一种研究炎症期间白细胞-内皮细胞相互作用的微生理系统

白细胞 - 内皮细胞相互作用在脓毒症等炎症性疾病中起重要作用。炎症失调常导致血管内皮屏障功能改变和白细胞过多，从而导致器官损伤。仿生微流体测定，我们称之为bMFA，再现体内微血管网络的形貌和流动条件，并允许实时评估中性粒细胞滚动，牢固粘附，扩散和迁移到组织室。

仿生微流体测定的一个优点是能够使用原代人类细胞和临床相关患者样本来增加临床转化并快速筛选潜在的治疗方法。演示这些程序的将是来自我实验室的研究生研究助理杨庆良先生。开始使用细镊子将长度约为一英寸的管子插入端口内，但一个入口端口除外。

使用钳口夹，将两个出口端口和组织室夹在一起。用PBS将纤连蛋白储备溶液稀释至每毫升100微克。将连接到24号钝针的一毫升注射器与稀释的纤连蛋白溶液一起装入，并将注射器连接到四英寸长的管道上。

将管子插入开放的入口端口，然后推动柱塞，直到人纤连蛋白从另一个入口端口释放并夹紧它。对其余端口重复该过程，直到所有通道，组织室和管道都充满人纤连蛋白溶液。取下针头，但保持四英寸长的管子插入并未夹紧。

要进行脱气，请将未夹紧的管道连接到气动底漆，该底漆连接到压缩氮气罐，压力为每平方英寸5磅，持续15分钟。在显微镜下，检查通道或组织室内是否没有气泡，如果存在气泡，请重新连接设备。从气动底漆中取出设备，并在37摄氏度下孵育一小时。

使用预热的人肺微血管内皮细胞培养基，冲洗所有通道和组织室。按照文本手稿中所述收获内皮细胞后，G.In 可编程注射泵以150次离心将细胞沉淀五分钟，安装一毫升注射器并将管子连接到钝针上。将大约20微升的细胞悬浮液吸入管中，而不让它进入注射器桶中。

从设备的出油口卸下夹具。将管道连接到入口端，而不会将任何气泡引入通道。以每分钟四到八微升的流速停止泵，并在显微镜下观察。

当通道充满电池时，停止泵。夹紧出口并切割入口管。将设备在5%二氧化碳和37摄氏度的培养箱中放置四小时。

孵育四小时后，准备另一个注射器并用新鲜的细胞培养基填充。将注射器安装在注射器泵中，并将其连接到入口端口。从出油口卸下夹具。

以每分钟四到八微升的速度将新鲜培养基通过设备约五分钟，以除去漂浮或未连接的细胞。通过用新鲜细胞培养基填充注射器来准备注射器。将注射器安装在注射泵中，并将其连接到一个入口端口，同时保持出口打开。

将设备置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中。编程注射泵用于在流动下培养内皮细胞，如文本手稿中所述。使用显微镜，在流动下培养48小时后检查bMFA。

共聚焦显微镜表明血管通道的所有表面都被内皮细胞覆盖，在bMFA中形成完整的3D管腔。在制备三种不同的bMFA装置后，分别用细胞培养基或TNF-α或TNF-α联合PKC delta抑制剂加载三个一毫升注射器，其中TNF-α和炎性细胞因子用于刺激内皮细胞和嗜中性粒细胞。PKC δ抑制剂是一种新型抗炎抑制剂。

将三个加载的注射器连接到三个 bMFA 设备。使用缓冲液TNF-α或TNF-α添加抑制剂，以每分钟0.1微升的速度治疗人肺微血管内皮细胞四小时。如文稿所述分离人嗜中性粒细胞后，将中性粒细胞重悬于999微升HEPES缓冲液中，并向悬浮液中加入1微升10毫摩尔CFDA SE染料储备溶液，得到10微摩尔CFDA SE工作溶液，并在室温下孵育10分钟。

用HEPES缓冲液洗涤细胞两次，方法是将溶液以315倍G离心5分钟，计数细胞后，在细胞培养基中以每毫升200万嗜中性粒细胞重悬于细胞培养基或加入PKCδ抑制剂的TNF-α或TNF-α中，并在室温下孵育15分钟。用在细胞培养基中制备的一微摩尔化学引诱剂fMLP填充注射器。打开 bMFA 的一个入口和一个出口。

从组织室中取出端口管，然后插入fMLP管。将约20微升fMLP注射到组织室中以用于所有bMFA，留下用细胞培养基处理的fMLP。切割管子并夹紧它。

用大约200微升的中性粒细胞悬浮液填充注射器，并将注射器安装在注射器泵上。将设备放在倒置显微镜载物台上后，将流速设置为每分钟一微升，然后启动泵。等到一小滴中性粒细胞悬浮液从管中出来，然后将管子插入入口端口。

荧光标记的嗜中性粒细胞流入血管通道，并与内皮细胞和生理相关的流动条件相互作用。从开始实验10分钟后，打开图像分析软件，将物镜切换到10倍，并使用载物台操纵杆将设备置于显微镜下的中心。要获取附着贴图，请转到采集，单击扫描大图像。

将弹出一个新窗口。选择 10 倍物镜并设置场选项，例如 5 x 3。单击扫描，单击文件，然后保存附着贴图。

要获得用于迁移分析的迁移图，请使用载物台操纵杆将设备居中在显微镜下。依次单击视图、采集控制、ND 采集。将弹出一个新窗口。

设置"路径"以保存文件并键入文件名。选中大图像功能，设置扫描区域，例如，5×3。勾选时间功能，将间隔设置为5分钟，持续时间设置为60分钟。

拍摄组织室的延时图像，在接下来的一小时内每五分钟拍摄一张图像。CFD仿真显示了血管通道中的层流模式，但流动模式受到干扰的分岔区域除外。在进行仿生微流体测定后，相差图像显示血管通道的表面被内皮细胞覆盖，并在培养48小时后沿剪切流方向对齐。

使用共聚焦显微镜进行荧光成像，表明在bMFA A中获得中性粒细胞粘附图中内皮细胞形成完整的三维腔，这表明bMFA中嗜中性粒细胞与内皮细胞有显着的粘附。bMFA中的中性粒细胞迁移图显示，在TNF-α激活时，组织中室内会发生相当大的中性粒细胞迁移，而在没有TNF-α激活的情况下没有观察到这种迁移。将中性粒细胞的空间分布与剪切速率相关联的粘附图表明，中性粒细胞粘附优先发生在剪切速率低的血管和分岔附近区域。

此外，TNF-α治疗显着增加了粘附，其被PKCδ抑制剂抑制。分析延时图像表明，内皮细胞的TNF活化增加了响应fMLP的中性粒细胞迁移，而与TNF-α处理的细胞相比，用PKC delta抑制剂治疗减少了迁移。因此，bMFA可用于测试治疗炎症性疾病的新型疗法的疗效。

bMFA还可用于通过测量渗透性和经内皮电阻等变量来研究内皮完整性，所谓的TEER以及炎症过程中的粘附分子表达。仿生微流体测定可以模拟不同器官的微环境，不限于单细胞类型或物种，还可以模拟对器官功能至关重要的细胞/细胞通讯和模拟不同疾病。