蝙蝠组织收集 -细胞分析和原细胞培养

在这段视频中，我们提供了以人道方式收集蝙蝠的分步指南，旨在最大限度地减少对种群的影响，并最大限度地提高科学价值。我们的方法的优点是，我们最大限度地利用每只蝙蝠的潜在分子和形态数据量，保存组织以保留其未来价值，并最大限度地减少野生个体的收获。解剖协议很难口头证明。

我们在这里介绍的许多组织准备技术最好通过可视化不同的器官是如何被识别的，然后正确解剖和储存来传达的。在开始任何解剖之前，请准备好所有小瓶，以避免延迟。对于 RNA，留出每个标本所需的小瓶数量。

用要收集的组织类型以及标准标本识别信息标记每个管。将小瓶装满RNA稳定溶液50%，冷却至4摄氏度。注意不要用RNA稳定溶液完全填充小瓶，因为管子在液氮中放置时可能会爆炸。

安乐死后，立即对蝙蝠标本进行斩首，如文本协议所述。从头发、筋膜和头骨肌肉（包括鼻子上的皮肤）中剥下头骨皮。小心不要打断鼻子的前端。

用钳子去除眼睛，用足够强大的力分离视神经。将眼睛放在两毫升的RNA稳定溶液中。用剪刀从颈部开始，在头骨的后部做一个下垂的切口，注意不要损害大脑。

然后，用钳子轻轻地拉回头骨的两侧，直到它裂开，露出大脑。确保颅骨的头骨已被切除，以便钳子可以轻易地刮走大脑。用钳子轻轻刮脑。

大脑会很软。嗅球将变得可见，坐在头骨内部的腹部。尽量保持嗅觉灯泡连接。

如果可能，保持大脑形状完好无损，并立即放在干冰上，或放在五毫升的RNA稳定溶液中。在头骨的头骨端，现在应该在头部的每一侧横向可见。使用钳子轻轻拉取科利。

然后，将它们放入一个两毫升的RNA稳定溶液中。做两个切口，顶部和底部下颚连接，并删除下颚。克里布里形板将变得明显。

这是保持研究人员导向的关键骨头。它可以被确定为头骨的最前部区域，有多个前身，有嗅球的两个凹槽。一旦下座被移除，从头骨的剩余部分取下讲台。

确保钳口包括 cribriform 板。将鼻子放在RNA稳定溶液中，并储存在4摄氏度过夜。从下层，用剪刀切舌头，并放在两毫升小瓶的RNA稳定溶液。

将鼻瓶放在液氮中，在RNA稳定溶液中过夜后。在冰上或冰箱中浸泡24小时后，将样品放入液氮中。使用手术刀刺穿腹腔，使纵向切口到肋骨。

这会丧失骨骼框架。剥去皮肤以露出胸肌，并至少采集两个肌肉样本。在这些解剖过程中，会收集RNA和DNA的组织。

将高分子量DNA的组织放入干低温中，并在液氮中闪冻。将RNA组织放在RNA稳定溶液中。切开胸骨，把肋骨拉开。

现在，取回肺和心脏。使用手术刀和钳子将心脏与肺分离。使用手术刀分解肺部，并放在RNA稳定溶液中。

收集心脏，这可以采取整体，但应切成两半，使RNA稳定溶液彻底浸泡。现在，从肝脏中抽取样本。至少采集两个肝脏样本。

将一个样品放入小瓶中，以冷冻高分子量DNA，将另一个样品放入RNA稳定溶液中。沿着肝导管找到胰腺和胆囊。将胆囊转移到一小瓶RNA稳定溶液中。

找到胃，和羽毛状的脾脏在它的基础，显示为不同的紫色阴影。胰腺也应该在这里作为重量结构可见。收集胃，脾脏和胰腺，在RNA稳定溶液各自的小瓶。

收集小肠和大肠的小样本。放在RNA稳定溶液的各瓶中。拿一个肾脏，并跟随他们的导管到膀胱，然后放在各自的小瓶RNA稳定溶液。

使用其他肾脏作为指南，找到睾丸，如果男性，或子宫和卵巢，如果女性。如果可能，收集一个或两个性腺。也采取翅膀皮肤的不同部分的样本，并保持在单独的小瓶。

我们方法的主要优点是，它允许我们以非致命性的方式对动物进行采样，同时仍然为基因组研究以及功能分子研究生成足够的材料。我们的协议允许从翅膀组织制备原发性成纤维细胞。这些细胞是遗传物质的珍贵可再生来源，也是蝙蝠功能和分子探索的模型。

根据书面协议第六节，在生长介质中保存的翼形夹子应转移到组织培养设施。将管内物转移到15毫升锥形离心管中。翼膜活检用于此演示。

小心地去除生长介质。用500微升无菌PBS轻轻清洗活检两次。向管子中加入500微升，每毫升一毫克胶原酶四。

这会导致组织消化成单个细胞。在37摄氏度下孵育过夜，无搅拌。第二天，制作新的生长介质，并预热至37摄氏度。

准备一个六井组织培养板，在要使用的每个井中加入两毫升的新鲜预预警生长介质。将此板存放在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳培养箱中，直到需要。从培养箱中取出含有细胞的15毫升管，加入一毫升新鲜生长介质，抑制消化反应。

通过小心地用P1000移液器尖端对溶液进行三叶化，实现单个细胞悬浮，重新悬浮细胞。在桌面离心机中轻轻旋转电池三分钟，以300倍G.用P1000移液器轻轻去除80至90%的液体，丢弃上清液。将颗粒重新在500微升的预预警生长介质中。

轻轻三角悬浮，以确保颗粒不再可见，细胞被充分悬浮，确保避免小块组织，这些组织可能仍然可见在墙上。轻轻地将整个细胞悬浮液体积移液到先前准备的六井板的单一井中，其中包含预热生长介质。从一侧到一侧，从正面到背面轻轻摇动板两到三次，帮助细胞在单个层中的井面上分布。

在显微镜下检查镀块。它们应该是出现球和浮动的单个细胞，但非常密集。小心地将板放入孵化器中，预设为 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳。

大约24小时后，在显微镜下观察细胞，以确定培养者的健康。单元格现在应附加到板表面，并显示为扁平化。将加湿培养箱中的细胞预设为37摄氏度和5%二氧化碳。

应定期在显微镜下观察细胞，以确定需要介质茶点或分裂。必要时，小心地从井中吸入约50%的介质，并轻轻地在井边加入一毫升预预热生长介质，以免干扰细胞。当需要通过细胞时，小心吸气约90%的生长介质。

将一毫升无菌PBS加入井壁，非常温和地清洗细胞，以免干扰细胞。来回轻轻摇动板，并侧摇两到三次。在再次清洗细胞之前，请小心地从盘子中吸出所有 PBS。

将 trypsin EDTA 添加到井中，轻轻摇动板，用 trypsin EDTA 覆盖井的整个表面，并在室温下孵育一分半钟。通过添加一毫升新的预警告生长介质来抑制反应。上下移液约五次，从板表面清洗细胞，并确保细胞悬浮。

将细胞悬浮液放在15毫升的管子中，在桌面离心机中旋转3分钟，达到G.丢弃上清液，用P1000移液器轻轻去除80%至90%的液体。将颗粒重新悬浮在一毫升预警告生长介质中，并轻轻三角悬浮液。确保颗粒的颗粒或大片段不再可见，并且细胞在单个细胞悬浮液中。

要使用自动细胞计数器对细胞进行计数，请将悬浮细胞的十微升等同体与 trypan 蓝色混合在一起，以检测可行的细胞。孵育一分钟，将溶液的移液器10微升放到计数幻灯片上。将计数幻灯片插入自动单元格计数器，使用适当的设置对单元格进行计数。

通过将生长介质与 DMSO 相结合，准备冷冻介质，以获得 10% DMSO 的最终浓度。颗粒应从六井板的 80 到 90% 汇合井中准备。将颗粒重新在一毫升半的冷冻介质中。

将大约750微升的细胞悬浮液放在两个独立的冷冻中。将小瓶放在低温冷冻容器中，使细胞缓慢冻结，以保持细胞活力。立即将它们放在零下80摄氏度。

要解冻冷冻细胞，准备一个六井板，其中包含两毫升预谋生长介质，每一个井将被使用。将板在37摄氏度和5%的二氧化碳培养箱中保持，直到需要。从液氮中吸收一小瓶细胞，放在温水浴中，快速解冻细胞。

这需要两到三分钟。一旦小瓶中的溶液解冻，轻轻上下移液器使溶液均质化，并立即将整个溶液放在六井板的一个井中。从一侧到一侧，从正面到背面轻轻摇动板两到三次，帮助细胞在单个层中的井面上分布。

将细胞在37摄氏度和5%的二氧化碳下放置24至48小时。监控和通过细胞，如证明。对于三种蝙蝠的标准DNA分析，DNA提取的代表性结果显示出来。

单个大带表示最小碎片，以及每个提取的DNA碎片大小相似。RNA提取成功的一个常见指标是RNA完整性数（RIN），其值高于8表示触觉RNA中的高质量。这里展示的是从13种不同种类的新热带蝙蝠物种中提取RNA的RIN值，在四个不同地点取样。

从安迪、哥斯达黎加和多米尼加共和国的物种中取样的组织在一夜之间浸泡在4摄氏度的RNA稳定溶液中后，直接置于液氮中。从亚马逊物种中取样的组织在放置RNA稳定溶液大约一周后被放入液氮中，并连续保持在4摄氏度。即使在这种情况下，RIN 值也可与直接放入RNA稳定溶液中的值相当，并直接放入液氮中。

在组织培养之后，蝙蝠细胞培养物应覆盖80%至90%的板面，并保持其原始形态。这表示拆分的最佳阶段。经过六次超过六次的通道后，细胞将改变其形态，变得更大和更长，细胞将进入衰老。

明亮的球向上的细胞代表死细胞。培养中的细胞代表可再生的物质来源，如DNA、RNA和蛋白质。这些细胞系可以冻结，从而提供一种资源，可用于多年的研究。

这允许基因组学、转录学和功能学研究，使用原组织将具有挑战性。例如，细胞可以通过基因或化学方式进行改造，以观察对细胞表型的影响。