心管中；将完整的1st和2nd龄幼虫直接收集到离心管中。 
	注意：由于1st和2nd龄幼虫体型过小，无法解剖，因此需整体收集，并保持其肠道完整。</li>
	<li>向1.5 mL离心管中加入100 µL磷酸盐缓冲液和三颗钢珠，使用珠磨式均质器将组织研磨成匀浆。</li>
	<li>取100 µL匀浆液加入LB琼脂培养基中，用无菌玻璃涂布棒涂布。</li>
	<li>将平板置于37 °C培养24小时，观察细菌菌落生长情况。</li>
</ol>
5. 使用非培养依赖性检测方法验证无菌个体
<ol>
	<li>使用DNA提取试剂盒提取组织的总DNA（组织来源于第4节）。</li>
	<li>使用分光光度计在260 nm处测定DNA浓度。</li>
	<li>使用通用16S rRNA引物通过PCR扩增细菌16S rRNA基因。反应体系包含18 µL 1.1x PCR预混液（见材料表）、0.5 µL 27F引物（5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'）、0.5 µL 1495R引物（5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'）和100 ng模板DNA。PCR反应条件设置为：95 °C预变性3 min；随后进行28个循环，每个循环为95 °C变性30 s、55 °C退火1 min、72 °C延伸1 min；最后72 °C终延伸10 min。PCR产物暂存于4 °C，待后续分析。</li>
	<li>将PCR产物与核酸染料混合，使用1%琼脂糖凝胶在1x TAE缓冲液中进行电泳分析。以10 µL DNA Marker作为分子量参照。</li>
	<li>使用紫外透射仪观察凝胶，寻找大小约为1,500 bp的目标条带。</li>
</ol>

<ol><li>Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+and+ecological+consequences+of+gut+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Ecology%2C+Evolution%2C+and+Systematics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Tokuda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-associated+spirochetes+are+major+agents+of+hemicellulose+degradation+in+the+hindgut+of+wood-feeding+higher+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).</li>
<li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li>
<li>Shin, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+microbiome+modulates+host+developmental+and+metabolic+homeostasis+via+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling.</a> Science. 334 (6056), 670-674 (2011).</li>
<li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+plantarum+promotes+Drosophila+systemic+growth+by+modulating+hormonal+signals+through+TOR-dependent+nutrient+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing.</a> Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).</li>
<li>Salem, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+supplementation+by+gut+symbionts+ensures+metabolic+homeostasis+in+an+insect+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host.</a> Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838(2014).</li>
<li>Koch, H., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socially+transmitted+gut+microbiota+protect+bumble+bees+against+an+intestinal+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).</li>
<li>Cirimotich, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+microbe-mediated+refractoriness+to+Plasmodium+infection+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae.</a> Science. 332 (6031), 855-858 (2011).</li>
<li>Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+bacteria+protect+wasp+larvae+from+fungal+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation.</a> Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).</li>
<li>Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+modulates+gut+immunity+and+promotes+baculovirus+infection+in+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera.</a> Insect Science. , (2021).</li>
<li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+-+Exploitation+of+gut+bacteria+in+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust.</a> Nature. 403 (6772), 851(2000).</li>
<li>Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+bacteria+of+Dendroctonus+valens+and+their+involvement+in+verbenone+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production.</a> Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).</li>
<li>Schretter, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+microbial+factor+modulates+locomotor+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila.</a> Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+modulates+Drosophila+aggression+through+octopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2698(2021).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+immunological+effects+of+gut+microbiota+in+leaf+beetles+at+the+local+and+systemic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels.</a> Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+the+gut+microbiota+in+environmental+RNA+interference+in+a+leaf+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle.</a> Microbiome. 9 (1), 98(2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+an+invasive+bark+beetle+infected+by+a+pathogenic+fungus+accelerates+beetle+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality.</a> Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).</li>
<li>Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+applications+of+insect+symbionts+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potential applications of insect symbionts in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).</li>
<li>Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+genetically+engineered+Trabulsiella+odontotermitis+as+a+%27Trojan+Horse%27+for+paratransgenesis+in+termites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 202(2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fighting+malaria+with+engineered+symbiotic+bacteria+from+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li>
<li>Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+germ-free+Drosophila+to+study+gut-microbe+interactions%3A+protocol+to+rear+Drosophila+under+axenic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions.</a> Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52(2018).</li>
<li>Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+lifespan+enhancement+by+exogenous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).</li>
<li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464(2018).</li>
<li>Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-free+mosquitoes+via+transient+colonisation+allows+stage-specific+investigation+of+host-microbiota+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 942(2021).</li>
<li>Berasategui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+of+the+pine+weevil+degrades+conifer+diterpenes+and+increases+insect+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness.</a> Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).</li>
<li>Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+antibiotics+on+larval+gut+bacterial+diversity+of+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).</li>
<li>Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+red+palm+weevil+Rhynchophorus+Ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+germ-free+larvae+for+host-gut+microbes+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies.</a> Bio-protocol. 9 (24), 3456(2019).</li>
<li>Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+diets+for+rearing+the+Colorado+potato+beetle%2C+Leptinotarsa+decemlineata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata.</a> Journal of Insect Science. 1, 7(2001).</li>
<li>Bengtson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+program+for+the+evaluation+of+artificial+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+World+Aquaculture+Society%22%5BJournal%5D)">A comprehensive program for the evaluation of artificial diets.</a> Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).</li>
<li>Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+feeding+preference+in+a+leaf+beetle%3A+the+importance+of+phenotypic+plasticity+of+a+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+Letters%22%5BJournal%5D)">Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant.</a> Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).</li>
<li>Ishihara, M., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+inactivity+and+prolonged+developmental+time+induced+by+seasonal+decline+in+host+plant+quality+in+the+willow+leaf+beetle+Plagiodera+versicolora+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).</li>
<li>Bright, M., Bulgheresi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+journey%3A+transmission+of+microbial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A complex journey: transmission of microbial symbionts.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).</li>
<li>Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertically+transmitted+gut+bacteria+and+nutrition+influence+the+immunity+and+fitness+of+Bactrocera+dorsalis+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 596352(2020).</li>
<li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+bacterial+mutualists+evolving+from+environmental+bacteria+in+natural+insect+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations.</a> Nature Microbiology. 1, 15011(2016).</li>
<li>Habineza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoting+effect+of+gut+microbiota+on+growth+and+development+of+red+palm+weevil%2C+Rhynchophorus+ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+by+modulating+its+nutritional+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1212(2019).</li>
<li>Meilan, R., Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poplar+%28Populus+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Poplar (Populus spp.).</a> Methods in Molecular Biology. 344, Clifton, N.J. 143-151 (2006).</li>
<li>Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-endophyte+symbiosis%2C+an+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).</li>
<li>Grout, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristem-tip+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Meristem-tip culture.</a> Methods in Molecular Biology. 6, Clifton, N.J. 81-91 (1990).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

制备无菌幼虫并通过重新引入特定菌株获得无菌定植幼虫，是阐明宿主-微生物相互作用机制的有力方法。新孵化的幼虫主要通过两种途径获得肠道微生物群：来自母体的垂直传播，或来自兄弟个体及环境的水平获得34。前者可通过亲代将微生物污染至卵表面而实现35。因此，通过对昆虫卵表面进行灭菌来获得无菌幼虫具有很高的可行性27,28,29。使用多种抗生素混合处理是获得无菌昆虫的另一种方法，但存在若干缺点28。相比之下，对卵表面灭菌后辅以无菌饲料，是更优的无菌昆虫培育方法23,28,29。
大多...

与哺乳动物类似，昆虫的消化道是食物消化与吸收的腔室。大多数昆虫肠道内定植着多种共生细菌，这些细菌依赖宿主提供的营养在肠道中生长繁殖1。肠道共生菌群对昆虫的多种生理过程具有深远影响，包括食物消化与解毒2,3,4、营养与发育5,6,7、抵御病原体与寄生生物8,9,10,11、化学通讯12,13以及行为调控14,15。有趣的是，某些肠道微生物在特定条件下可转变为兼性致病菌，或被入侵的病原体所利用从而加重感染，表明肠道细菌在某些情况下可能对宿主有害16,17,18。此外，肠道细菌还可作为生物技术应用与害虫防治中的微生物资源。例如，从植食性和木食性昆虫中分离出的木质纤维素降解细菌已被用于植物细胞降解，以开发生物燃料19。通过释放经基因工程改造、可表达生物活性分子的肠道共生菌，是一种新颖且有前景的策略，可用于防控农业与林业害虫以及传播传染病的蚊虫19,20,21，该策略也可用于增强有益昆虫的适应能力22。因此，阐明一种肠道细菌在活体（in vivo）中的行为模式，被视为充分挖掘其功能并拓展其多领域应用的首要任务。
动物可携带1至 &#62;肠道中的1000种共生微生物物种1因此，很难准确验证单个细菌分类群或其群落组装在动物体内的表现，以及特定功能是由宿主还是其微生物伙伴所驱动。因此，需要制备无菌幼虫，并通过单一或多种物种定植获得已知菌系昆虫，以研究细菌与昆虫之间的功能及其相互作用。23目前，施用抗生素混合物和对昆虫卵表面进行灭菌是去除肠道细菌的常用方法。14,24,25,26然而，抗生素饮食无法完全消除肠道细菌，并且对宿主昆虫的生理产生负面影响27,28因此，使用抗生素处理的昆虫可能会掩盖某些肠道细菌的真实功能。幸运的是，对卵进行表面灭菌可消除这一问题。23,29，对实验昆虫无影响或影响极小。此外，人工饲料无法完全模拟昆虫的天然食物，且人工饲料的开发过程成本高昂且耗费大量人力30,31.
柳叶甲（Plagiodera versicolora&#160;）（Laicharting）（鞘翅目：叶甲科）是一种广泛分布的食叶害虫，主要取食杨柳科植物，如柳树（Salix）和杨树（Populus L.）32,33。本研究以柳叶甲作为典型的食叶昆虫代表，建立了一种制备和培育无菌昆虫的实验方案。我们利用植物组织培养技术获得无菌杨树叶，用于从表面消毒的卵开始培育P. versicolora的无菌幼虫。通过依赖培养和非依赖培养的方法，验证了P. versicolora幼虫的无菌状态。该方案所维持的无菌昆虫比使用人工饲料饲养的昆虫更接近其自然状态。更重要的是，该方法操作简便且成本极低，有助于提高获取无菌昆虫的可行性，尤其适用于尚无成熟人工饲料体系的非模式昆虫，为今后昆虫肠道微生物互作研究提供了有力支持。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mg/mL NAA 储存液</td><td></td><td></td><td>a. 配制 0.1 M NaOH 溶液（将 0.8 g NaOH 溶于 200 mL 蒸馏水中）。&lt;br/&gt; b. 取 0.2 g NAA 置于 250 mL 烧杯中，加入少量 0.1 M NaOH 溶液直至 NAA 完全溶解，再用蒸馏水定容至 200 mL。&lt;br/&gt; c. 使用 0.22 &amp;micro;m 注射器滤器和 50 mL 无菌注射器过滤溶液以去除细菌，分装至 1.5 mL 离心管中，并于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sangon Biotech</td><td>F600620</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS 储存液</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>2 M KOH 溶液</td><td></td><td></td><td>将 22.44 g KOH（分子量：56.1）溶于 200 mL 蒸馏水中，121 &amp;deg;C 高压灭菌 20 分钟。</td></tr><tr><td>250 mL 和 2,000 mL 烧杯</td><td>Shubo</td><td>sb16455</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 无菌注射器</td><td>Jinta</td><td>JT0125789</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 量筒</td><td>Shubo</td><td>sb1601</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE 储存液</td><td></td><td></td><td>a.&amp;nbsp;将 242 g Tris 和 18.612 g EDTA 溶于 700 mL 蒸馏水中。&lt;br/&gt; b. 用约 57.1 mL 冰醋酸调节 pH 至 7.8。&lt;br/&gt; c. 用蒸馏水定容至 1,000 mL。&lt;br/&gt; d. 使用时将储存液稀释为 1x TAE 缓冲液。</td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td>Xingheda trade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-萘乙酸（NAA）</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>86-87-3</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸</td><td></td><td></td><td>22.3 cm × 15.3 cm × 9 cm</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Coolaber</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌锅</td><td>Panasonic</td><td>MLS-3781L-PC</td><td></td></tr><tr><td>珠磨式均质仪</td><td>Jing Xin</td><td>XM-GTL64</td><td></td></tr><tr><td>DNA 提取试剂盒</td><td>MP Biomedicals</td><td>116560200</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Saiguo Biotech</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Jiaojie</td><td></td><td>直径 70 mm</td></tr><tr><td>凝胶电泳仪</td><td>Bio-rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>核酸染料 Gel Signal Green</td><td>TsingKe</td><td>TSJ003</td><td></td></tr><tr><td>无菌杨树幼苗</td><td></td><td></td><td>来自中国山东省鲁东大学的山新杨</td></tr><tr><td>Golden Star Super PCR Master Mix (1.1&amp;times;)</td><td>TsingKe</td><td>TSE101</td><td></td></tr><tr><td>生长培养箱</td><td>Ruihua</td><td>HP400GS-C</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂培养基</td><td></td><td></td><td>a. 将 5 g 胰蛋白胨、5 g NaCl、2.5 g 酵母提取物溶于 300 mL 蒸馏水中。&lt;br/&gt; b. 定容至 500 mL，转移至 1,000 mL 三角瓶中，加入 7.5 g 琼脂。&lt;br/&gt; c. 121 &amp;deg;C 高压灭菌 20 分钟。</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>DRAGONLAB</td><td>D1008</td><td></td></tr><tr><td>MS 基本培养基</td><td>Coolaber</td><td>PM1121-50L</td><td>M0245</td></tr><tr><td>用于无菌杨树幼苗培养的 MS 固体培养基</td><td></td><td></td><td>a. 将 4.43 g MS 基本培养基粉末和 30 g 蔗糖溶于 800 mL 蒸馏水中。&lt;br/&gt; b. 使用 pH 计，以 2 M KOH 溶液调节 pH 至约 5.8。&lt;br/&gt; c. 定容至 1,000 mL，均分为两份，分别转移至两个 1,000 mL 三角瓶中，每 500 mL 加入 2.6 g 琼脂。&lt;br/&gt; d. 121 &amp;deg;C 高压灭菌 20 分钟。</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛笔</td><td></td><td></td><td>宽度 1 cm，用于收集虫卵</td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PCR 扩增仪</td><td>Eppendorf</td><td>6331000076</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Supin</td><td></td><td>直径 90 mm</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>移液器 0.2–2 &amp;micro;L</td><td>Gilson</td><td>ECS000699</td><td></td></tr><tr><td>移液器 100–1,000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267</td><td></td></tr><tr><td>移液器 20–200 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000259</td><td></td></tr><tr><td>移液器 2–20 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000232</td><td></td></tr><tr><td>植物组织培养容器</td><td>Chembase</td><td>ZP21</td><td>240 mL</td></tr><tr><td>塑料盒</td><td></td><td></td><td>2.35 L</td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>扩增细菌 16S rRNA 基因的引物</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td>27-F: 5&amp;rsquo;-ACGGATACCTTGTTACGAC-3&amp;rsquo;，1492R: 5&amp;rsquo;-ACGGATACCTTGTTACGAC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钢珠</td><td></td><td>0.25 mm</td><td>用于研磨组织</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans2K plus II DNA Marker</td><td>Transgene Biotech</td><td>BM121-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>1115</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;LP0037</td><td></td></tr><tr><td>紫外透射仪</td><td>Monad Biotech</td><td>QuickGel 6100</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scilogex</td><td>MX-S</td><td></td></tr><tr><td>柳树枝条</td><td></td><td></td><td>中国武汉沙湖公园</td></tr><tr><td>柳叶甲虫</td><td></td><td></td><td>中国武汉华中农业大学</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

利用组织培养幼苗制备和饲养无菌昆虫以研究叶甲虫宿主-肠道微生物互作

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

昆虫肠道被多种细菌定植，这些细菌可显著影响宿主的生理特征。将特定菌株引入无菌昆虫体内，是验证肠道微生物功能并阐明肠道微生物与宿主相互作用机制的有力方法。施用抗生素或对虫卵表面进行灭菌是去除昆虫肠道细菌常用的两种方法。然而，除了抗生素可能对昆虫产生不良影响外，先前的研究表明，饲喂抗生素并不能完全清除肠道细菌。因此，通常采用无菌人工饲料来维持无菌昆虫，但这一过程繁琐且劳动密集，并不能完全模拟天然食物中的营养成分。本文所述为一种高效、简便的制备和维持叶甲无菌幼虫的实验方案。

关键词：昆虫肠道，肠道微生物，无菌昆虫，叶甲，无菌幼虫，人工饲料&#160;(Plagiodera versicolora）。具体而言，对甲虫卵表面进行灭菌处理，随后使用无菌的杨树叶饲养无菌幼虫。昆虫的无菌状态通过依赖培养和非依赖培养的检测方法进一步验证。综上，通过结合卵表面消毒与无菌培养技术，建立了一种高效且便捷的获取无菌昆虫的方法 P. versicolora为其他食叶昆虫提供了一种易于转化应用的工具。

生命阶段 P. versicolora 如图所示 图1成年雄性体型小于成年雌性（图1A）。在野外，该甲虫将卵成簇地产在叶片上；此处，四枚卵从叶片上分离下来（图1B）。用于无菌昆虫饲养的杨树茎段和幼苗如图所示 图2. 3号肠道rd 龄幼虫如图所示 图3，肠道节段用白色方括号标记。
尽管在所有无菌组中均未观察到细菌菌落，但在所有常规饲养组中均观察到了细菌菌落（图4），表明以组织培养的杨树叶饲喂的无菌卵孵化出的幼虫体内不含细菌。所有常规培养组均出现约 1,500 bp 的 PCR 条带，而无菌组及阴性对照组中均未观察到条带。图5)，表明...

为了获得无菌昆虫，需对其卵表面进行消毒，孵化后的幼虫随后使用无菌叶片进行饲养。该方法为无菌昆虫的制备提供了一种高效途径，无需使用抗生素或开发人工饲料，也可应用于其他食叶昆虫。

昆虫肠道被多种细菌定植，这些细菌可显著影响宿主的生理特征。引入特定的细菌菌株……

肠道细菌可影响昆虫宿主的多种生理过程。制备和维持无菌幼虫是研究肠道细菌功能的有力工具。本方案的主要优点在于利用植物组织培养技术获得无菌叶片，用于饲养由表面灭菌卵获得的无菌植食性昆虫，且该方法不受人工饲料的限制。该方法简便且有助于提高无菌昆虫的维持可见性，便于今后开展肠道细菌研究，尤其适用于尚无成熟人工饲料的非模式昆虫。将P.versicolora种群饲养于培养室中，温度为27°C，相对湿度为70%，光照周期为16小时光照、8小时黑暗。将昆虫置于带有倾斜湿润吸水纸的打孔塑料盒中，并饲喂新鲜的杨树枝条。将清水喷洒在吸水纸上以保持湿润，并每两天更换一次枝条。化蛹后将成虫分离以进行产卵，并喂食嫩叶以获得更多卵。在24小时内收集新产的卵，将其置于湿润的吸水纸上60小时，以制备无菌幼虫。配制含1毫克/毫升α-萘乙酸（alpha-naphthalene acetic acid，NAA）储备液的MS培养基。在生物安全柜中，向500毫升MS培养基中加入50微升NAA储备液，充分振荡混匀。然后每份组织培养容器中倒入约50毫升培养基，静置等待凝固。在生物安全柜中，用酒精灯火焰对解剖刀和镊子进行灭菌。从生长约一个月的杨树幼苗上切取带有顶端芽或侧芽的3至4厘米茎段，每容器插入一到两个茎段至培养基中。将这些茎段在培养室中培养约30天。使用这些无菌叶片喂养无菌幼虫。将培养皿、毛笔、滤纸和含有LB琼脂培养基的培养皿中的蒸馏水进行高压灭菌。将带有附着卵的叶片放入培养皿中。然后用镊子小心地将卵从叶片上取下，并转移到另一个培养皿中。用75%乙醇清洗这些卵8分钟，随后用无菌水重复清洗四次。将卵转移到LB琼脂培养基上，以保持湿度利于孵化。将培养皿放入培养箱中，等待卵在24小时内孵化。在生物安全柜中，于培养皿内铺上三片湿润的滤纸，并在滤纸上放置无菌的杨树叶。收集幼虫并将其放置在叶片上。用封口膜密封培养皿，并在培养箱中孵育。每两天更换一次叶片。对于常规饲养组，将卵从叶片转移到含有湿润滤纸的培养皿中，并用无菌的杨树叶喂养这些幼虫。从无菌组和常规饲养组中随机选取三个第一、第二和第三龄幼虫。在体视显微镜下使用无菌剪刀和镊子解剖第三龄幼虫，并将其肠道收集到微量离心管中。在离心管中收集完整的1龄和2龄幼虫。向1.5毫升离心管中加入100微升PBS缓冲液和三颗钢珠，使用珠磨匀浆器将组织研磨成匀浆。取100微升匀浆液加入LB琼脂培养基中，用无菌玻璃涂布棒涂布。将培养皿在 37 摄氏度下孵育 24 小时，然后观察细菌菌落。使用 DNA 提取试剂盒提取先前获得的组织中的总 DNA，并用分光光度计测定 DNA 浓度。使用通用的16S rRNA引物通过PCR扩增细菌的16S rRNA基因，反应体系的设置详见文稿描述。将PCR产物储存于4摄氏度，待进一步分析。将PCR产物与核酸染料混合，随后在1%琼脂糖凝胶中用1X TAE缓冲液进行电泳分析。使用 10 µL DNA 标记物作为参照。用紫外透射仪观察凝胶，寻找约 1,500 个碱基对的目标片段。尽管在所有无菌组中均未观察到细菌菌落，但在所有常规饲养组中均观察到了菌落，这表明由无菌卵孵化并饲喂组织培养杨树叶的幼虫体内不含细菌。在所有常规饲养的组别中均出现了1,500个碱基对的PCR条带。相比之下，无菌组和阴性对照组中均未观察到条带，表明无菌幼虫体内不存在肠道细菌。对于卵粒微小的昆虫种类，所需消毒剂的种类及消毒时间需进行优化。此外，组织培养植物中的内生菌应予以关注。本方案提供了一种维持无菌昆虫的新方法，该方法是一种便捷的工具，有助于开展昆虫肠道细菌相互作用的研究，尤其适用于尚无成熟人工饲料的非模式昆虫。

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Research

科研

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