Name: 优化的骨采样方案，用于从考古遗迹中提取古代DNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 了解从考古遗迹中提取古代DNA的优化骨采样方案。本方法使用牙科钻从多个解剖部位采集骨粉，在洁净室环境下操作，适用于中世纪骨骼遗骸和法医学样本，可获得高质量的内源性DNA用于群体遗传学分析。

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作者谨向马克斯·普朗克人类历史科学研究所的实验室工作人员致以诚挚感谢，感谢他们在本实验方案的开发与实施过程中提供的帮助。若无古多·布兰特博士、伊丽莎白·尼尔森博士、安特耶·维塞戈特和弗朗西斯卡·阿隆的贡献与辛勤工作，本研究将无法完成。本研究由马克斯·普朗克学会、欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下资助，资助协议编号分别为771234 - PALEoRIDER（WH, ABR）和起始资助编号805268 CoDisEASe（授予KIB）。

<ol><li>Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+recovery+of+DNA+from+ancient+teeth+and+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+Science%22%5BJournal%5D)">Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones.</a> Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).</li>
<li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Ancient+DNA%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).</li>
<li>Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+a+limitless+resource%3A+ethics+and+guidelines+for+destructive+sampling+of+archaeofaunal+remains%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains.</a> Royal Society Open Science. 6 (10), 191059(2019).</li>
<li>Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+the+human+cochlea+to+generate+bone+powder+for+ancient+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis.</a> Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).</li>
<li>Latham, K. E., Miller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+recovery+and+analysis+from+skeletal+material+in+modern+forensic+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sciences+Research%22%5BJournal%5D)">DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts.</a> Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).</li>
<li>Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+preservation+in+skeletal+elements+from+the+World+Trade+Center+disaster%3A+Recommendations+for+mass+fatality+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management.</a> Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).</li>
<li>Gamba, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+flux+and+stasis+in+a+five+millennium+transect+of+European+prehistory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Alberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+DNA+sampling+of+ancient+bones+using+Computed+Tomography+scans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans.</a> Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).</li>
<li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).</li>
<li>Sirak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+auditory+ossicles+as+an+alternative+optimal+source+of+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA.</a> Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).</li>
<li>Parker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+investigation+of+human+DNA+preservation+in+medieval+skeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18225(2020).</li>
<li>Pinhasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+ancient+DNA+yields+from+the+inner+ear+part+of+the+human+petrous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0129102(2015).</li>
<li>Sirak, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally-invasive+method+for+sampling+human+petrous+bones+from+the+cranial+base+for+ancient+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis.</a> BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).</li>
<li>Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w">https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w</a> (2020).</li>
<li>Damgaard, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+access+to+endogenous+DNA+in+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).</li>
<li>Harney, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally+destructive+protocol+for+DNA+extraction+from+ancient+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth.</a> Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).</li>
<li>Cooper, A., Poinar, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+DNA%3A+Do+it+right+or+not+at+all%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ancient DNA: Do it right or not at all.</a> Science. 289 (5482), 1139(2000).</li>
<li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+field+to+the+laboratory%3A+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era%5BTitle%5D)+AND+%22STAR%3A+Science+%26+Technology+of+Archaeological+Research%22%5BJournal%5D)">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+field+to+the+laboratory%3A+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era%5BTitle%5D)+AND+%22STAR%3A+Science+%26+Technology+of+Archaeological+Research%22%5BJournal%5D)">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Boessenkool, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bleach+and+mild+predigestion+improves+ancient+DNA+recovery+from+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones.</a> Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).</li>
<li>García-Garcerà, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragmentation+of+contaminant+and+endogenous+DNA+in+ancient+samples+determined+by+shotgun+sequencing%3B+Prospects+for+human+palaeogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics.</a> PLoS ONE. 6 (8), 24161(2011).</li>
<li>Malmström, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+on+contamination%3A+The+use+of+asymmetric+molecular+behavior+to+identify+authentic+ancient+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA.</a> Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).</li>
<li>Basler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+the+contaminant+fraction+of+DNA+obtained+from+an+ancient+giant+panda+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone.</a> BMC Research Notes. 10, 754(2017).</li>
<li>Kemp, B. M., Smith, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bleach+to+eliminate+contaminating+DNA+from+the+surface+of+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth.</a> Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).</li>
<li>Korlević, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+microbial+and+human+contamination+in+DNA+extractions+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth.</a> BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).</li>
<li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).</li>
<li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).</li>
<li>Gansauge, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).</li>
<li>Peltzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAGER%3A+efficient+ancient+genome+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">EAGER: efficient ancient genome reconstruction.</a> Genome Biology. 17 (1), 60(2016).</li>
<li>Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANGSD%3A+analysis+of+next+generation+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ANGSD: analysis of next generation sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 15, 356(2014).</li>
<li>Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gargammel%3A+A+sequence+simulator+for+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA.</a> Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).</li>
<li>Ponce de León, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bony+labyrinth+is+an+indicator+of+population+history+and+dispersal+from+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).</li>
<li>Nagaoka, T., Kawakubo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+petrous+part+of+the+temporal+bone+to+estimate+fetal+age+at+death%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death.</a> Forensic Science International. 248, 188(2015).</li>
<li>Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+angle%3A+A+method+for+sexing+using+the+petrous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone.</a> American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

目前，在古人类群体遗传学研究中，优先选择从pars petrosa（步骤2.1）取样。然而，pars petrosa往往难以获取，因为它在多种骨骼评估中具有重要价值（例如，群体历史32、胎儿死亡年龄估算33以及性别鉴定34）；此外，历史上为DNA分析而取样pars petrosa可能造成严重的破坏性3,4（包括本文所介绍的方案，尽管目前已有多种新型微创取样方案13,14被广泛采用，以缓解这一问题）。更为复杂的是，直到最近之前，学界尚未开展大规模、系统性的人体骨骼各部位DNA提取效果研究11，因此当无法获取岩骨锥体时，确定合适的取样策略极具挑战性。
本文提供的方案通过一系列优化的DNA取样操作流程，有助于缓解这一挑战，这些流程适用于考古学和法医学骨骼遗骸的DNA取样，包括pars petrosa以及另外四种骨骼元素上的七个替代解剖取样部位。所包含的关键步骤均旨在最大限度地减少因取样效率低下（步骤2.1.6和3.2.1.3）或在钻孔/切割过程中样品过热（步骤3.1.6）而导致的DNA丢失或损伤。此外，本方案中多次指出，可能需要修改或省略预处理步骤，以确保在高度降解的样本中获得最佳效果。还应注意的是，即使在本文所列的选定骨骼部位中，仍存在多种可能的替代取样技术（特别是针对pars petrosa13,14），并且本文提出的尚未被充分开发的解剖取样部位仍有很大的进一步优化空间（例如，&#160;距骨：步骤2.5，以及椎骨：步骤2.3）。
还需要注意的是，这些实验方案的设计与测试均基于形态保存良好（形态学保存状况优良）的古代青少年至成年个体遗骸，旨在进行内源性人类DNA分析。所呈现的结果可能不适用于降解程度更高的材料、其他保存环境、婴儿遗骸、非人类遗骸，或病原体与微生物组的研究，因为这些方案在更多情境下的应用仍需进一步探索。此外，本文所介绍的替代骨骼样本（牙齿、椎骨、远端指骨和距骨）在混合遗骸中可能难以准确归属到单一个体，因此有必要从多个骨骼部位取样，以确保样本来源的单一性。尽管存在这些局限性，广泛公开这些实验方案有助于缓解样本选择与处理过程中存在的部分异质性问题，为未来各类人类遗骸的古DNA/法医学研究提供一个通用且经过定量优化的框架。

为获取和分析DNA而对古代人类遗骸进行取样本质上具有破坏性1,2,3,4。样本本身是珍贵的标本，应尽可能保持其形态学完整性。因此，必须优化取样方法，以避免对不可替代的材料造成不必要的破坏，并最大限度地提高实验成功的概率。目前的最佳实践技术主要基于少量研究，这些研究仅限于法医学调查5,6、并非以优化取样为主要目标的古代标本研究7，或使用非人类遗骸8或仅针对极少数解剖学取样部位的研究（本文中“解剖学取样部位”指从骨骼单元的特定区域钻取骨粉，用于后续DNA分析）9,10。本文所介绍的取样方案是在首次针对多个个体的多种骨骼单元开展的大规模系统性DNA保存研究中优化而成的11。所有样本均来自德国萨克森-安哈尔特州佩森附近废弃中世纪定居点克拉考尔贝格（Krakauer Berg）教堂墓地发掘出的11名个体的骨骼单元（详细的样本人口学信息见表1），因此，若用于此地理和时间范围之外的样本，可能需要进行适当调整。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>个体</td>
			<td>性别</td>
			<td>死亡时估计年龄</td>
			<td>14C 测年（公元，日历年代 2-西格玛）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA001</td>
			<td>男性</td>
			<td>25–35</td>
			<td>1058–1219</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA002</td>
			<td>女性</td>
			<td>20–22</td>
			<td>1227–1283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA003</td>
			<td>男性</td>
			<td>25</td>
			<td>1059–1223</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA004</td>
			<td>男性</td>
			<td>15</td>
			<td>1284–1392</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA005</td>
			<td>男性</td>
			<td>10–12</td>
			<td>1170–1258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA006</td>
			<td>女性</td>
			<td>30–40</td>
			<td>1218–1266</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA007</td>
			<td>女性</td>
			<td>25–30</td>
			<td>1167–1251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA008</td>
			<td>男性</td>
			<td>20</td>
			<td>1301–1402</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA009</td>
			<td>男性</td>
			<td>未知</td>
			<td>1158–1254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA010</td>
			<td>男性</td>
			<td>25</td>
			<td>1276–1383</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KRA011</td>
			<td>女性</td>
			<td>30–45</td>
			<td>1040–1159</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：11例样本个体的遗传学性别、考古学推断的死亡年龄估计值以及放射性碳测年（14C 校准后2-sigma范围）。 本表格改编自 Parker, C. 等人，202011。
这些方案可从五个骨骼部位（包括pars petrosa）的八个解剖采样位置相对简便且高效地制备骨粉，同时将实验室引入的DNA污染控制在较低水平。在这五个骨骼部位中，已确定其中四个骨骼部位上的七个解剖采样位置可作为破坏性采集岩骨锥体的可行替代方案11,12。这些位置包括恒磨牙的牙骨质、牙本质和牙髓腔；从胸椎椎体及上椎切迹处采集的皮质骨；从远节指（趾）骨远端膨大部底面及骨干获取的皮质骨；以及距骨外侧部分致密的皮质骨。尽管目前已有多种广泛应用的方法用于pars petrosa4,12,13,14、牙本质及牙髓腔1,2,15的取样，但有关从牙骨质16、椎体、下椎切迹和距骨成功制备骨粉的已发表方法却较难获取。因此，本文展示了优化后的采样方案，涵盖岩骨锥体（步骤3.1）；成人磨牙的牙骨质（步骤3.2.1）、牙本质（步骤3.2.2）和牙髓（步骤3.2.3）；椎体皮质骨（步骤3.3.1）和上椎弓（步骤3.3.2）；远节指（趾）骨（步骤3.4）以及距骨（步骤3.5），以促进这些骨骼部位在古DNA和法医学研究中的更广泛应用。

<table><tbody><tr><td>#16 牙科钻头</td><td>NTI</td><td>H1-016-HP</td><td>示例钻头</td></tr><tr><td>0.6 mm 带锯条</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-097</td><td>珠宝锯用锯条</td></tr><tr><td>22 mm 金刚石切割轮</td><td>Kahla</td><td>SKU 806 104 358 514 220</td><td>Dremel 切割附件</td></tr><tr><td>市售漂白剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1818018</td><td></td></tr><tr><td>Control Company Ultra-Clean Supreme 铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-078-29X</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 管（2 mL）</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 225-01 柔性轴附件</td><td>Dremel</td><td>225-01</td><td>Dremel 柔性延长杆</td></tr><tr><td>Dremel 4300 旋转工具</td><td>Dremel</td><td>4300</td><td>示例电钻</td></tr><tr><td>Dremel 夹头和螺母套件</td><td>Dremel</td><td>4485</td><td>用于各种 Dremel 工具附件/钻头的转接器</td></tr><tr><td>Eagle 33 加仑红色生物危害废物袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-988-501</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf DNA LoBind 2 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-792</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（分子生物学级）</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>FDA 批准的 2 级外科口罩</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-206-0397</td><td>个人防护装备</td></tr><tr><td>Fisherbrand 舒适型腈手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-041-171X</td><td>个人防护装备</td></tr><tr><td>Fisherbrand 安全护目镜</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-208X</td><td>个人防护装备</td></tr><tr><td>Granger 固定式台虎钳</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1336173</td><td>台式虎钳</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>珠宝锯</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-231</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Labconco Purifier Logic 生物安全柜</td><td>Fisher Scientific</td><td>30-368-1101</td><td></td></tr><tr><td>LookOut DNA Erase</td><td>Millipore Sigma</td><td>L9042-1L</td><td></td></tr><tr><td>中号称量舟</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS120223</td><td></td></tr><tr><td>MSC 10 件套钳子/夹具组</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-5352</td><td>杂项&amp;nbsp;夹具/虎钳，用于在钻孔/切割时牢固固定样品</td></tr><tr><td>Sartorius Quintix 半微量天平</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-560-019</td><td>封闭式天平</td></tr><tr><td>带连体头罩的 Tyvek 防护服</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-361-7X</td><td>个人防护装备</td></tr><tr><td>称量纸</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS120116</td><td></td></tr></tbody></table>

优化的骨骼取样方案用于从考古遗存中提取古dna

Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains

本文所述方法旨在最大限度提高从古代考古遗存中回收人类DNA的可能性，同时减少所需取样材料的用量。该方法通过靶向解剖学取样部位实现，这些部位在全骨骼范围内DNA回收的比较分析中已被证实可获得最丰富的古代DNA（aDNA）。先前研究表明，这些实验方案能够最大限度提高从考古遗存中成功回收古代人类及病原体DNA的概率。Parker等人于2020年对来自德国佩森附近废弃中世纪定居点克拉考尔贝格（Krakauer Berg）墓地的11名个体、多个骨骼部位的aDNA保存状况进行了广泛调查，评估了DNA产量。该墓地经放射性碳测年确定为中世纪（约公元1040–1400年，校准后2-sigma范围）。研究发现，涵盖五个骨骼部位（pars petrosa、恒磨牙、胸椎、远端指骨和距骨）的这八个取样位点成功获得了高质量的古代人类DNA，其产量显著高于所有骨骼部位和个体的总体平均水平。所得DNA产量足以满足大多数常见下游群体遗传学分析的需求。我们的研究结果支持在绝大多数涉及从考古遗存中分析古代人类DNA的研究中优先选用这些解剖学取样部位。采用这些方法将有助于最小化对珍贵考古标本的破坏。

在另一项研究中11从11名个体每个解剖采样部位获得的骨粉中，采用针对钙化组织中短片段DNA优化的标准DNA提取方案提取DNA2单链文库随后被构建28 在 HiSeq 4000 平台（75 bp 双端测序）上进行测序，每个样本测序深度约为 20,000,000 条读长。随后使用 EAGER 分析流程对获得的序列数据进行内源性人类 DNA 含量评估。29 （BWA 设置：种子长度为 32，错配罚分为 0.1，比对质量过滤阈值为 37）。所有代表性结果均采用与 Parker 等 2020 年研究相同的指标进行报告。11 为保持一致性。文库来自样品粉末部分的 岩部 平均而言，产生的内源性DNA高于所调查的其他23个解剖采样部位中的任何一个（图6A-B）。本方案中提供的其余七个解剖采样部位（恒磨牙的牙骨质、牙髓腔初次冲洗液及牙本质；胸椎椎体和上椎弓的皮质骨；远端指骨远端丛状突的皮质骨；以及距骨颈部的皮质骨）获得了次高的产量（这些解剖采样部位之间的产量差异无统计学意义； 图6A-B；补充文件1： 内源性DNA预建库）。这些替代取样部位均能稳定产生足以满足标准群体遗传学分析（如线粒体分析和单核苷酸多态性（SNP）分析）所需的DNA产量。来自所有解剖取样部位文库的重复率均较低（簇因子 &lt; 1.2（平均值），计算方法为所有比对读段数与唯一比对读段数的比值， 表2；补充文件1：ClusterFactor），表明所筛选的所有文库均具有极高的复杂度。类似地，外源性人类DNA污染的平均估计值较低，平均为 &lt; 2%（雄性样本中X染色体污染，n = 7，由ANGSD报告）30 除上椎弓外的所有解剖采样位置（平均估计污染率为2.11%，其中一份样本因属异常值被剔除；KRA005：19.52%，见 表2；补充文件1：污染）。平均片段长度（过滤去除所有读段后） &lt; 30 bp）在从牙髓腔和牙本质采集的材料中最低，其他解剖采样部位之间无显著差异（分别为55.14 bp和60.22 bp，相较于平均中位数62.87，成对p值 &lt; 0.019, 表2；补充文件1：平均片段长度）。此外，牙齿和胸椎各自包含多个解剖学取样位点，这些位点均观察到较高的内源性DNA得率，因此特别适合作为替代材料 岩部.
<img alt="显示人类DNA比例和唯一比对读段的DNA回收与比对分析，箱线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63250/63250fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：所有筛选样本的人类DNA含量。 黑色线条表示总体均值，红色线条表示中位数（实线：人类DNA比例，虚线：每百万条测序读段中比对到人类基因组的唯一读段数）。在所有分析中，平均人类DNA比例高于总体均值（8.16%）的各个解剖采样位置均以颜色标注。（A）比对到hg19参考基因组的读段比例。蓝色虚线表示根据分析流程的比对参数所计算的理论最大值（使用Gargammel31模拟从hg19参考基因组随机分布的5,000,000条读段，并加入模拟损伤）。对于平均人类DNA比例高于总体均值的样本，图中报告了其个体均值（黑色X）和中位数（红色圆圈）。置信区间表示排除统计异常值后的上下限。（B）每百万测序读段（75 bp双端测序）中唯一比对到hg19参考基因组的读段数量。置信区间表示排除统计异常值后的上下限。本图改编自Parker, C. 等，202011。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/63250fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表2：所有解剖采样部位的平均重复水平（比对上的读段数/唯一读段数）、平均片段长度与中位片段长度，以及X染色体污染估计值。 误差以均值的标准误表示。本表改编自 Parker, C. 等，202011。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>采样地点</td>
			<td>平均重复因子（#比对上的读段数 / #唯一比对上的读段数）</td>
			<td>平均片段长度（bp）</td>
			<td>X染色体污染的平均估计比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>岩骨锥体</td>
			<td>1.188 ± 0.006</td>
			<td>65.40 ± 1.36</td>
			<td>0.000 ± 0.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牙骨质</td>
			<td>1.197 ± 0.028</td>
			<td>67.28 ± 1.76</td>
			<td>0.011 ± 0.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牙本质</td>
			<td>1.188 ± 0.061</td>
			<td>60.22 ± 2.37</td>
			<td>0.002 ± 0.007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>牙髓</td>
			<td>1.179 ± 0.024</td>
			<td>55.14 ± 2.90</td>
			<td>0.013 ± 0.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>远节指骨</td>
			<td>1.191 ± 0.049</td>
			<td>65.95 ± 1.08</td>
			<td>0.013 ± 0.005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>椎体</td>
			<td>1.194 ± 0.037</td>
			<td>66.14 ± 1.03</td>
			<td>0.008 ± 0.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>上椎弓</td>
			<td>1.19 ± 0.017</td>
			<td>63.02 ± 1.23</td>
			<td>0.021 ± 0.009*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>距骨</td>
			<td>1.198 ± 0.010</td>
			<td>68.20 ± 1.24</td>
			<td>0.011 ± 0.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*样本 KRA005 因偏离值被移除，其数值为 0.1952</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
代码可用性 
本研究中使用的所有分析程序和R模块均可从其相应作者处免费获取。所有自定义的R代码可根据要求提供。
数据可用性 
用于计算代表性结果的所有原始数据均可在欧洲核苷酸档案库（European Nucleotide Archive ENA）中免费获取（登录号 PRJ-EB36983），或见Parker, C. 等人11的补充材料。
补充文件 1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/SupplementalFile1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了一系列最佳实践操作流程，用于从五个不同的骨骼部位上八个推荐的解剖学取样位置（特定骨骼元素上的具体位置）采集中世纪个体的骨粉样本（放射性碳测年校准后2-sigma范围约为公元1040-1400年）。

优化的骨骼取样方案用于从考古遗存中提取古DNA

本文所述方法旨在最大限度提高从古代考古遗存中回收人类 DNA 的成功率，同时限制样品输入量……

这些方案可作为生成骨粉的最佳实践指南，适用于多种骨骼部位后续的DNA提取。目前已有少量已发表的古DNA取样方案涉及牙本质和岩骨以外的部位。今天，我们将展示三种替代部位的详细取样方法。这些方法在处理降解的法医遗骸方面也展现出巨大的应用潜力，同时可作为开发非人类样本类似技术的基准。所有取样操作均应在专用的洁净室中进行，并在配备紫外灯的PCR工作台或生物安全柜内完成。关闭气流，将无菌铝箔铺在工作台表面，以收集任何散落的骨粉或碎片。将一张称量纸放入无菌称量盘中。使用手持夹具夹住经去污处理的磨牙，使其釉质部分朝上，牙根朝下，置于称量盘上方。为牙科钻配备带有金刚石刃口的圆形切割轮。将钻头调至中等转速，以约20度的角度轻轻接触根部边缘。向下刮取样本至托盘中，收集根部最外层的黄色物质。当牙本质的浅色组织开始显露时，停止采集。将粉末转移至一个2毫升的LoBind Safe-Lock管中，并使用精度至少为0.01毫克的电子天平记录所收集的粉末质量。将粉末从称量纸转移至2毫升的LoBind Safe-Lock管中用于提取。将该管储存于20摄氏度条件下。务必回收所有骨碎片及尽可能多的骨粉。每次取样后更换铝箔，并将使用过的铝箔丢弃至可高压灭菌的生物危害袋中。在处理下一块骨骼前，每次均需对工作区域进行去污染，并在实验台表面铺上新的无菌铝箔。将一小张称量纸放入标准称量盘中。使用牙科钻头去除上位椎弓皮质骨最外层，并弃去。然后，用手持钳夹紧椎骨，使棘突朝外，上表面朝下固定。固定椎骨后，以低速高扭矩向棘突与椎板融合形成的V形切迹中心向上钻孔。当阻力明显下降时，停止钻孔。轻微改变钻孔位置，重复操作，直至收集到50至100毫克的骨粉。将称量纸上的骨粉转移至一个2毫升的LoBind管中用于提取，并在20摄氏度下保存。在丢弃铝箔前，确保回收所有骨碎片及尽可能多的粉末。对工作区域进行去污染处理，并按照之前所述方法准备样品采集。将一小张称量纸放入标准称量盘中。手持距骨，使其穹窿朝上，内侧面朝向操作者，置于称量盘上方。使用牙科钻机，配以低速高扭矩的细钻头，从距骨颈部刮取皮质骨，深度约为一毫米。更换钻取位置并重复此操作，直至收集到约50至100毫克的骨粉。将骨粉从称量纸转移至2毫升LoBind管中用于提取。将粉末长期保存于20摄氏度。将剩余的骨骼和多余的粉末储存在干燥、温度受控的无菌环境中，温度为 25 摄氏度。所有废弃物应丢弃至高压灭菌生物危害袋或容器中。所有可重复使用的设备须进行灭菌或去污处理，并在每次取样之间暴露于紫外线下。岩部骨产生的内源性DNA含量高于其他23个解剖学取样位点。本方案中列出的另外七个解剖学取样位点产生了次高的DNA得率。这些替代位点 consistently 产生的DNA得率均足以满足标准群体遗传学分析的需求。来自所有解剖采样部位的文库重复率较低，表明文库复杂度高。牙齿和胸椎均显示出足够的分子回收率。骨样本采集最具挑战性的环节之一是钻孔过程，例如如何握持钻头、在何处钻孔以及何时停止钻孔。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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