Name: 同步加速器微CT高通量皮质骨样品采购和分析的剖面、科林和图像处理指南 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学习使用地质钻取技术从人体股骨获取皮质骨样本，用于同步加速器微CT成像。该方法可减少伪影，提高骨微结构和矿化差异的可视化质量，为骨生物学研究提供可靠的样品制备方案。

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本文所述研究在加拿大光源中心（Canadian Light Source）的BMIT设施进行，该设施得到加拿大创新基金会、加拿大自然科学与工程研究委员会、萨斯喀彻温大学、萨斯喀彻温省政府、加拿大西部经济多元化署、加拿大国家研究委员会以及加拿大卫生研究院的支持。作者谨向加拿大光源中心光束线科学家表示感谢，特别是Adam Webb、Denise Miller、Sergey Gasilov和Ning Zu，在SkyScan SRµCT及白光显微镜系统的安装与故障排查过程中提供了协助。我们还感谢托莱多大学医学院与生命科学学院的Beth Dalzell，以及东北俄亥俄医学院的Jeffrey Wenstrup博士，为本研究提供尸体样本。JM Andronowski的研究得到了阿克伦大学提供的启动研究资金以及美国国家&#160;司法研究与教育研究所&#160;法医学领域的进展&#160;用于刑事司法目的的资助（2018-DU-BX-0188）。&#160;RA Davis 获得了阿克伦大学提供的研究生助研奖学金。用于取芯和切割的设备与耗材由阿克伦大学的启动资金以及美国国家科学基金会（NSF）资助项目 EAR-1624242（授予 CW Holyoke）购得。

所有标本均来自托莱多大学医学院与生命科学学院以及东北俄亥俄医学院（NEOMED）的经防腐处理的遗体捐赠者，捐赠均获得捐赠者本人或其法定亲属的知情同意。阿克伦大学保护人类受试者机构审查委员会（IRB）认定，由于这些标本并非取自活体个体，因此无需接受完整的IRB审查。所有捐赠者的年龄、性别及死亡原因等人口统计学信息均可获取。所选个体在死亡时均无已知影响骨骼的疾病史，也未接受可能影响骨重建的治疗方案。皮质骨样本取自现代男性和女性遗体的股骨，其年龄范围为19至101岁（平均年龄=73.9岁）。股骨中段已被广泛研究，包括皮质骨孔隙率20,21,22,23,24和骨组织材料密度25,26,27的变异分析，因此已成为微结构分析中常用的部位。
1. 组织获取与研磨
<ol>
	<li>使用配备有用于复合材料的浸入式切割碳化钨锯片的往复锯，从左侧股骨的骨干中段切取约7.5 cm的骨块。</li>
	<li>将股骨组织块浸泡于盛有蛋白酶粉末与自来水混合溶液的耐热玻璃皿中，置于45 °C培养箱内孵育1小时。</li>
	<li>孵育后，使用钝性解剖法或牙科工具小心去除残留的软组织和骨膜。 
	注意：避免使用锋利工具（如手术刀）去除软组织。此类器械可能对骨骼造成损伤，这种损伤在微计算机断层扫描（µCT）中可被检测到，从而影响样本的保存状态和扫描数据质量。</li>
	<li>通过将骨块置于超声波清洗机中，用20份自来水与1份清洗液的混合溶液清洗5–10分钟，以清除髓腔内的碎屑或阻塞物（参见 材料表）或使用手持式冲牙器（例如 Waterpik）。</li>
	<li>将骨块浸入样本杯中，并加入70%乙醇。让骨块浸泡至少24小时，以去除脂质。 
	注意：二甲苯也可用于去除脂质。然而，由于二甲苯具有乳化作用，长时间浸泡可能使骨组织变脆或呈粉笔样。</li>
	<li>24小时后，将骨块从乙醇中取出，在室温下晾干24至48小时。 
	注意：此处可暂停本实验方案。</li>
</ol>
2. 组织切片
<ol>
	<li>将一块 75 × 25 mm 的玻璃载玻片置于设定为 140 °C 的加热板上。在载玻片中央熔化足量的热固性环氧树脂（参见材料表）。
	<ol>
		<li>若需制备额外的薄切片用于显微观察（&#60;50 µm），可能需要将骨块包埋于双组分环氧树脂中以保护骨小梁结构。此外，当本方案用于脆弱样本（如成岩性骨或高度小梁化的样本）时，必须将样本包埋在环氧树脂中。 
		注：本方案所用骨样本取自经防腐处理的尸体标本。若在尸检或外科手术中采集新鲜样本，用于通过同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT）观察软组织结构（如血管系统），则环氧树脂浸渍可能对这些组织造成损伤。在此类情况下，建议使用其他替代性粘合剂或固定介质（例如双面胶带、模型黏土）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将骨块的下表面压入载玻片上的热固性环氧树脂中，使骨的长轴方向与载玻片垂直。前后移动样本，使树脂充分覆盖骨块底面，并确保其牢固粘附于载玻片。</li>
	<li>将已固定的样本连同载玻片留在加热板上约 5 分钟，使热固性环氧树脂渗入骨的孔隙和/或裂隙中。 
	注：为获得最佳粘附效果，载玻片上的环氧树脂应无气泡。若存在气泡，可通过在载玻片上前后移动样本予以排除。气泡通常由骨内残留的水和/或乙醇受热逸出并蒸发所致。</li>
	<li>使用钝头镊子将带有固定样本的载玻片从加热板上取下，并在室温下冷却约 10 分钟。用刀片清除载玻片边缘的多余环氧树脂，以确保夹具能够牢固夹持载玻片。</li>
	<li>将带有粘附样本的载玻片安装至玻璃载玻片夹具上，并将夹具固定于低速切片锯的摆动臂上（参见材料表，图2）。 
	注：本方案中使用的是 Buehler IsoMet 切片锯，但也可采用其他精密切片锯替代（例如 Leco、Exakt、Smartcut、CT3、Buehler Petrothin、Well Diamond Wire）。</li>
	<li>通过调节定位旋钮调整摆动臂，确保刀片与样本接触并完成横切。调整样本位置，使骨的横截面垂直于其长轴方向进行切割。</li>
	<li>在切割臂远端添加配重，以平衡切割臂自身的重量。 
	注：若配重不足，样本可能对刀片施加过大压力，导致刀片断裂。</li>
	<li>向切片锯的液体储槽中加入切割液（水与切割液按 20:1 比例混合）。</li>
	<li>牢固安装金刚石薄片刀片，并确保液体液面浸没刀片的切割部分。将转速设为 200 RPM，然后缓慢将样本降至刀片上（图3）。</li>
	<li>确保刀片和夹具无晃动或跳动现象。若发现明显振动，应立即停止切片操作，重新紧固刀片和/或夹具臂组件后再继续切割。若夹具出现剧烈上下运动，应增加额外配重。明显的侧向移动可能导致刀片断裂。</li>
	<li>首个厚切片为“废切”，用于获得一个平整且与其他后续切面平行的起始表面。完成初始废切后，抬起摆动臂，并通过定位旋钮将夹具向刀片方向移动 5 mm。可采用此方法进一步收集用于显微观察的厚切片（约 1 mm）。 
	注：为节约珍贵组织，可省略废切步骤。然而，当样本边缘不平整时，必须确保样本最高点与取芯钻头边缘相切对齐。
	<ol>
		<li>切片时需考虑刀片的切缝宽度（kerf）。例如，若使用切缝宽度为 0.5 mm 的刀片获取 5 mm 的切片，应将样本和夹具向刀片方向移动 5.5 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成切片后，将带有固定样本的玻璃载玻片放回加热板上，加热使热固性环氧树脂熔化，从而快速将骨块从载玻片上取下。 
	注：本方案可在此处暂停。</li>
</ol>
3. 样品取芯
<ol>
	<li>使用步骤 2.2–2.4 中所述的热固性环氧树脂粘接技术，将 5 mm 的骨组织切片固定至浅铝皿底部（直径约 8 cm）。</li>
	<li>将铝皿放置于铣钻机的 XY 机械载物台上，并用手拧紧紧固夹具（见材料表）（图 4）。</li>
	<li>将内径为 2 mm 的空心轴宝石钻头（金刚石涂层取芯钻头）（见材料表）装入铣钻机的卡盘中。调整深度限位器，防止钻头穿透铝皿（图 5）。</li>
	<li>将骨样本的前中部中心对准钻头下方，避免与骨外膜、骨内膜或高度小梁化的区域发生近距离接触。 
	注意：由于皮质骨厚度在个体间存在差异，尤其是随年龄增长而变化，因此无法自动选择股骨前中部皮质骨区域。</li>
	<li>向铝皿中加入蒸馏水，完全浸没样本。此举可防止取芯过程中产生热量积聚、样本烧损和/或钻头损坏。 
	注意：为评估取芯过程中可能产生的热损伤，使用红外测温仪在钻头首次穿透骨表面时测量蒸馏水温度。在本实验所取的十个样本中，温度变化范围为 22.9 – 23.9 °C，波动幅度仅为 1 °C。因此，我们认为热损伤可忽略不计。</li>
	<li>在取芯钻头与骨组织初次接触的最初几次操作中，应施加轻柔压力，以便在骨组织上表面磨出一个环形定位槽。这可防止取芯初期钻头偏移，并确保钻头位置准确。</li>
	<li>取芯过程中，应周期性地将钻头上下提拉，同时保持钻头尖端始终位于水面以下。每隔数秒重复此操作，以冲洗出滞留的骨屑，确保钻头未被碎屑堵塞。 
	注意：若所取骨芯呈圆锥形，可能是由于 1）冲洗钻头内骨屑的时间不足，以及 2）取芯速度过快所致。过高的速度可能导致大块组织脱落或上部结构被粉碎。</li>
	<li>完成取芯后，所得骨芯可能卡在空心钻头内部（图 6）。可使用尖头镊子或小型内六角扳手将骨芯从钻头中取出（图 2）。</li>
	<li>将取芯后的样本存放在贴有标签的微量离心管中，置于阴凉干燥处，直至进行成像分析。</li>
</ol>
4. 用于评估皮质骨微结构参数的骨组织芯像处理流程
<ol>
	<li>µCT 图像重建
	<ol>
		<li>下载并安装最新版本的 NRecon 软件 https://www.bruker.com/products/microtomography.html 用于SRµCT投影图像的重建。</li>
		<li>选择 NRecon 桌面上的快捷方式及关联的 GPUReconServer 将出现。</li>
		<li>在弹出窗口中打开所需数据集。如果窗口未出现，请点击数据查看器窗口左上角的文件夹图标。</li>
		<li>选择SRµCT采集中的第一个投影。在 输出，取消选中选项 使用 ROI 和 量程开启.</li>
		<li>选择重建文件的保存位置。选择 浏览 并创建一个名为的新文件夹 重建所选文件格式应为 BMP(8)。</li>
		<li>检查 错位补偿. 
		注意：此估算值通常较为准确。可通过上下移动箭头手动调整粗略的3D渲染图像，以平移重叠的图像，使左右边缘尽可能对齐。</li>
		<li>下 设置，选择所需选项以应用 平滑处理, 射束硬化、CS旋转、物体大于视场及环形伪影校正算法.</li>
		<li>调整下方直方图 输出 通过选择 自动. 
		注意：最终图像可能较暗。</li>
		<li>选择 开始 开始处理重建。</li>
		<li>使用标准命名法表示管道/骨细胞陷窝指数28这些参数可能包括：总体积兴趣区组织体积（TV）、管状结构体积（Ca.V）、管状结构总数（Ca.N）、平均管径（Ca.Dm）、皮质孔隙率（Ca.V/TV，以百分比表示）、陷窝总数（N.Lc）以及平均陷窝体积（Lc.V）等。用于确定每平方毫米的陷窝密度3 （N.Lc/BV），骨体积（BV）计算公式为总体积减去管状间隙体积（TV-Ca.V）。 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从重建图像中收集微结构数据
	<ol>
		<li>下载并安装最新版本的 CTAnalyser 软件于 https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html 用于微结构参数的分析。 
		注意：CTAnalyser 的免费版本功能有限，因此建议购买完整许可证以进行更详细的分析。</li>
		<li>下方 图像 | 属性 | 更改像素大小确保像素大小与所采用的µCT成像方案一致。 
		注意：如果在 ImageJ 或类似程序中编辑图像，需注意保存时 TIFF 文件中嵌入的文件头信息将被修改，且分析软件在导入数据集时会改变像素尺寸。</li>
		<li>选择 定制化处理 以创建任务列表（参见 补充材料）以分析扫描数据集中的骨微结构。以下为使用CTAnalyser专有插件分析骨细胞陷窝网络参数的一般性操作流程： 
		注意：该插件任务列表适用于视野（FOV）中仅包含样品本身作为唯一观察对象的数据集。若样品周围存在空白区域，则必须应用感兴趣区域（ROI）。否则，三维分析和单个对象分析所获取的数值将被人为降低。
		<ol>
			<li>重新加载图像，以在打开分析软件中的自定义处理菜单之前，重置和/或调整任何修改（例如在 ImageJ 或类似软件中编辑所作的修改）。</li>
			<li>为降低图像噪声，在三维空间中应用圆形核、半径为2-3的高斯低通滤波器。 
			注意：这些参数设置是通过对已报道的SRµCT实验数据集进行反复试验后确定的，旨在为数据获得最佳质量的重建结果。应根据各自独特的实验条件调整重建参数设置。</li>
			<li>通过选择低值和高值应用全局灰度阈值到图像，以突出显示血管通道。所见的重建切片 图示 8B 和 8D 示例阈值为 0-155。 
			注意：与步骤 4.2.3.2 类似，此处应用的阈值设置是通过大量反复试验确定的。应针对每个实验设置和所使用的 µCT 成像系统调整阈值。</li>
			<li>去斑 （去噪）以去除三维空间中大小在骨细胞陷窝体素（voxel）尺寸范围内的白色斑点，从而仅分离出管道结构。 
			注意：对于以0.9 µm像素尺寸采集的人类皮质骨SRµCT扫描，骨细胞陷窝的下限为13个体素。</li>
			<li>去斑 去除二维空间中的任何黑色斑点，以消除管道中的伪影。这些伪影在二维图像中可能相当大，因此需去除此类特征 &#60;15,000 像素。</li>
			<li>在三维空间中使用以下方法扩张孔隙 形态学操作 使用半径为2或3的圆形核函数进行处理，具体半径取决于图像质量，以分离出滞留在管道中的软组织。</li>
			<li>执行一次额外的 去斑 使用与步骤 4.2.3.5 相同的设置进行功能操作，以清除管腔内的孤立软组织。</li>
			<li>使用一个侵蚀步骤来消除 4.2.3.6 步骤中的膨胀效果 形态学操作 使用半径为2或3的圆形核函数。此步骤的半径必须与程序4.2.3.6中使用的半径一致。</li>
			<li>运行 三维分析 并选择要计算血管通道体积的哪些参数。通常，基本值即可提供足够的信息。</li>
			<li>保存处理后的图像 保存位图 到目录中的自定义子文件夹。 
			注意：如果使用 Amira/Avizo、Dragonfly、Drishti 等程序对处理后的图像进行三维重建，建议将图像保存为单色（1 位）格式。</li>
			<li>使用以下方法计算血管通道的数量，并描述其大小、形状和方向 单个物体分析 功能。</li>
			<li>重复步骤 4.2.3.1 – 4.2.3.3，以重置图像用于骨细胞陷窝分析。</li>
			<li>使用以下方法去除三维空间中的白色斑点 去斑 功能，确保此类伪影小于骨陷窝尺寸的下限。此步骤可去除扫描中可能被误认为皮质孔隙的噪声，同时保留真实的骨细胞陷窝。对于像素尺寸为 0.9 µm 的人类同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT），该下限为 13 个体素。</li>
			<li>去斑 再次操作以去除大于腔隙尺寸上限的白色斑点。对于按照步骤4.2.3.13所列设置获取的人类SRµCT数据集，此上限为2743个体素。</li>
			<li>执行 三维分析 以专门提取与骨细胞陷窝相关的微结构信息。</li>
			<li>选择 保存位图 以保存处理后的图像，从而分离出骨细胞陷窝。</li>
			<li>执行 单个物体分析 用于计算在选定兴趣区域（VOI）内三维空间中的骨细胞数量。 
			注意：任务列表建立并测试完成后，可使用 CTAnalyser 中的批处理管理器（BatMan）功能来加速数据提取，并确保图像处理的一致性。Procedure 4.2.3 的示例设置任务列表可参见 补充材料.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+the+analysis+of+bone+microstructure%3A+New+dimensions+in+forensic+anthropology%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sciences+Research%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology.</a> Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前尚无获取均匀且呈圆柱形皮质骨核心样本的全面标准化方案，以用于视野受限的高分辨率同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT）成像。本文详述的方案填补了这一空白。&#160;通过提供关于如何获取尺寸一致的皮质骨芯样本用于同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT）成像，以及后续准确可视化和提取微结构数据的全面教程，弥补了这一空白。我们已证明，与以往描述的切割任意尺寸矩形骨块的方法相比，本方案为获取皮质骨芯样本提供了更为标准化且可靠的方法。因此，依赖手持式旋转工具（例如 Dremel）切除不规则尺寸骨块的研究人员，在成像过程中可能面临更长的样本准备时间，并在分析过程中出现更高的阈值设定误差和皮质孔隙提取误差。这一差异凸显了本标准化方案在骨样本制备、后续可视化与分析以及结果解读方面的重要性和必要性。
本方案还可供相关领域的研究人员进一步调整使用，例如常需评估骨组织的生物人类学家和考古学家。然而，在本研究所描述的实验流程中，并未对任何成岩作用相关的或具有考古学/历史价值的骨样本进行取芯。在地质学中，成岩作用（diagenesis）是指材料（如骨骼）沉积后发生的改变，可能包括由物理、化学或生物因素...

随着成像技术的最新进展，如今已能够以极高的分辨率获取X射线成像数据。由于其非破坏性特点，台式微计算机断层扫描（µCT）系统目前已成为成像松质骨的标准方法1。然而，在成像皮质骨的微结构特征时，µCT的应用则较为有限。由于分辨率的限制，台式系统无法达到成像小于皮质骨孔隙的微结构特征（如骨细胞陷窝）所需的分辨率。对于此类应用，同步辐射微计算机断层扫描（SRµCT）因其更高的分辨率而成为理想选择1。例如，在加拿大光源（CLS）的生物医学成像与治疗（BMIT）光束线上进行的实验2，已获得体素小至0.9 µm的图像。以往的研究1,3,4,5 利用该分辨率，对人类长骨皮质骨样本（图1）获取投影图像并重建三维（3D）图像，用于量化骨细胞陷窝密度4,6,7,8,9，以及分析陷窝形态和大小在人类生命周期中及两性之间的差异3。进一步的研究还揭示了人类骨单位带状结构的存在10，这一现象此前在法医人类学文献中仅被认为存在于非人类哺乳动物中。
为了实现优异的分辨率，X射线束必须在视场（FOV）内精确聚焦，这通常将最大样品尺寸限制在直径几毫米以内。目前，文献中尚未描述一套全面且标准化的骨样本采集流程，以满足这些限制条件。将样品置于视场中心至关重要，以确保：1）样品在成像过程中旋转180°时仍保持居中；2）减少扫描伪影，避免图像被截断。换句话说，样品中位于视场外的部分不会干扰进入视场内焦点的射线。若发生此类情况，重建算法将缺失部分必要的衰减数据，从而无法实现完全准确的重建。还需注意的是，360°（全旋转）扫描可最小化射线硬化效应，但会增加因对准偏差和成像过程中样品移动所导致的伪影。因此，尽管360°扫描通常能获得更清晰的数据，但成像时间会加倍，必须在实验成本与数据质量之间做出权衡。
骨成像实验中一个关键但常被忽视的方面是在扫描前进行准确且可重复的样本制备。许多研究在实验中引入同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT）方法时，仅简要提及取样方案，但对获取样本所用的具体方法学细节描述极少或完全未予说明。许多此类研究提到切割任意尺寸的矩形骨块，但通常未进一步说明所使用的工具或包埋材料3,4,10,11,12,13,14。一些研究人员通常使用手持式旋转工具（例如 Dremel）从感兴趣区域（ROI）切取矩形骨块3,4,10,11,12,13,14。该方法获得的样本尺寸不均，可能大于视场（FOV），从而增加扫描伪影和图像截断的可能性。此类样本通常需要进一步使用精密金刚石切片锯（例如 Buehler Isomet）进行修整。获取尺寸一致（精确至百分之一毫米）的样本对于确保所获得的数据集具有最高质量以及后续结果具有可重复性至关重要。
样本获取方法的报道有限，这在尝试应用和/或验证先前研究中所使用的方法时增加了额外的难度。目前，研究人员必须直接联系作者以获取有关其采样程序的更多细节。本文详细描述了一种经过充分记录、可重复且成本效益高的采样技术，为生物医学研究人员提供了便利。本文的主要目的是提供一份全面的操作指南，介绍如何使用铣钻机和金刚石取芯钻头获取尺寸一致的皮质骨芯样本，以准确地可视化和提取微结构数据。该方法改编自高压岩石力学领域中常规用于从硬质材料块体上采集均匀小直径（1–5 mm）圆柱体的操作流程15,16,17,18,19。

<table><tbody><tr><td>1-1/8&quot; 复合材料用硬质合金下切刀</td><td>Warrior</td><td>61812</td><td>28.6mm 下切深度</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP8201500</td><td>3.8 升</td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>ThermoFisher</td><td>55398</td><td></td></tr><tr><td>Crystalbond 509-3 环氧树脂</td><td>Ted Pella</td><td>821-3</td><td></td></tr><tr><td>CTAnalyser</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.15.4.0</td><td>在 https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html 下载并安装</td></tr><tr><td>牙科工具套装</td><td>Amazon</td><td>787269885110</td><td></td></tr><tr><td>复合材料用金刚石切片锯片</td><td>Buehler</td><td>#11-4247</td><td></td></tr><tr><td>台式钻床</td><td>Jet Mill/Drill</td><td>350017</td><td>型号：JMD-15，台式钻床可作为合适替代设备，但通常缺乏可移动的机床工作台以精确定位钻头下方的样品</td></tr><tr><td>细头镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>铣床/钻床用 XY 机床工作台夹具</td><td>MSC Industrial Supply</td><td>#04804571</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Ted Pella</td><td>26005</td><td>75×50 mm 载玻片，厚度 1 mm</td></tr><tr><td>玻璃载玻片卡盘</td><td>Buehler</td><td>#112488</td><td>尺寸需足以固定 75×50 mm 玻璃载玻片</td></tr><tr><td>可加热至 140 &amp;deg;C 的加热板</td><td>ThermoScientific</td><td>HP88850105</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>NAPCO</td><td>Model 4200</td><td></td></tr><tr><td>Isocut 切割液</td><td>Buehler</td><td>111193032</td><td>润滑剂；30 mL</td></tr><tr><td>珠宝商用金刚石空心钻头</td><td>Otto Frei</td><td>#119.050</td><td>内径 2 mm 的空心杆取芯钻头</td></tr><tr><td>NRecon</td><td>Bruker microCT</td><td>v.1.6.10.2</td><td>在 https://www.bruker.com/products/microtomography.html 下载并安装</td></tr><tr><td>往复锯</td><td>Harbor Freight</td><td>62866</td><td></td></tr><tr><td>耐高温玻璃器皿</td><td>Pyrex</td><td>1117715</td><td>玻璃食品储存容器</td></tr><tr><td>精密低速切割机（Isomet 1000）</td><td>Buehler</td><td>111280160</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Amazon</td><td>25181</td><td></td></tr><tr><td>浅铝制盘</td><td>Amazon</td><td>B01MRWLD0R</td><td>直径约 8 cm</td></tr><tr><td>样品杯</td><td>Amazon</td><td>616784425436 885334344729</td><td></td></tr><tr><td>Tergazyme 洗涤剂</td><td>Alconox</td><td>1304-1</td><td>1.8 kg 盒装</td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>MTI Corporation</td><td>KJ201508006</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量皮质骨样本制备与同步辐射显微ct分析的切片、取芯及图像处理指南

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

骨是一种动态且具有机械活性的组织，其结构会随着人类生命周期而发生变化。以往，骨重建过程的产物主要通过传统的二维技术进行研究。近年来，X射线成像技术的进步，特别是台式显微计算机断层扫描（µCT）和同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT），使得能够在比其他三维成像技术（例如SEM）更大的视场（FOV）范围内获取高分辨率的三维（3D）扫描图像，从而更全面地揭示人皮质骨内部的微观结构。然而，为减少可能影响数据分析的条纹伪影的出现，样本必须被精确地置于视场中心。先前的研究报道，获取的不规则矩形骨块常因边缘不均或图像截断而导致成像伪影。我们采用了一种地质采样方法（钻取法），从人股骨前侧获取尺寸一致的皮质骨芯样本，用于SRµCT实验。该钻取法高效且对组织损伤极小，可制备出均匀的圆柱形样品，因其在旋转过程中具有等距特性，并在整个扫描过程中为X射线束提供一致的路径长度，从而减少成像伪影。对钻取样品与不规则形状样品的X射线断层扫描数据进行图像处理后，证实该技术在改善皮质骨微结构可视化与分析方面的潜力。本方案的目标是提供一种可靠、可重复的皮质骨芯提取方法，适用于多种高分辨率骨成像实验。本研究的总体目标是建立一种经济、一致且简便的SRµCT用皮质骨样本标准化获取流程。该方法还可被相关领域的研究人员进一步调整应用，例如在生物人类学、地球科学或材料科学中常需评估硬质复合材料的研究领域。

所描述的钻芯取样方法被证明具有高度的有效性和效率。采用本方案进行钻芯取样，可成功获取 &gt;300 个尺寸一致的样品，用于 CLS BMIT-BM 光束线上的实验2，视野范围约为 2 mm 1.49 µm 体素大小。为验证核心直径的一致性，对部分人类股骨前侧核心样本沿其长度方向（上部、中部、底部）进行三次测量（n=69）。芯体的平均直径为1.96 ± 0.11 mm，沿芯体长度方向的平均变细程度为0.06 ± 0.06 mm/mm。为了突出该方法对其他硬质复合材料的适用性，我们尝试将该方法应用于白云岩样品n=32），平均直径为1.06 ± 0.02 mm。沿岩心样品长度方向的变细程度记录为0.01 ± 0.005 mm/mm。代表性图示比较了岩心样品与使用旋转工具（如Dremel）获取的样品的图像处理流程，具体如步骤4.2.3所述，可参见 图7使用普通旋转工具切割的样本相较于钻取样本，显示出更多的管道数量（Ca.N）和陷窝数量（Lc.N），以及更小的平均管道直径（Ca.Dm）、管道体积（Ca....

我们采用地质学（钻孔）取样方法，从人类股骨前侧获取用于同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT）实验的、尺寸均一的皮质骨样本。该方法具有破坏性小、效率高的特点，所获得的圆柱形样本可最大限度减少因样本形状不规则导致的成像伪影，从而改善骨微结构的可视化效果与分析质量。

高通量皮质骨样本制备与同步辐射显微CT分析的切片、取芯及图像处理指南

骨是一种动态且具有机械活性的组织，其结构会随着人类生命周期而发生变化。骨重建过程的产物已……

目前关于用于同步辐射显微计算机断层扫描的骨样本获取的相关数据仍较为匮乏。本综合教程提供了一种简单、微损伤且成本效益高的方法。获取具有统一尺寸和圆柱形形状的骨样本，对于确保所得数据集的高质量以及结果的适用性至关重要。本文所述技术适用于对岩石、化石或任何硬质材料进行钻孔。我们已利用这些技术采集了尺寸均一的岩石和单晶岩心，用于开展探索地壳和上地幔流变学特性的高压实验。初学者在对骨样进行钻孔时，可能会发现样品形成圆锥形结构。可以通过留出充足的时间让骨粉从钻头中充分排出，并降低取芯速度来解决这一问题。目前缺乏展示用于同步辐射显微计算机断层扫描及逻辑分析的骨样本采集过程的教学文本和视频。我们提供的分步骨组织制备教程有助于填补这一空白。将一块 75 × 25 毫米的玻璃载玻片置于加热板上，加热至最高 140 摄氏度，在载玻片中央熔化足量的热固性环氧树脂。将骨块的腹侧压入载玻片上的热固性环氧树脂中，使骨的长轴与载玻片垂直。前后移动样本，以涂覆骨块底面并确保牢固粘附。将已安装的样品置于加热板上约五分钟，使热固性环氧树脂渗入孔隙和裂纹中，同时确保载玻片上的环氧树脂无气泡。若存在气泡，可前后移动样品以去除。使用钝头镊子将带有样品的载玻片从加热板上取下，在室温下冷却约10分钟，然后用刀片清除载玻片边缘的环氧树脂，以确保样品台能够牢固夹持载玻片。将带有附着样本的切片固定到玻璃载片夹具上，并将夹具安装到低速切片锯的摆动臂上，调整位置，使骨组织的横截面能够垂直于其长轴被切割。调节摆动臂，确保刀片与样本接触并完全穿过样本。在切割臂的远端添加配重，以平衡臂本身的重量，并向液体储槽中加入蒸馏水和切割液。牢固固定金刚石晶圆刀片，并确保液位浸没刀片的切割部分。将转速设为 200 RPM，缓慢将样品 lowered 放置到刀片上。一旦锯切开始，需确保刀片和卡盘无晃动或跳动现象。如果出现上述情况，请立即停止电锯并拧紧锯片或夹头臂组件。如果夹头剧烈上下移动，请增加更多配重。第一个厚段为废料切割，可提供一个与后续每次切割均平行的明确定义的表面。完成初步废料切割后，抬起旋转臂，使用定位旋钮将卡盘向刀片方向移动五毫米。切片完成后，将带有已安装样品的载玻片置于加热板上，以熔化热固性环氧树脂。使用先前所述的热固性环氧树脂粘接技术，将五毫米骨组织切片固定至浅铝皿底部。将锡罐放置在铣钻机的XY工作台上，并用手拧紧固定夹具。将内径为2毫米的空心轴珠宝钻头（带金刚石钻头）插入铣钻机的夹头中，并调整深度限位器，以防止钻透锡罐。调整骨样本前部中央位置至钻头正下方，同时避免与骨膜、开口处或高度小梁化的区域发生近距离接触。将蒸馏水注入锡罐中，直至完全浸没样品，以防止在取芯过程中产生过多热量、样品烧焦以及钻头损坏。使用铣床钻机时若不采取适当的安全措施，可能存在危险。操作人员应确保佩戴护目镜，固定好宽松的衣物，并将长发向后扎起，以防被主轴缠住。在钻头与骨骼初次接触的前几次操作中，应施加轻柔的压力，以便在骨骼上表面磨出一个环形凹槽。这可以防止取芯过程开始时钻头发生偏移，并确保钻头的准确定位。在取芯过程中，需将钻头在样本中反复提拉，同时保持钻头尖端始终位于水面以下。每隔几秒执行一次此操作，以冲洗出残留的骨粉，并确保碎屑不会堵塞钻头。取芯完成后，所获得的骨组织可能卡在中空柄钻头内部。使用尖头镊子或小型六角扳手将骨芯从钻头中取出。将钻取的样品存放在贴有标签的微量离心管中，置于阴凉干燥处，直至成像。所述的钻取取样方法被证明具有高度的有效性和效率。此处展示了使用钻取法获取的样品与使用旋转工具获取的样品在图像处理流程上的代表性对比图。使用普通旋转工具切割的样本与钻取样本相比，显示出更多的管道和陷窝数量，但平均管道直径、管道体积和皮质孔隙率均有所降低。本表格展示了每个样本的孔隙率数据。尽管钻取方案减少了同步辐射显微计算机断层扫描中观察到的伪影，但来自直线骨块实验的低质量且含有较多伪影的图像反映了一个多方面的复杂问题。后续的图像处理证实了该技术在改善皮质骨微观结构可视化方面的潜力。例如，可观察到矿化差异、骨单位边界的更清晰界定，以及血管通道内软组织的一致性可视化。操作过程中保持缓慢推进是获得尺寸一致的圆柱形样本的关键。过快操作可能导致样本呈圆锥形而非圆柱形。在获取用于取芯的厚切片时，可同时收集额外的厚切片用于明场或共聚焦显微镜观察，以实现对小管网络的可视化。

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生物学

同步加速器微CT高通量皮质骨样品采购和分析的剖面、科林和图像处理指南

只有通过断层扫描技术才能实现无损的体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（CT）。...

Ex-Vivo 生物样本的显微CT高分辨率三维成像

高分辨率X射线计算机断层扫描（HRCT）是一种非破坏性诊断成像技术，可用于三维研究植物维管系统结构与功能。我们展示了HRCT如何促进对多种植物组织和物种中木质部网络的探索。...

利用高分辨率计算机断层扫描技术可视化植物维管系统的三维结构与功能

在本论文中，我们介绍了一种高通量、半自动化的冷冻组织学平台，该平台能够对矿化组织冷冻切片进行多轮荧光成像，并生成多种反应指标的配准复合图像。...

矿化组织的高通量多图像冷冻组织学

本文介绍了一种利用专为X射线计算机断层扫描设计的X射线特异性染色方法，对微观组织结构进行三维可视化的实验方案。...

利用X射线特异性染色法与纳米级计算机断层扫描对软组织样本进行三维成像

本文介绍了一种用于引导冷冻电子断层成像样品制备的三维关联聚焦离子束切削技术流程。首先通过冷冻荧光显微镜确定荧光标记的目标蛋白的三维位置，随后对该位置进行聚焦离子束切削。该方案适用于哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞。...

用于高分辨率冷冻电子断层扫描的三维关联聚焦离子束切片样品制备

微型计算机断层扫描（µCT）是一种非破坏性成像工具，在临床前研究中对评估骨结构具有重要作用，然而目前在分析骨愈合骨痂的µCT操作流程方面尚缺乏统一共识。本研究提供了一套逐步实施的µCT实验方案，可用于监测骨折愈合过程。...

利用微型计算机断层扫描评估骨骨折愈合

本研究介绍了通过结合微型计算机断层扫描（micro-CT）与对比剂获取新生小鼠脑部高分辨率图像的步骤 离体...

小鼠新生脑组织的显微CT成像与形态计量学分析

我们提出一种用于分析纵向研究中用户自定义感兴趣区域（ROI）的方法 体内...

针对大段骨缺损中用户自定义感兴趣区域的纵向显微计算机断层成像分析

我们提出了一种在多个层次水平上评估骨再生的实验方案。该多模态方法能够实现跨不同长度尺度的结构分析，有效解决了样本制备中的挑战，并为评价生物材料促进骨再生的效果提供了可靠的分析流程。...

评估骨再生与支架性能的多模态方法

这是一种用于斑马鱼的高通量精子冷冻保存方案。采用该方案冷冻保存的精子在后续体外受精中平均具有25%的受精率，并可在多年内保持稳定。...

一种高通量的斑马鱼精子冷冻保存方法 体外 受精

学习使用地质钻取技术从人体股骨获取皮质骨样本，用于同步加速器微CT成像。该方法可减少伪影，提高骨微结构和矿化差异的可视化质量，为骨生物学研究提供可靠的样品制备方案。

高通量皮质骨样本制备与同步辐射显微CT分析的切片、取芯及图像处理指南

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