Name: 一种研究炎症期间白细胞-内皮细胞相互作用的微生理系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学习使用仿生微流控芯片技术实时观察中性粒细胞与内皮细胞的粘附及迁移行为。该方法利用原代人细胞模拟生理微血管环境，为炎症性疾病机制研究和药物筛选提供可靠平台。

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本工作由美国国立卫生研究院资助，资助编号：GM114359 和 GM134701（M.F.K. 和 L.E.K.），1F31AI164870-01（J.C.L.），以及国防威胁降低局，资助编号：HDTRA11910012（M.F.K. 和 L.E.K.）。

根据坦普尔大学机构审查委员会（美国宾夕法尼亚州费城）批准的知情同意书，从健康的成年献血者（男性和女性，年龄在21至60岁之间）获取肝素抗凝人血，用于中性粒细胞分离。
1. 使用人纤维连接蛋白对装置进行预处理和包被
注意：脑微流控装置（bMFA）有两个连接至血管腔室的入口端口和两个出口端口。此外，它还有一个连接至组织腔室的端口（图2）。
<ol>
	<li>插入外径为0.06的管路&#34; 内径为0.02&#34;) (材料表s) 除一个进样口外，使用尖头镊子将所有端口密封。用鳄嘴夹夹紧两个出样口和组织舱端口。确保每段管路长度约为1英寸。</li>
	<li>将人纤维连接蛋白原液（1 mg/mL）用 PBS 稀释至 100 µg/mL。取 1 mL 注射器，吸入配制好的纤维连接蛋白溶液。将注射器连接至 24 G 钝头针和一段长约 4 英寸的导管。 
	注意：为防止交联，切勿过度混匀或吹打人纤维连接蛋白。对于不同类型的细胞，可使用其他细胞外基质（ECM），如胶原蛋白。</li>
	<li>将导管插入开放的入口端口，推动推杆，直至人纤维连接蛋白从另一个入口端口流出，然后夹闭该端口。对剩余的各个端口重复此操作，直至所有通道、组织腔室及导管均充满人纤维连接蛋白溶液。移除针头，但保留插入的4英寸长导管，并保持未夹闭状态。 
	注意：在夹闭管道之前，务必确保管道内已充满纤连蛋白。</li>
	<li>用于脱气时，将未夹紧的管路连接至&#160;通过气动引燃器连接压缩氮气罐，将压力调节至约5 psi，运行约15分钟。</li>
	<li>15 分钟后，在显微镜下检查，确保装置内无气泡残留。若通道或组织舱室内存在气泡，需将装置重新连接至气动引液仪再次脱气，即重复步骤 1.4。 
	注意：本实验方案中所有涉及显微镜观察的步骤均使用倒置显微镜。</li>
	<li>从气动引物中取出装置，在37 °C下孵育1小时，然后用预热的HLMVEC培养基冲洗所有通道和组织腔室材料表），与步骤1.3类似。原代小鼠成纤维细胞（bMFA）现可用于细胞接种。 
	&#8203;注意：在从端口拔出或插入管路前，应先用移液器在进样口管路基部滴加一滴水，以防止空气进入装置。</li>
</ol>
2. 使用人肺微血管内皮细胞接种bMFA
<ol>
	<li>根据供应商提供的方案，在T-25培养瓶中将人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）培养至60%–80%融合度。</li>
	<li>吸除细胞培养瓶中的HLMVEC培养基，用PBS洗涤两次。</li>
	<li>向T-25培养瓶中加入2 mL预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（37 °C），在培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育3–5分钟，直至大多数细胞从瓶壁脱落。 
	注意：不同细胞类型及胰蛋白酶-EDTA浓度可能导致孵育时间有所差异。</li>
	<li>向培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶中和液（TNS，37 °C），以中和胰蛋白酶-EDTA。</li>
	<li>轻轻敲击培养瓶以促进细胞完全解离，随后将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。</li>
	<li>在150 × g 条件下离心5分钟，使内皮细胞沉淀；弃去上清液，将细胞重悬于3 mL新鲜培养基中，并使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。</li>
	<li>再次在150 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬至所需接种密度（20 × 106/mL）。 
	注意：根据细胞类型和融合度的不同，通常可从两个T-25培养瓶中收集约2 × 106个内皮细胞；以20 × 106/mL的接种密度计算，100 µL细胞悬液（含2 × 106个内皮细胞）足以接种5个装置。</li>
	<li>将1 mL注射器安装至可编程注射泵上，并将导管连接至钝头针。</li>
	<li>吸取约20 µL细胞悬液进入导管，确保细胞悬液仅存在于导管内，而不进入注射器筒身。</li>
	<li>取下装置出口端的夹子，将导管连接至装置的一个入口；注意避免将气泡引入微通道中。</li>
	<li>启动泵，设定流速为4–8 µL/min，并在显微镜下观察装置内细胞流动情况。</li>
	<li>当微通道完全充满细胞后，停止泵运行，夹闭出口端，并剪断入口导管。 
	注意：操作过程中应小心，避免向装置内引入气泡。</li>
	<li>将装置置于培养箱中，在5% CO2、37 °C条件下孵育4小时。</li>
	<li>孵育4小时后，准备另一支装有新鲜细胞培养基的注射器，将其安装在注射泵上，连接至装置的进样口&#160;，并取下出口端的夹子。</li>
	<li>以4–8 µL/min的流速将新鲜培养基注入装置，持续约5分钟，以冲洗未贴壁或漂浮的细胞。</li>
</ol>
3. 流动条件下细胞培养 48 小时
<ol>
	<li>准备一支装有新鲜细胞培养基的注射器。将注射器安装到注射泵上，连接注射器至一个进样口&#160;，并保持出样口开放。将装置放入培养箱中（5% CO2，37 °C）。</li>
	<li>根据表1中所述的说明，设置注射泵程序，以在流动条件下培养内皮细胞。</li>
	<li>在流动条件下培养48小时后，在显微镜下检查bMFA。人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）应覆盖血管通道，形成完整的管腔（图6）。 
	注意：不同细胞类型可能需要不同的流动条件。</li>
</ol>
4. 细胞因子和/或治疗处理
注意：本节以使用bMFA研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一种新型抗炎抑制剂（蛋白激酶C delta-TAT肽抑制剂，PKCδ-i）处理细胞的影响为例18,27,32,33,34,35,36。
<ol>
	<li>使用上述方案（第1-3节）制备三个不同的bMFA装置。</li>
	<li>将三支1 mL注射器分别装入细胞培养基、&#160;(TNF-α) (10 ng/mL)、TNF-α (10 ng/mL) + PKCδ抑制剂 (5 µM)。 
	注意：细胞因子需用细胞培养基重新配制。</li>
	<li>将三支注射器分别连接至三个bMFA装置。以0.1 µL/min的流速，用缓冲液、TNF-α或TNF-α加抑制剂处理HLMVEC细胞，持续4小时。 
	&#8203;注意：根据具体研究需求，可使用其他细胞因子或细胞因子组合（例如TNF-α + 白细胞介素1β (IL1-β) + 干扰素-γ (IFN-γ)）处理内皮细胞。</li>
</ol>
5. 人中性粒细胞的分离
<ol>
	<li>所有试剂均在室温（RT）下使用。试剂包括白细胞分离介质、含 Ca2+/Mg2+ 的 1× HEPES 缓冲液（表 2）、6% 右旋糖酐生理盐水（0.9% NaCl）、3.6% NaCl 溶液以及去离子水（DI 水）。</li>
	<li>将 20 mL 白细胞分离介质移入 50 mL 锥形管中，小心地将 25 mL 血液叠加在白细胞分离介质上方。在室温下以 427 × g 离心 40 分钟。 
	注意：此步骤应缓慢且小心操作，避免血液与白细胞分离介质混合。</li>
	<li>吸除上清液，保留红细胞（RBC）层上方约 5 mL 液体。位于 RBC 层上方的白色絮状层主要为中性粒细胞。</li>
	<li>加入 HEPES 缓冲液，使总体积加倍（现有体积 : HEPES 缓冲液 = 1 : 1）。</li>
	<li>加入 6% 右旋糖酐，其体积为最终总体积的 20%（即：当前体积 / 4 = 所需加入的 6% 右旋糖酐体积）。</li>
	<li>轻轻倒置混匀数次，充分混合后静置使红细胞沉降（约 25 分钟）。</li>
	<li>小心吸取上层富含中性粒细胞的液体，转移至新的 50 mL 管中，注意避免混入已沉降的红细胞。</li>
	<li>在室温下以 315 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 8 mL HEPES 缓冲液中。</li>
	<li>为裂解残留的红细胞，加入 24 mL 去离子水，轻轻混匀 50 秒。立即加入 8 mL 3.6% NaCl 溶液，混匀后在室温下以 315 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 15 mL HEPES 缓冲液洗涤细胞沉淀，并以 315 × g 离心 5 分钟。将沉淀重悬于 HEPES 缓冲液中。</li>
</ol>
6. 使用 bMFA 进行中性粒细胞黏附和迁移实验
<ol>
	<li>将分离的人中性粒细胞（1500万）重悬于999 µL HEPES缓冲液中。</li>
	<li>向中性粒细胞悬液中加入1 µL CFDA-SE（羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯）染料储备液（10 mM），使CFDA-SE工作浓度达到10 µM，室温孵育10分钟。以315 × g 离心5分钟，用HEPES缓冲液洗涤细胞两次。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数中性粒细胞，并分别以200万中性粒细胞/mL的密度重悬于细胞培养基中，分别加入TNF-α（10 ng/mL）以及TNF-α（10 ng/mL）+ PKCδ-i（5 μM）；实验开始前室温孵育15分钟。</li>
	<li>准备一支注射器，内含1 µM N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）——本研究的趋化因子，溶于细胞培养基中。取bMFA装置，打开一个入口端口和一个出口端口。 
	注意：这些实验条件用于模拟脓毒症状态，即存在全身性炎症反应并伴有高水平循环细胞因子/趋化因子的情况。此外，fMLP是一种来源于革兰氏阴性菌的肽，用于模拟细菌在肺组织（即组织腔室）中的存在。</li>
	<li>移除组织腔室端口的管路，插入含fMLP的管路。除仅用细胞培养基处理的bMFA外，向所有bMFA的组织腔室注入约20 µL fMLP。然后切断管路并用夹子夹闭。</li>
	<li>用约200 µL中性粒细胞悬液填充注射器，并将注射器安装到注射泵上。</li>
	<li>将装置置于倒置显微镜载物台上（材料表）。</li>
	<li>启动泵，设定流速为1 µL/min，等待中性粒细胞悬液从管路末端形成一小滴。将管路插入入口端口。装置设置详见图7。</li>
</ol>
7. 采集图像
<ol>
	<li>在显微镜图像分析软件（材料表）中使用“扫描大图像”功能，在实验开始后10分钟获取bMFA中的黏附图谱（图8）。大多数中性粒细胞在前10分钟内进入bMFA。 
	注意：在不拍摄图像时关闭荧光光源，以减少光漂白。</li>
	<li>在接下来的一小时内，每隔5分钟拍摄一次组织腔室的延时图像（每5分钟1张图像）（图8B、C），用于迁移分析，以获得迁移图谱。</li>
</ol>
8. 数字图像分析
<ol>
	<li>对于黏附图谱，计数每条血管中黏附的中性粒细胞数量。针对每个分叉处，创建一个直径等于血管直径两倍的圆形感兴趣区域（ROI），并计数该区域内黏附的中性粒细胞数量。</li>
	<li>使用手动计数或自动的目标计数功能，定量每条血管及每个分叉区域中黏附的中性粒细胞数量。</li>
	<li>利用基于CFD模拟生成的网络剪切率图谱17，确定每条血管中的剪切率。随后将特定血管中黏附的中性粒细胞数量与该血管的剪切率进行对应作图，从而建立bMFA中的剪切率图谱，如图9A所示。</li>
	<li>若中性粒细胞已穿过内皮进入组织腔室，则计为已迁移细胞。分别在10分钟、15分钟、30分钟和60分钟时计数迁移的中性粒细胞数量。绘制迁移中性粒细胞数量随时间变化的曲线，如图9B所示。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

bMFA 重现了地形特征和流动条件 体内 微血管网络，可用于研究白细胞与内皮细胞的相互作用以及内皮功能 体外 在生理条件接近真实的情况下，小鼠或人类微血管系统的微血管网络结构具有自相似性和分形特征，且雷诺数 << 1，表明血管几何结构对流动模式无显著影响。因此，bFMA可用于研究不同物种（包括人类）的白细胞-内皮细胞相互作用，尽管bMFA的制造基于小鼠 cremaster 肌肉微血管结构的映射。
脑膜迁移分析（bMFA）能够在单次实验中实时评估中性粒细胞迁移级联的各个步骤，包括滚动、牢固黏附、铺展&#160;以及中性粒细胞向组织腔室的迁移。该方法可使用原代人源细胞和具有临床相关性的样本，以提高研究结果的可转化性，并快速筛选潜在治疗药物。与传统的流体系统（如平行板流动腔）相比，bMFA因其微小的管道尺寸以及可在单次实验中研究完整的中性粒细胞迁移级联过程，试剂用量减少了95%以上37。然而，这种微小尺寸也要求操作者处理极小体积的试剂，操作难度较高，需要大量实践经验。本实验方案最常见的问题是bMFA中出现...

炎症是机体对感染和损伤的宿主反应，其中内皮细胞在炎症反应中发挥重要作用1,2,3。炎症调控失常是多种疾病病理过程的根本原因，例如脓毒症、心血管疾病、哮喘、炎症性肠病、癌症&#160;以及 COVID-19。白细胞与内皮细胞的相互作用在这些炎症性疾病中起核心作用。在炎症过程中，病原体释放的 PAMPs（病原体相关分子模式）或受损组织释放的 DAMPs（损伤相关分子模式）会激活免疫细胞，促使其释放细胞因子/趋化因子及其他促炎介质，从而导致内皮细胞活化，引起血管内皮屏障功能改变和通透性增加3,4。炎症期间内皮细胞的活化增强，导致白细胞与内皮细胞的相互作用加剧，促使活化的白细胞大量迁移穿过血管内皮进入关键器官1,5,6,7。
白细胞的募集由化学性质多样的趋化因子启动，这些趋化因子包括生物活性脂质、细胞因子、趋化因子&#160;以及补体成分8,9。白细胞募集是一个多步骤过程，包含五个独立阶段：1）白细胞边缘化及捕获/黏附，2）滚动，3）牢固黏附，4）铺展与爬行，以及5）渗出/迁移（图1）。该过程的每一步均需要白细胞与内皮细胞之间的相互通讯，以协调这一动态现象1,9。最终，停滞的白细胞通过一个由趋化因子依赖性信号、黏附事件和血流动力学剪切力共同调控的多步骤过程，穿越内皮层进入炎症组织1,9,10,11,12。
鉴于剪切应力在调控内皮细胞功能中的核心作用以及白细胞与内皮细胞相互作用的重要性13，多个 体外 在过去的几十年中，为了在更可控的环境中研究白细胞迁移级联反应的各个方面，已开发出多种模型14研究白细胞与内皮细胞相互作用的传统流体装置可分为两大类14：a）用于研究白细胞滚动、黏附的装置&#160;以及在剪切力条件下研究黏附分子及其配体在黏附级联反应中作用的平行板流动腔室等装置；b）用于在静态条件下研究白细胞迁移的装置，如Transwell小室。平行板流动腔室等系统已被用于研究黏附分子及其配体在剪切力作用下黏附级联中的功能15然而，一个显著的缺点是，这些简化的理想化装置（例如，直通道）无法重现实际的尺度和几何结构 体内 微血管系统（例如，连续的血管分支、血管形态）&#160;以及由此产生的流动条件（例如，分叉处的汇聚或发散流动）。因此，这些装置&#160;只能模拟黏附而不能模拟跨膜迁移。Transwell 小室只能在&#160;静态条件，未考虑 体内 几何特征和流动条件。因此，这些传统模型无法模拟活体组织的微环境，也无法在单次实验中解析黏附和迁移级联过程6.
为解决这一局限性，我们开发并广泛验证了一种新型三维仿生微流控检测方法（bMFA）（图2），该方法可在芯片上真实再现体内微血管网络16,17,18。该装置的微加工方案此前已有发表17&#160;，此处仅作简要描述。采用改进的地理信息系统（GIS）方法对小鼠提睾肌的微血管系统进行数字化19。随后，基于数字化的微血管网络，利用软光刻技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）上构建合成微血管网络14,17,20,21,22。简而言之，将数字化网络图像打印至聚酯薄膜（Mylar film）上，用作掩模，在硅晶圆表面的SU-8正性光刻胶上进行图案化，以制备器件的母模。通过微加工形成的微柱（直径10 µm，高3 µm）用于构建高3 µm、宽100 µm的孔道，该尺寸为白细胞迁移的最佳孔径23,24,25，用于连接血管通道与组织腔室。按照制造商说明配制PDMS，并浇注于制备好的母模上。随后对PDMS进行脱气处理，并在烘箱中（65 °C）过夜固化，以在PDMS中形成互补的微通道。固化后，将PDMS从SU-8母模上剥离，并打孔作为进样口和出样口。然后，通过等离子体处理将PDMS键合至玻璃载片上。微流控装置的表面由天然玻璃和PDMS组成。为促进细胞的黏附、铺展&#160;和增殖，需进行细胞外基质（ECM）包被。bMFA包含一个微血管网络和一个通过高3 µm、宽100 µm的孔道相连的组织腔室（图2）。该微流控系统可在生理相关的三维环境中，于一个完整的、包含相互连接血管和分叉结构的微血管网络中，再现白细胞黏附/迁移的全过程，包括在单一系统中实现白细胞的循环、边缘化、滚动、黏附&#160;以及向血管外组织腔室的迁移14,16,17,21,26。
需要注意的是，即使bMFA入口处的流速保持恒定，网络内不同位置的流动条件仍会有所变化，且无法通过简单的数学公式进行计算。为此建立了一个基于计算流体动力学（CFD）的模型，用于计算网络中不同位置的多种流动参数（如剪切应力、剪切速率、流速等）。该CFD模型被用于模拟bMFA中的染料灌注模式及流动参数。与实验结果的交叉验证表明，该计算模型能够准确预测网络中的流动阻力。图3)17. 该CFD模型随后被用于估算bMFA中每条血管内的速度和剪切率分布图4），从而可分析剪切流和几何结构对白细胞滚动、黏附和迁移的影响16白细胞优先黏附于分叉处及低剪切力区域 体内，这些白细胞黏附的空间模式已在bMFA中利用中性粒细胞成功展示（图5)16本文描述了利用人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）和人中性粒细胞在炎症条件下研究白细胞-内皮细胞相互作用的脑膜类器官微流控装置（bMFA）制备方案。微生理系统（如bMFA）可用于研究内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等不同细胞类型之间的相互作用。&#160;和肿瘤细胞18,27,28,29,30可将来自不同器官（如肺与脑）和不同物种（如人与小鼠内皮细胞）的原代内皮细胞以及内皮细胞系接种至bMFA中21,27,31,32可利用bMFA研究多种细胞反应、细胞间相互作用、屏障功能及药物递送&#160;和药物毒性。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>仿生微流控检测（bMFA）</td><td>SynVivo</td><td>SMN1-C001</td><td>仅在 SynVivo 提供</td></tr><tr><td>钝头针</td><td>Jensen Global</td><td>JG24-0.5</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>ThermoFisher</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖，250,000，粉末</td><td>Spectrum Chemical Mfg. Corp</td><td>DE-130</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Health Care</td><td>17-5442-02</td><td>白细胞分离介质</td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1692630</td><td></td></tr><tr><td>人纤维连接蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>33-016-015</td><td>针对不同细胞系使用厂商推荐的细胞外基质</td></tr><tr><td>微血管内皮细胞生长培养基-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>cc-3202</td><td>人肺微血管内皮细胞培养基（HLMVEC）</td></tr><tr><td>人肺微血管内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>cc-2527</td><td>使用厂商推荐的胰蛋白酶-EDTA 和 TNS</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>NIS-elements, 5.20.01</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>PhD Ultra 注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3007</td><td>注射泵</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-763</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TNF-α</td><td>R&amp;D Systems</td><td>210-TA</td><td></td></tr><tr><td>载玻片夹具</td><td>SynVivo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>SynVivo 气动引注仪</td><td>SynVivo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA，胰蛋白酶中和液（TNS）</td><td>Lonza</td><td>cc-5034</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管路</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>管路</td></tr></tbody></table>

一种用于研究炎症过程中白细胞与内皮细胞相互作用的微生理系统

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

白细胞-内皮细胞相互作用在脓毒症等炎症性疾病中起着重要作用。在炎症过程中，活化的白细胞过度迁移穿过血管内皮进入关键器官，可能导致器官功能衰竭。已开发并验证了一种具有生理相关性的仿生微流控检测方法（bMFA），该方法结合多种实验与计算技术，能够重现白细胞滚动、黏附及迁移的全过程，用于研究白细胞与内皮细胞之间的相互作用。微血管网络来源于 体内 使用地理信息系统（GIS）方法对啮齿类动物的图像进行数字化处理，并在载玻片上利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行微加工制备。为研究剪切速率和血管拓扑结构对白细胞-内皮细胞相互作用的影响，建立了计算流体动力学（CFD）模型，以生成网络内剪切速率和流速的相应分布图。脑微血管网络分析（bMFA）可实现对白细胞-内皮细胞相互作用的定量分析，包括滚动速度、在不同剪切速率下黏附的白细胞数量、迁移的白细胞数量、内皮细胞通透性、黏附分子表达及其他重要变量。此外，通过使用人类相关样本（如人源内皮细胞和白细胞），bMFA为潜在治疗药物的快速筛选提供了工具，从而提高其临床可转化性。

在 bMFA 中经剪切流培养 48 小时后，内皮细胞覆盖了血管通道的表面，并沿流动方向排列（图 6）。共聚焦显微镜结果显示，血管通道的所有表面均被内皮细胞覆盖，在 bMFA 中形成了完整的三维管腔18。
利用本方案，可获得中性粒细胞黏附图谱，显示在脑微血管内皮细胞（bMFA）中，中性粒细胞对内皮细胞具有显著的黏附性（图8）。将该黏附图谱中中性粒细胞的空间分布与CFD模型生成的剪切速率图进行关联分析，表明中性粒细胞的黏附依赖于剪切力，且中性粒细胞优先黏附于低剪切速率区域和分叉区域（图9A）。在TNF-α激活的内皮细胞上，中性粒细胞的黏附显著增加。对延时成像结果的分析表明，TNF-α激活内皮细胞可增强中性粒细胞对趋化因子fMLP的迁移反应（图9B）。如上所述，bMFA可用于快速评估新型治疗药物在炎症性疾...

在本方案中，采用了一种仿生微流控检测方法，该方法能够重现生理相关的微血管环境，并完整再现白细胞黏附/迁移级联过程，用于研究炎症疾病中的白细胞-内皮细胞相互作用。

白细胞与内皮细胞的相互作用在脓毒症等炎症性疾病中具有重要作用。在炎症过程中，过量的白细胞迁移……

白细胞与内皮细胞的相互作用在脓毒症等炎症性疾病中起着重要作用。炎症调控失常常导致血管内皮屏障功能改变以及白细胞过度迁移，进而引发器官损伤。这种仿生微流控检测技术（我们称之为bMFA）可模拟体内微血管网络的拓扑结构和流动条件，实现实时评估中性粒细胞的滚动、牢固黏附、铺展以及向组织腔室迁移的过程。生物模拟微流控检测的一个优势在于能够使用原代人源细胞和具有临床相关性的患者样本，从而提高临床转化能力，并快速筛选潜在的治疗药物。本次实验操作将由我实验室的研究生研究助理杨 Qingliang 先生进行演示。使用精细镊子将约一英寸长的导管插入各端口内，其中一个进口端口除外。使用颌式夹具将两个出口端口和组织舱室夹紧在一起。用 PBS 将纤连蛋白储备液稀释至 100 微克/毫升。取 1 毫升注射器，连接 24 号钝头针，吸入稀释后的纤连蛋白溶液，并将该注射器连接到一段 4 英寸长的导管上。将管路插入开放的进样口，推动活塞直至人纤维连接蛋白从另一个进样口流出，随即夹闭该管路。对剩余的各个进样口重复此操作，直至所有通道、组织腔室及管路均充满人纤维连接蛋白溶液。移除针头，但保留四英寸长的管路插入状态且不夹闭。进行脱气时，将未夹紧的管路连接至与压缩氮气罐相连的气动引液装置，氮气压力为每平方英寸五磅，持续15分钟。在显微镜下检查通道或组织腔室内是否残留气泡，若发现气泡，则需重新连接装置。将装置从气动引液装置上取下，并在37摄氏度条件下孵育一小时。使用预热的人肺微血管内皮细胞培养基，冲洗所有通道和组织腔室。按照文本稿件中所述收获内皮细胞后，以150 × g离心5分钟，使细胞沉淀。在可编程注射泵上安装一支1毫升注射器，并将管路连接至平头针。将约20微升细胞悬液吸入管路中，注意不要让液体进入注射器筒内。从装置的出口端取下夹子。将管路连接到入口端，确保无气泡进入通道。以每分钟四至八微升的流速停止泵运行，并在显微镜下观察。当通道充满细胞后停止泵送。夹闭出口并剪断进口管路。将装置置于含5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱中孵育四小时。孵育4小时后，准备另一支注射器，并用新鲜的细胞培养基填充。将注射器安装到注射泵上，并连接至入口端口。移除出口端口上的夹子。以每分钟四到八微升的速度将新鲜培养基通过装置约五分钟，以去除悬浮或未贴壁的细胞。用新鲜的细胞培养基填充注射器，准备好后将其安装在注射泵上，并连接至一个进样口，同时保持出样口开放。将装置置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中。按照文本手稿中的描述，设置注射泵以在流动条件下培养内皮细胞。在流动条件下培养 48 小时后，使用显微镜检查 bMFA。共聚焦显微镜显示，血管通道的所有表面均被内皮细胞覆盖，在bMFA中形成了完整的三维管腔。制备三个不同的bMFA装置后，分别用细胞培养基、TNF-α或TNF-α联合PKC delta抑制剂装填三支1毫升注射器，其中TNF-α作为一种炎性细胞因子用于刺激内皮细胞和中性粒细胞，PKC delta抑制剂是一种新型抗炎抑制剂。将三个已装液的注射器连接至三个bMFA装置。使用缓冲液TNF-alpha或添加了抑制剂的TNF-alpha，以每分钟0.1微升的流速处理人肺微血管内皮细胞4小时。按照文本稿件中的描述分离人中性粒细胞后，将中性粒细胞重悬于999微升HEPES缓冲液中，并向悬液中加入1微升10毫摩尔的CFDA SE染料储备液，最终获得10微摩尔的CFDA SE工作液，室温孵育10分钟。用 HEPES 缓冲液洗涤细胞两次，每次以 315 × g 离心 5 分钟。计数细胞后，将中性粒细胞重悬于细胞培养基中，浓度为每毫升 200 万个细胞，或加入 TNF-α，或同时加入 TNF-α 和 PKC delta 抑制剂，室温孵育 15 分钟。用细胞培养基配制浓度为 1 微摩尔的趋化因子 fMLP，并将其吸入注射器中。打开 bMFA 的一个入口和一个出口端口。从组织舱中移除端口管路，插入 fMLP 管路。向所有 bMFA 的组织舱内注入约 20 微升 fMLP，留一个使用细胞培养基处理的组织舱不加。剪断管路并用夹子夹住。用大约 200 微升的中性粒细胞悬液重新填充注射器，并将注射器安装到注射泵上。将装置放置在倒置显微镜载物台上后，设定流速为每分钟 1 微升，并启动泵。等待中性粒细胞悬液从小段管路末端形成一小滴后，将管路插入入口端口。荧光标记的中性粒细胞流入血管通道，并在生理相关的流动条件下与内皮细胞相互作用。实验开始10分钟后，打开图像分析软件，将物镜切换至10倍，并使用载物台操纵杆将装置居中置于显微镜下。为获得黏附图谱，进入“Acquire”菜单，点击“Scan Large Image”。会弹出一个新窗口。选择10倍物镜，并设置视野选项，例如5乘以3。单击扫描，然后单击文件，保存黏附图谱。为了获得用于迁移分析的迁移图谱，请使用载物台操纵杆将设备置于显微镜视野中央。点击“View”（查看）、“Acquisition Controls”（采集控制）、“ND Acquisition”（多维采集）。此时将弹出一个新窗口。设置文件保存路径并输入文件名。勾选“大图像”功能，设置扫描区域，例如 5 乘以 3。勾选“时间”功能，将时间间隔设为五分钟，持续时间设为 60 分钟。每隔五分钟拍摄一次组织腔室的延时图像，持续一小时。CFD 模拟显示，血管通道内的流动模式为层流，但在分流区域，流动模式受到干扰。完成仿生微流控实验后，相差显微镜图像显示，血管通道表面已被内皮细胞覆盖，并在培养 48 小时后沿剪切流方向排列整齐。采用共聚焦显微镜进行荧光成像，结果表明内皮细胞在bMFA中形成了完整的三维管腔。获得了中性粒细胞黏附图谱，显示中性粒细胞在bMFA中与内皮细胞之间存在显著的黏附作用。bMFA中的中性粒细胞迁移图谱显示，在TNF-α激活后，大量中性粒细胞在组织腔室内发生迁移，而在未进行TNF-α激活的情况下则未观察到此类迁移现象。中性粒细胞空间分布与剪切速率相关联的黏附图谱表明，中性粒细胞的黏附主要发生在剪切速率较低的血管以及靠近分叉区域的部位。此外，TNF-α处理显著增加了细胞黏附，而PKCδ抑制剂可抑制该效应。对延时成像结果的分析表明，TNF激活内皮细胞可增强中性粒细胞对fMLP的迁移反应，而经PKCδ抑制剂处理后，中性粒细胞的迁移能力较TNF-α处理组降低。因此，bMFA可用于评估新型抗炎治疗药物的疗效。通过测量炎症期间的通透性、跨内皮电阻（即TEER）以及黏附分子表达等变量，bMFA还可用于研究内皮完整性。这种仿生微流控检测方法能够模拟不同器官的微环境，不仅限于单一细胞类型或物种，还可模拟对器官功能及多种疾病建模至关重要的细胞/细胞间通讯。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一种研究炎症期间白细胞-内皮细胞相互作用的微生理系统

这是一种用于观察白细胞在离体加压血管中与内皮细胞黏附的方法。该技术能够在不同管腔压力（最高达200...

在高管腔压力下成像白细胞与血管内皮的黏附

一种在具有微血管尺寸通道的微流控装置整个内部三维表面培养内皮细胞单层的方法&lt;30 μm）被描述。 这一 体外...

用于研究血液系统疾病中微血管相互作用的内皮化微流控技术

采用光刻技术蚀刻并由PDMS制成的微流控流动室，用于研究与内皮细胞功能障碍和炎症相关的功能结果。在一个代表性实验中，展示了不同剪切应力对单核细胞黏附于细胞因子激活的内皮细胞单层能力的调节作用。...

芯片上内皮炎症表型分析

在本视频中，我们展示了经腹腔注射脂多糖的小鼠模型肠系膜静脉中血细胞与内皮细胞相互作用的实时可视化过程。...

利用活体显微镜分析炎症小鼠模型中血细胞与内皮细胞的相互作用

本视频展示了一种基于层流的检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴（如内皮细胞）之间的相互作用。该方法可在白细胞流经完整且融合的血管细胞层时，动态观察其黏附、去黏附及跨内皮迁移过程。...

一种基于层流的白细胞与内皮细胞相互作用研究方法

白细胞通过细胞旁路或跨细胞途径穿过内皮单层。我们建立了一种简单的方法，用于在生理流动条件下追踪内源性连接蛋白VE-cadherin和PECAM-1在白细胞跨内皮迁移过程中的分布，以区分这两种迁移途径。...

生理流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞间连接的实时成像

此处，我们介绍一种可用于评估白细胞募集动态的实验方案 离体...

在流动条件下评估白细胞-内皮细胞相互作用 离体 自动灌流微流控腔室检测法

这种简化的小鼠肠系膜静脉活体显微成像方法可用于多种炎症模型，以观察白细胞-内皮细胞以及血小板-白细胞之间的相互作用。...

小鼠肠系膜静脉中白细胞-内皮及血小板-白细胞相互作用的活体显微成像

血管内皮细胞严格调控白细胞的募集过程。白细胞渗出异常可导致人类炎症性疾病的发生。因此，寻找内皮细胞活化的新调控因子，对于开发更有效的炎症性疾病治疗策略至关重要。本文介绍了一种系统性的方法学，用于鉴定能够调节炎症过程中白细胞迁移的新型内皮调控因子。...

用于表征炎症反应中新型内皮调节因子的筛选实验

血管壁损伤或炎症期间，白细胞会积极地与血管细胞和血小板相互作用。本文介绍一种基于层流的简便检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。...

基于层流的检测方法用于研究白细胞在培养的血管细胞和黏附血小板上的募集作用

本逐步实验方案详细描述了用于评估hiPSC-ECs中炎症反应以及在生理流动条件下分析白细胞黏附的实验设置和数据分析方法。...

用于评估白细胞黏附至人诱导多能干细胞来源的内皮细胞（hiPSC-ECs）的微流控检测方法

学习使用仿生微流控芯片技术实时观察中性粒细胞与内皮细胞的粘附及迁移行为。该方法利用原代人细胞模拟生理微血管环境，为炎症性疾病机制研究和药物筛选提供可靠平台。

一种用于研究炎症过程中白细胞与内皮细胞相互作用的微生理系统

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