低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

本方案有助于利用常规荧光显微镜对多细胞球状体进行氧合成像。通过该方法，可制备数千个经氧探针染色的球状微组织，并可进一步将其用于三维打印应用，例如带血管化的骨组织移植物。

近红外氧探针可与其他染料（如绿色荧光染色）兼容使用。最终，这使得能够进行活体、多参数的长期分析。将微图案化PDMS印章从储存瓶转移至无菌培养皿中，并在无菌层流条件下，光滑面朝上晾干10分钟。将每块印章置于12孔无菌组织培养板各孔的中央位置。

打开盖子风干一到两分钟。准备50毫升3%的均质琼脂糖溶液，并立即向12孔板的每个孔中加入约两毫升热琼脂糖溶液，以覆盖插入的PDMS印章。在无菌气流条件下孵育20分钟，使琼脂糖凝固。

使用无菌刮铲将含有嵌入式PDMS印章的琼脂糖在每个孔中倒置。在印章光滑的上表面加入约200微升无菌水。用刮铲将印章从琼脂糖上分离，并将其从孔中取出。

向琼脂糖印模中加入一毫升相应的无菌细胞培养基，直接使用。用盖子盖住培养板，并在4°C下孵育过夜。使用前，在二氧化碳培养箱中于37°C预热琼脂糖微图案化培养板一小时。

用预热的 PBS 清洗 70% 至 90% 汇合度的细胞培养物。加入解离酶溶液，在 37 摄氏度下孵育 3 至 5 分钟。随后，用含有 10% FBS 的完全细胞培养基中和胰蛋白酶。

为了获得单细胞悬液，使用1,000微升移液器吸头在血清学移液管顶部将细胞团块解离。使用计数板对细胞悬液每毫升中的细胞数量进行计数。将细胞悬液稀释至每毫升500,000个细胞，并加入浓缩的氧探针溶液。

从12孔琼脂糖包被的细胞培养板的微图案孔中移除旧的培养基，并向孔中加入一毫升制备好的细胞悬液。将类球体在二氧化碳培养箱中培养2至5天，期间持续存在氧探针，以确保其在类球体形成和紧实过程中被加载。用吸头帽封闭无菌3立方厘米卡筒的末端，并通过移液加入生物墨水进行填充。

将活塞插入墨盒中，并将其倒置。取下尖端帽，推动活塞朝向生物墨水，直至排空墨盒中的所有空气。将生物墨水置于生物打印机的加热套中，冷却至23摄氏度。

用70%乙醇喷洒生物打印机，然后用吸水纸擦干。在 cartridge 顶部拧入压力适配器。在 cartridge 上安装一个22号锥形聚乙烯针头。

将 cartridge 安装到基于挤出的打印头的加热套中。堵住压力入口，并打开入口处的夹子。将设计的 G-code 文件载入打印软件中。

开始测量针头长度。通过在无菌培养皿中挤出少量生物墨水来调节打印压力。安装六孔板，打开孔板，关闭防护罩，然后开始打印。

打印完成后，将支架在5°C下进行物理交联10分钟。使用紫外LED灯对打印的支架照射60秒。立即将含有双抗生素溶液的相应生长培养基加入到所有含有生物打印网格的孔中。

将支架置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中进行培养。为进行显微镜观察，将打印的华夫格阵列转移至含有成像培养基的显微镜培养皿盖中。使用1毫升移液器，轻轻将经氧探针预染色的类球体从琼脂糖微孔中冲洗出来，并转移至15毫升锥底离心管中。

为确保从微图案化孔中收集全部类球体，用额外的1毫升培养基冲洗孔内1至3次，并将所有类球体悬液合并至一个小管中。将小管垂直静置最多10分钟，使类球体沉降至管底。小心移除管中的培养基，避免扰动类球体。

加入新鲜的培养基，培养基的量需足以支持每个样品皿中至少20个类球体，并用移液器轻轻重悬类球体。立即将等体积的类球体悬液加入每个预先包被的显微镜培养孔中。在37摄氏度下孵育一小时，使类球体贴附于显微镜培养孔表面。

从显微镜培养板孔中移除培养基，并用成像培养基冲洗一次。向样品中加入准确体积的成像培养基。将经染色的类球体置于显微镜载物台上，设置好显微镜培养板孔。

使用10倍物镜，在透射光下预览样品。对类球体进行初步聚焦，将其置于图像中心，并将所需高倍物镜移至工作位置。在透射光模式下，对类球体的赤道横截面进行聚焦。

调整设置以采集氧探针的参考和敏感光谱通道的荧光或磷光信号，并启动成像过程。以合并模式打开包含参考和敏感光谱通道氧探针强度数据的 vsi 文件。从测量菜单中打开比值分析功能窗口。

选择参考通道的强度作为R值计算的分子，敏感通道的强度作为分母。在比值分析窗口中，对每个光谱通道应用相应的强度阈值设置，以从合并的强度图像中扣除背景信号。应用于类球体图像的ROI掩膜用于确定类球体的边界。

提高阈值，直至图像背景变为均匀的黑色。在比率分析窗口中，调整比率图像的缩放因子，直到预览图像呈现出所需的R梯度分辨率。强度比率分布图像将作为图层添加至原始多通道图像中。

在多通道图像窗口中，激活带有伪彩色标尺的图层。在“调整显示”窗口中，使用固定缩放选项手动确定比率分布直方图的连接与断开阈值。打开类球体对应的透射光图像。

选择线性标尺功能，测量类球体的直径。将数据导出为电子表格文件。选择所需大小和形状的感兴趣区域（ROI），并将其应用于类球体的周边和缺氧核心区域。

将感兴趣区域（ROI）转换为测量对象，以分析所选ROI内的平均R值。以兼容电子表格的表格格式导出数据。对类球体的每个显微成像切面应用测量，获得类球体直径RC和RP的数据集，用于进一步计算和统计比较。

将所有数据合并到一个电子表格文件中。MMIR1 探针具有较低的光漂白性，适用于实时研究不同线粒体刺激物对人牙髓干细胞球体快速呼吸反应的影响。FCCP 仅在某些区域表现出轻微的解偶联效应，随后略微降低了细胞呼吸。

另一方面，鱼藤酮强烈抑制呼吸作用，导致类球体重新氧合，并在刺激后约80秒内消除从周边到核心的氧梯度。利用成像软件提供的逐像素强度比值自动计算程序，可实时检测并可视化所有类型类球体中从周边到核心的氧梯度，表现为氧合的外周区域与中心的缺氧微环境。本文中的图示展示了不同类型类球体赤道横截面的比值分布剖面。

与同细胞hDPSC球体相比，异细胞hDPSC与HUVEC球体具有显著更陡的梯度。异细胞球体中外周到核心的氧梯度可能由其组成中的hDPSC产生，因为hDPSC球体的氧合表现出强烈的呼吸活性。图示显示，生物打印后的hDPSC球体其外周氧合程度显著高于生物打印前测量的球体，而它们的核心氧合水平则具有相似的数值。

若探针偶尔发生沉淀而影响类球体的均匀形成，使用前需对探针溶液进行过滤或高速离心。校准针头长度测量和压力调节是匹配生物打印速率、支柱直径以及在多孔支架中打印微聚集体的关键步骤。选择适用于氧敏感探针成像的显微镜设置时，应考虑其对探针光稳定性的影响。

氧气成像可与多种类型的活体显微镜测量兼容。成像后，还可进行免疫荧光染色、提取蛋白质用于蛋白质印迹分析，或进行基因表达分析。