Name: 经济实惠的氧气显微镜辅助多细胞球体生物制造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 了解使用标准荧光显微镜成像多细胞球体氧合的方法。该技术可高通量生成氧探针染色的球体微组织，用于3D生物打印和组织工程应用。

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本工作得到了根特大学特别研究基金（BOF/STA/202009/003）以及欧盟第七框架计划ITN项目&#34;Chebana&#34;（资助协议编号264772，授予AVK）的支持。数据可根据请求获取。用于生物打印的G代码可供共享。

作者无任何利益冲突需要披露。

意义。 组织氧合水平的测量能够揭示细胞和特定组织的代谢、组织生长与发育、存活能力、肿瘤发生及细胞迁移，以及与微生物和其他病原体相互作用的情况。本文介绍的方法为深入理解多细胞球状体培养物的生理特性提供了新工具：利用比率型纳米颗粒 O2 探针进行氧合分析，可在广泛使用的低成本荧光显微镜上实现缺氧评估、特定能量生成途径依赖性的可视化，并补充建模研究及其他代谢成像方法43,44。比率型测量可在荧光宽场显微镜（推荐使用脉冲LED激发）、激光扫描共聚焦显微镜、光片显微镜和双光子显微镜上进行，理想情况下配备温度（T）和 O2 控制的培养箱。重要的是，本文所述的 O2 显微测量方法可轻松结合多种生理参数和细胞示踪剂（针对异细胞组成球状体培养物）的活细胞多参数分析、细胞活力检测（活/死染色）、脂质代谢（脂质感应型荧光探针）、pH 动态变化（染料、纳米颗粒和荧光蛋白）或 [Ca2+] 检测，这些可在现有的荧光光谱通道中依次或并行完成，从而全面揭示球状体、生物打印结构以及潜在组织移植物中细胞功能的实时动态。
类球体培养物被广泛应用于癌细胞、肿瘤和干细胞微环境、类肿瘤体、药物有效性和毒性筛选等研究，实际上也可作为组织生物制造和自组装的组织构建单元45。可通过多种不同方法，利用多种细胞类型生成类球体46。类球体模型的广泛应用迫切需要从研究规范性和数据分析改进的角度对其进行标准化，近期已尝试建立首个类球体数据库以实现这一目标8。
本方案有望帮助更好地理解活体类球体的代谢过程，标准化此类实验模型，并进而提高其在生物打印及可植入材料中的长期稳定性、可重复性和存活率。
修改说明。本方案描述了使用微图案化琼脂糖低黏附表面（基于微模具成型29）高效生成负载O2探针的类球体，用于氧合分析。其他类球体生成方法，如悬滴法、超低吸附培养板、脂质涂层或悬浮培养法，也可与建议的O2探针负载方案兼容。本方案已针对人牙髓干细胞（hDPSC）类球体以及hDPSC与HUVEC（1:1）的共培养类球体进行优化。其他细胞系同样适用15,17,47,48；但由于不同细胞的黏附特性、培养条件、代谢底物需求以及对纳米颗粒染色的兼容性存在差异，可能需要对方案进行一定优化。选择合适的基于比率型纳米颗粒的O2敏感探针时，需根据具体的细胞模型，并结合所用显微镜系统的光漂白特性（光源强度与类型、相机光谱灵敏度）以及是否有合适的激发/发射滤光片，用于探针相应的参考通道和O2敏感光谱通道。 
一些比率型O2 探针可商业获得2或者，可通过参考物质与O的共沉淀法在实验室自行制备。2-敏感性染料与聚合物的使用方法，详见其他文献24,25,49对于每个独立的模型，应首先进行预实验，以确定合适的探针和最佳显微镜观察条件，并尽量减少探针光漂白或光诱导氧2 比率测量期间的消耗。先前关于O2-sensing 纳米颗粒表现出较低的细胞毒性，可在较宽的染色浓度范围（1–20 µg/mL）内应用。由于部分阳离子纳米颗粒在储存过程中可能发生自聚集，建议尽量保持较低的加载浓度，以最小化其对类球体形成可能产生的影响。可选地，纳米颗粒悬浮液可通过过滤（0.2 µm）或离心（10,000 x）去除杂质或沉淀 g使用前需离心（5 分钟）以去除悬液中的所有聚集体。
尽管BioCAD和HMI软件专用于本文所述的生物打印机，但本实验方案同样适用于其他生物打印机，因为文中提供了生物墨水的制备、组件组装、标准 cartridge 的填充以及多孔水凝胶支架的设计方法。此外，不同基于挤出式的生物打印机在打印速率和温度等打印参数方面应具有可比性。打印压力和丝状结构直径取决于针头类型与直径、生物墨水成分、温度及其相应的黏度，但这些参数可作为优化不同生物打印机上 GelMA 基生物墨水打印参数的起点，尽管某些生物打印机采用螺杆驱动而非气压来挤出生物墨水50。
关键步骤与故障排除。其中一个关键步骤是选择O2探针，该选择基于以下考虑因素：首先，所用荧光显微镜系统的配置（即激发光源、激发和发射滤光片、相机灵敏度、物镜的光谱透过率和数值孔径），这些因素可能限制可用探针的数量，具体涉及探针的光稳定性、亮度以及潜在的光毒性。还需注意，某些类型的浸油（在使用油浸物镜时）可能会干扰红色和近红外荧光信号。我们认为光稳定性测试极为重要，必须在初始系统搭建和预实验阶段进行。必须考虑不同荧光通道与染料之间的潜在光谱串扰。实际上，在优化实验方案时，必须评估O2探针及其他所选染料针对特定细胞模型可能存在的暗毒性和光诱导毒性51。对于纳米颗粒而言，一个特定问题是其可能发生自聚集，可通过优化其工作浓度、染色介质的组成（如血清含量）、在与培养基混合前对纳米颗粒进行超声处理，或在类球体形成过程中改用预先染色并洗涤过的细胞来加载O2探针，而非在类球体形成和致密化过程中进行探针加载，从而缓解该问题。
在所述的类球体模型中，我们未观察到与光穿透深度相关的问题，但在选择比率型强度信号、类球体尺寸和生物制造结构（组织移植物）以及优化细胞染色所用染料时，仍需考虑这一因素。MMIR1探针的红色和近红外发射波长非常接近，与其他发红光/蓝光或绿光的荧光生物传感器探针相比，预期可提供最低的背景信号和最佳的组织光穿透能力。
比率图像的生成与处理（以及可能的光谱解混或去卷积）可在厂商提供的软件中完成，也可使用开源工具如 ImageJ、Fiji52,53、napari（https://napari.org）、MATLAB 等实现。关键步骤包括扣除背景信号，并在线性范围内测量信号强度的变化。
O2 探针的校准：鱼藤酮和抗霉素 A 分别是线粒体电子传递链复合物 I 和复合物 III 的抑制剂，可阻断细胞呼吸54,55,15，并诱导类球体中的 O2 梯度消散，使其与环境 O2 浓度达到平衡。因此，改变环境 O2 浓度（即 20%、15%、10%、5%、2.5%、1%、0% O2）可实现细胞内 O2 敏感探针对比强度或磷光寿命的校准。通常情况下，O2 控制培养箱无法达到绝对的 0% O2，在某些情况下，需要快速测试探针对去氧的响应。此时，需向样品中添加 25–100 µg/mL 葡萄糖氧化酶，或 Na2SO3/K2HPO4 混合物（每种化合物各 50 mg/mL，用蒸馏水配制成 10 倍浓缩液）。值得注意的是，若细胞系存在显著的非线粒体 O2 消耗，在进行呼吸抑制和校准实验时应考虑这一因素。
局限性与未来研究方向。 所提出方法以及比率检测方法总体上的主要局限在于，需将观测到的比率水平校准并转换为实际的 O2 水平，而由于硬件设备和用户图像采集设置的固有差异，该比率校准过程将依赖于特定仪器和特定细胞类型。重要的是，对于宽场荧光显微镜及本文所述的实验装置，所获得的比率图像反映的是综合投影而非理想的光学切片，因此进行 O2 校准并无意义。另一方面，我们证明了半定量的比率测量能够对来自不同来源且在氧合状态上存在差异的类球体提供具有统计学意义、易于测量的比较性表型分析。
未来的研究将致力于开发更易于获取且成本更低的显微成像技术，适用于活体三维样本，例如SPIM、光片显微镜、theta显微镜、双光子显微镜以及结合机器学习的发光寿命成像56,57,58,59,19，这将有助于推动多参数O2成像在更多定量应用中的发展。

分子氧（O₂）2) 是调控细胞和组织存活、功能及死亡的关键代谢物之一。在生理条件下，局部组织的氧合状态由组织血管化、血流和细胞代谢动态调节，在某些情况下可导致 O2 梯度、缺氧微环境和/或氧化应激1,2细胞感知 O2 通过分子O的直接参与形成梯度2&#160;在信号功能中（通过 缺氧诱导因子（HIF）介导的信号通路、组蛋白赖氨酸去甲基化酶 KDM 以及其他途径），细胞氧化还原电位的变化（活性氧2 通过Nrf2/Keap1信号通路或铁调节蛋白感应物种，并随之调节其代谢、增殖、干性和分化3因此，细胞和组织氧合的异质性、氧梯度及其相关现象在组织发育和稳态维持中发挥着重要作用。不同组织和细胞类型通常需要不同的“正常”生理氧浓度2 水平，用于定义&#160;具有按组织氧含量定位细胞的特殊组织结构2 微梯度4某些细胞类型对 O2 减少（例如神经元、肝细胞、胰岛细胞或肌细胞）5,6，而其他一些生物则能耐受极端缺氧环境并形成陡峭的氧梯度2 梯度（例如，在肠道和结肠上皮中）7随着组织生物工程和生物制造技术的进步，O2 微聚集体和球形三维组织构建体中的定量分析变得愈发重要。其中一个关注点是多细胞球体模型生理参数的标准化，这些参数依赖于球体生成方法和培养条件8此外，未受控地施用O2 释放生物材料或O2 缺乏功能性血管化的微组织中，灌注可能对细胞产生毒性作用，导致其代谢重编程，并降低移植后的存活率9,10. O 的可信度2 通过多能干细胞来源的肝类球体作为示例，利用数学建模方法，最近已证实测量手段及氧合环境的优化可实现生理相关微聚集体的高效培养11. 另一个需要了解组织氧合水平的领域2 癌症治疗中已认识到的水平12,13肿瘤缺氧的异质性可能影响抗癌治疗的效果。在患者治疗期间或构建肿瘤缺氧模型时，精确测量和调控氧合水平，有助于优化个体化和精准化的治疗策略。14因此，对生物制造结构和三维肿瘤模型中动态氧合状态进行定量监测，是生理学分析其呼吸活性、代谢过程，以及优化组织培养、制备条件或缺氧介导治疗反应基础研究的重要工具。
多种方法可用于类球体和微聚集体组织构建物中细胞氧合状态的多重（或多参数）分析。该技术最初在神经球和肿瘤类球体中建立。15,16,17基于磷光寿命成像显微技术（PLIM）的方法能够直接定量活体微组织中的细胞氧合状态，并建立其与细胞活力、增殖或功能细胞类型分布之间的关联。尽管该方法具有强大优势，但即便在主流显微镜供应商中，PLIM显微镜的升级配置仍未得到广泛普及。18,19幸运的是，已有相当数量的细胞穿透性O2敏感的纳米粒子探针也可用于基于荧光强度的比率测量模式15,17,20,21,22,23,24通常，探针会显示两个发射波长，即 O2-敏感与非敏感（对照）样本，可在荧光显微镜、高内涵筛选成像系统或微孔板读板仪上进行检测。此类 O2-传感纳米颗粒可通过沉淀技术与生物相容性聚合物O制备2-传感以及覆盖可见光和近红外光谱的参考染料，或可直接购买商用产品2,25由于对较厚的三维微组织进行分析时可受益于红移荧光染料的使用，因此采用比率型O2-传感纳米粒子探针多模态红外编号1（MMIR1），由O组成2-传感型 PtTPTBPF26 以及参照 aza-BODIPY27 将染料浸渍于带正电荷的甲基丙烯酸酯类共聚物中构建而成28采用这种设计，一个O2-敏感信号（近红外，激发（exc.）= 635 nm，发射（em.）= 760 nm；I感觉) 受 [O2浓度 通过 磷光猝灭过程，而红色参比染料的强度（激发 = 580 nm，发射 = 650 nm；I参考文献）保持不变（图1A因此，&#160;我参考文献 / I感觉 染色细胞中的比率（R）可用于实现 O2 校准22.
本文介绍了一种用于监测类球体及生物打印结构中活细胞氧合状态的半定量方法，有助于在终点和动力学测量中估算 O2 梯度。此类 O2 成像可结合其他类型的比率型 O2 探针进行（图1B），并可根据可用光源和荧光滤光片的数量，与其他染料联用，以获取有关活/死细胞、线粒体功能及其他细胞类型的示踪信息。也可采用荧光寿命成像显微技术（FLIM）等高级测量模式19。使用细胞染色染料和 O2 敏感性纳米颗粒时最大的挑战在于染色方案的优化。对于 MMIR1 探针及相关纳米颗粒，可在类球体形成过程中对细胞进行预染色或共孵育。在本方案中，O2 探针染色的类球体是在低黏附性琼脂糖表面生成的29,30,31,32（图1C），该方法便于后续基于类球体的生物打印，并实现对 O2 水平和细胞死亡的多参数分析。为展示该方法的适用性，利用常规荧光显微镜比较了同源或异源细胞（通过添加人脐静脉内皮细胞 HUVEC 构建）的人牙髓干细胞（hDPSC）类球体在生物打印前后的氧合水平。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Sigma 也提供该产品</td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板，无菌</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Sarstedt、Corning 及其他公司也提供类似产品。</td></tr><tr><td>12 孔可拆卸腔室载玻片</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Grace Bio-Labs、ThermoFisher Scientific 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>3 cc 卡式筒，UV 防护，鲁尔锁扣</td><td>RegenHU</td><td>C-033CC-UV</td><td>Cellink 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>3D Discovery 生物打印机</td><td>RegenHU</td><td>N/A</td><td>配备基于挤出的打印头、加热套、UV-LED 固化灯、3D Discovery HMI 软件（带直接机器控制的 CAD/CAM 软件）和 BioCAD 软件（版本 1.1-12）的生物打印机</td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板，无菌</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>链霉菌来源的抗霉素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674-25MG</td><td>用作线粒体电子传递链复合体 III 的抑制剂，阻断细胞呼吸</td></tr><tr><td>B-Braun 鲁尔锁扣尖端帽</td><td>RegenHU</td><td>TC-BB-B</td><td>Regemat、Cellink 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>细胞观察培养皿，聚苯乙烯材质，35/10 mm，玻璃底，单室，无菌</td><td>Greiner bio-one</td><td>627861</td><td>用于生物打印类球体的显微观察</td></tr><tr><td>人胎盘来源 IV 型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>用于制备 0.07 mg/mL 胶原蛋白和 0.03 mg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的显微观察培养皿</td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>配制 1 M 储存液，使用时稀释 1/100 以制备成像培养基（终浓度 10 mM）</td></tr><tr><td>无酚红、无葡萄糖、无丙酮酸、无谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>用于制备成像培养基</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22011</td><td>Lonza 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>内皮细胞生长补充剂混合物</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>Lonza 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>FCCP，羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920-10MG</td><td>用作线粒体解偶联剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Sigma 也提供该产品</td></tr><tr><td>GelMA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>GelMA 由 PBM 团队（根特大学 Peter Dubruel 博士教授和 Sandra Van Vlierberghe）合成 [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782]，但 Xpect Inx 也可提供</td></tr><tr><td>黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶（10000 u）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7141</td><td>用于测试探针对脱氧的响应</td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x 补充剂</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>使用时稀释 1/100 以制备成像培养基（终浓度 2 mM）</td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>使用时稀释 1/100 以制备成像培养基（终浓度 10 mM）</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>H21486</td><td>Sigma、BDBiosciences 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>人牙髓干细胞（hDPSC）</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td>ATCC 或其他供应商也提供该产品</td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td>ATCC 或其他供应商也提供该产品</td></tr><tr><td>KH2PO4（磷酸二氢钾）</td><td>Merck</td><td>4873</td><td>用于配制亚硫酸钠溶液（5 mg/mL Na2SO3 和 5 mg/mL KH2PO4）。每日使用 10 倍浓缩储存液新鲜配制。</td></tr><tr><td>Li-TPO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Li-TPO-L 由 PBM 团队（根特大学 Peter Dubruel 博士教授和 Sandra Van Vlierberghe）合成&amp;nbsp; [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97&lt;br/&gt; 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination]，但 Sigma 也提供类似的光引发剂</td></tr><tr><td>含 GlutaMAX 的 MEM α 培养基（最低必需培养基）</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td>Sigma 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>微图案化 3D 打印 PDMS 印模，孔径 400 &amp;micro;m，厚度，总孔数 1585</td><td>自行制备</td><td></td><td>该印模由微系统技术中心（根特大学 Jan Vanfleteren 博士教授）自行制备，但也可从默克公司（Z764094，Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit）商业购买</td></tr><tr><td>Na2SO3（亚硫酸钠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239321-500G</td><td>用于配制亚硫酸钠溶液（5 mg/mL Na2SO3 和 5 mg/mL KH2PO4）。每日使用 10 倍浓缩储存液新鲜配制。</td></tr><tr><td>O2 探针：MMIR1、SI-0.2+、SII-0.2+</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>可使用市售染料、聚合物和沉淀法在&amp;lsquo;实验室内部&amp;rsquo;制备 [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]。部分纳米颗粒可商业购买，详见 [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液：青霉素（10,000 U/mL）/ 链霉素（10,000 &amp;mu;g/mL）100 倍浓缩液</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Sigma 也提供该产品。使用时按 1:100 稀释</td></tr><tr><td>培养皿，无菌</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>3 cc 卡式筒活塞</td><td>RegenHU</td><td>P-03CC-UV</td><td>Cellink、Regemat 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>用于制备 0.07 mg/mL 胶原蛋白和 0.03 mg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的显微观察培养皿</td></tr><tr><td>PVDF 注射器滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td>用作线粒体电子传递链复合体 I 的抑制剂，阻断细胞呼吸</td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>使用时稀释 1/100 以制备成像培养基（终浓度 1 mM）</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>S7559</td><td>Sigma、Promega 及其他公司也提供该产品</td></tr><tr><td>22 号锥形尖端（锥形聚乙烯针头）</td><td>Amada Myachi Europe</td><td>22K62222</td><td>RegenHU、Cellink、Regemat 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>组织培养瓶（75 cm²）</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品</td></tr><tr><td>超纯琼脂糖</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>其他类型的琼脂糖，如低熔点琼脂糖（A-9414，Sigma）、常规用途琼脂糖（A-9539，Sigma）</td></tr><tr><td>宽场荧光倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>IX81 倒置荧光显微镜，带电动 Z 轴控制，CoolLED pE4000（16 通道，365–770 nm），ORCA-Flash4.0LT（Hamamatsu）cMOS 相机，Okolab 玻璃加热板，CellSens Dimension v.3 软件，以及 4x/0.13 UPlanFLN 和 40x/0.6 LUCPlanFLN 干物镜。（可选，用于高分辨率成像）60x/1.0 LUMPLFLN 水镜</td></tr></tbody></table>

低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

多细胞球体是研究三维组织和癌症生理学的重要工具，也常被用作组织工程中生物制造的组织组装单元。尽管球体模型的主要优势在于模拟组织微尺度下的理化梯度，但球体内部真实的生理环境（包括代谢活性、氧合、细胞死亡和增殖的动态变化）通常被忽视。与此同时，培养基成分和成球方法对最终球体表型的影响已有充分报道。因此，为确保研究结果的可重复性和透明度，有必要对球体表型进行表征和标准化。对球体平均氧合水平及氧分压（O₂）2 三维（3D）梯度可作为一种简单且通用的类球体表型表征方法，能够反映其代谢活性、整体存活能力以及再现潜能 体内 组织微环境。3D 氧合状态的可视化可轻松结合其他生理参数的多参数分析（如细胞死亡、增殖和细胞组成），并可用于连续氧合监测和/或终点测量。O 的加载2 在类球体形成阶段进行探针检测，可与多种类球体生成方案兼容。该方案包含一种高通量类球体生成方法，并引入了发射红色和近红外光的比率型荧光氧探针2 纳米传感器以及生物打印前后类球体氧合状态和细胞死亡的多参数评估描述。实验示例展示了对比的 O2 同质和异质细胞球体以及基于球体的生物打印结构中的梯度分析。该方案适用于配备多种荧光滤光片和发光二极管光源的常规荧光显微镜。

使用微图案化琼脂糖方法高通量制备预先染色的O2探针球状体的流程在图1C中示意图展示，图中显示了无和含有预先染色球状体的琼脂糖微孔实例。细胞在琼脂糖涂层上形成球状体的效率及其形态/球形度可能具有细胞类型特异性。例如，人结肠HCT116细胞使用琼脂糖微孔法无法形成理想的球形结构，这与脂质涂层表面的结果相反17；而hDPSCs单独培养或与HUVEC共培养时，均能形成形状和大小高度可重复的球状体，其尺寸与细胞组成、初始细胞数量以及球状体形成/生长时间成比例。所有测试的细胞类型在球状体形成过程中均能高效积累O2探针纳米颗粒（图1B），且染色效果可维持至少5天，因此可用于生物打印以及后续对生物打印组织氧合状态的监测（图1D）。
<img alt="磷光法静态平衡示意图；微图案化琼脂糖工艺概览。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：O2 探针功能原理及其在类球体染色与生物打印中的应用。（A）简化的雅布隆斯基能级图，解释了磷光纳米粒子（NP）探针对 O2 的传感原理。在禁阻的三重激发态（T）下，能量向分子氧 O2 转移，导致磷光强度下降，且下降程度与磷光寿命 tau（τ）成反比。τ 是指从单重激发态（S1）激发至返回基态（G0）所需的时间（在 0% O2 时为 τ1，21% O2 时为 τ2）42。可通过比值测量法或直接测量 τ（磷光寿命测定）实现 O2 的定量检测。（B）人牙髓干细胞（hDPSC）类球体经不同类型纳米粒子 O2 探针染色后的示例，显示于透射光、参考通道及 O2 敏感染料荧光通道中。比例尺为 100 µm。（C）利用微图案化琼脂糖方法高通量生成预先染色 O2 探针类球体的示意图。从左至右：置于培养板孔中的 PDMS 硅胶印章、琼脂糖中微孔阵列图案示例（4 倍放大），以及 HCT116 人结肠癌细胞在微图案化琼脂糖上接种后第 2 天形成的 MMIR1 预染类球体示例（4 倍放大）。比例尺为 100 µm。（D）从左至右：生物打印的华夫格结构，以及 MMIR1 预染类球体生物打印结构在生物打印后第 1 天和第 5 天的显微镜分析结果。荧光信号对应于 MMIR1 纳米粒子中的 O2 敏感性磷光染料（激发波长 = 635 nm，发射波长 = 760 nm）。比例尺为 400 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在所述显微镜系统（配备发光二极管（LED）作为光源的传统宽场荧光显微镜）中，红光/近红外MMIR1探针在其参考染料和响应性染料的光稳定性方面表现最佳，其初始强度比（R = I参考文献/I感觉经过12个周期的持续光照后。这使得可利用MMIR1探针对人牙髓干细胞球体在经线粒体解偶联剂（FCCP）和电子传递链复合物I抑制剂（鱼藤酮）处理后的快速呼吸反应进行动态实时研究。图2A，B）。我们发现，在干细胞衍生的球体中，FCCP 仅表现出轻微的解偶联效应，在加入该药物后约 80 秒内细胞呼吸略有下降，这与先前报道的 DPSC 代谢特征一致40另一方面，鱼藤酮强烈抑制呼吸作用，导致类球体重新氧合（表现为R值升高）p - 类球体边缘比率和Rc - 类球体核心比率）及外围至核心的O2 刺激后约 80 秒内形成梯度图2A）。MMIR1探针比率（R）在高氧（大气）和低氧（成像培养基中含亚硫酸钠和葡萄糖氧化酶）条件下的两点半校准2 水平证实了R的降低，这与经抗霉素A/鱼藤酮混合物处理预先抑制呼吸后类球体中氧合程度的下降相关图2C），说明了如何利用MMIR1探针R的测量值在三维条件下对长期稳态和快速氧合反应进行半定量监测。
<img alt="使用FCCP/鱼藤酮进行细胞氧合成像；荧光比值图；线粒体活性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：O2探针对不同刺激响应的动力学分析。（A）静息状态下及经FCCP和鱼藤酮处理后hDPSC球体氧合成像的代表性结果。比例尺为100 µm。（B）MMIR1强度比值对FCCP和鱼藤酮处理的动力学响应，与初始光漂白强度比值动力学（%）的比较。（C）hDPSC球体中MMIR1探针在富氧状态（添加抗霉素A + 鱼藤酮）和缺氧状态（添加葡萄糖氧化酶）下强度比值图像的变化。颜色条表示O2探针强度比值（R = Iref / Isens）在图像中的分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了说明MMIR1探针在活体代谢成像中的应用，对O2 同细胞hDPSC与异细胞hDPSC/HUVEC（1:1）类球体中的梯度分析已实施。利用蓝色和绿色荧光光谱通道的可用性，联合Hoechst 34580（HXT）与SYTOX Green（SYTOX）染色，以展示O的应用2 用于多参数研究的探针（图3）。利用成像软件提供的自动化逐像素强度比值计算流程，生成了球状体中R分布的伪彩比值图像，直观呈现了实时检测到的边缘至核心的O2 所有类型类球体中的梯度：外周富氧，中心为缺氧微环境（图2 和 图3A）。然而，Rp 和 Rc 值以及氧合曲线的陡峭程度2 不同类球体中间横截面上的梯度存在差异：参见hDPSC与hDPSC/HUVEC类球体以及hDPSC与生物打印hDPSC类球体中间横截面的线轮廓图（图3B, C）。由于目前尚无广泛接受的描述O的方法2 梯度，我们引入了多个参数，以实现对类球体总体氧合状态的简便比较和详细描述：Rp 和 Rc，以及O的这些特征2 氧合区与缺氧区之间的梯度差表示为（Rp- Rc，以及每次平均氧合变化 µm 如（Rp- Rc) / r，其中 r 是外围与缺氧核心之间的距离，在中间横截面上与球形体半径相关图3D）。结合SYTOX染色显示的类球体中坏死死亡细胞的数据，对这些参数进行统计学比较，有助于我们初步推断类球体中细胞类型特异性O的来源2 分布梯度
<img alt="细胞活力检测结果；细胞成像、荧光比值、SYTOX Green、hDPSC 生物打印比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：类球体中氧梯度的比较分析。（A）同细胞 hDPSC 类球体在打印前后以及异细胞 hDPSC/HUVEC（1:1）类球体中氧合状态（MMIR1 的比率荧光显微成像）和活/死细胞染色（Hoechst 34580、HXT，蓝色和 SYTOX Green、SYTOX）的代表性活体显微图像。所有类型类球体中的 hDPSC 均来自同一批细胞培养。类球体在形成过程中预先用 5 µg/mL MMIR1 探针染色 2 天，随后用于成像或生物打印（仅 hDPSC 类球体），并在生物打印后第 1 天进行后续成像分析。MMIR1 染色类球体的强度比（Iref/Isens）假彩色图像反映了其从周边到核心的 O2 梯度。比例尺为 100 µm。颜色条表示 O2 探针强度比（R = Iref/Isens）在图像中的分布情况。直径截面编号 1 和 2 对应于 B 和 C 中所示的强度分布曲线。（B,C）均质 hDPSC 与异质 hDPSC/HUVEC 类球体之间（B）以及均质 hDPSC 类球体在生物打印前后（C）的强度比分布曲线比较。分布曲线基于 A 图中所示类球体的横截面测量获得。（D）用于描述类球体中从周边到核心 O2 梯度的参数示意图，其中 r 为类球体半径，Rp 和 Rc 分别为类球体周边区域和核心区域的强度比。颜色条示意性地表示理想球形类球体中 O2 梯度从高（红色）到低（蓝色）的分布。（E,F）hDPSC/HUVEC 与 hDPSC 类球体中（E）以及 hDPSC 类球体在生物打印前与生物打印后第 1 天（F）的周边至核心 O2 梯度（Rp−Rc）/r 值的比较分析。统计分析基于一次实验重复（n = 18–23）。方框表示标准差。星号表示组间统计学差异（p = 0.05）；** = p &lt; 0.0005。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
与同源性hDPSC球体相比，hDPSC/HUVEC球体具有显著更陡的氧梯度：(Rp-Rc) / r 参数及其范围（Rp-Rc）的数值更高（图3F）。同时，其外围（Rp）和核心（Rc）的氧合水平也更高（图4A，表1）。有趣的是，这些异质球体在统计学上也明显更大（图4A，表1），提示其氧合差异可能源于不同的细胞生物能量特征。这些数据与HUVEC细胞已知的代谢特性一致：HUVEC细胞通常呼吸活性较低，主要依赖糖酵解和磷酸戊糖途径作为ATP和NAD(P)H的主要生物能量来源41。与此同时，异质球体中显著的由外周至核心的O2梯度可能由其中的hDPSC所驱动，因为hDPSC具有线粒体超极化和活跃的电子传递链特征40，并且根据hDPSC球体氧合实验结果，表现出较强的呼吸活性（图3、图4A和表1）。因此，hDPSC/HUVEC球体总体更高的存活率——通过SYTOX染色显示死细胞信号强度更低所证实（图3A）——可能与其更高的氧合水平相关。
为了说明活体显微成像在生物制造中用于类球体氧合状态分析的适用性，本研究使用经MMIR1 O2-探针预染色的类球体，将其在GelMA生物墨水中进行生物打印，并比较了人牙髓干细胞（hDPSC）类球体在打印前与打印后第1天的O2梯度变化（图3A、C、F，图4B以及表2）。与打印前的类球体相比，生物打印后的hDPSC类球体外围区域显著更富氧（Rp值更高），而其核心区域的氧合水平则相近（图4B）。外围氧合状态的变化影响了从外围到核心O2梯度的范围（(Rp-Rc)增大）和陡度（(Rp-Rc)/r增加），这些参数与打印前测量的hDPSC类球体相比具有统计学差异（图3F和图4B）。生物打印类球体中的死细胞染色通常更明亮，提示类球体活力下降可能参与了其氧合状态的改变（图3A）。
<img alt="细胞球体生长比较图表；hDPSC、HUVEC、生物打印影响；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63403/63403fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：MMIR1染色球体直径与强度比的比较分析。（A）异源hDPSC/HUVEC与同源hDPSC细胞球体的比较。（B）生物打印前后同源hDPSC细胞球体的比较。Rp 和 Rc 分别表示球体外围与核心的强度比；(Rp-Rc) 表示强度比的差异，对应球体中O2梯度的范围。统计分析基于一次实验重复（n = 18–23）。方框表示标准差。星号表示组间统计学差异（p = 0.05），其中 * = p &lt; 0.005，** = p &lt; 0.0005。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63403/63403fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>类球体类型 (N)</td>
			<td>直径 [µm]</td>
			<td>Rp [a.u.]</td>
			<td>Rc [a.u.]</td>
			<td>Rp-Rc [a.u.]</td>
			<td>(Rp-Rc)/r [a.u./µm]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hDPSC / HUVEC (18)</td>
			<td>113.2 ± 10.6</td>
			<td>0.779 ± 0.034</td>
			<td>0.398 ± 0.055</td>
			<td>0.982 ± 0.051</td>
			<td>0.00677 ± 0.00091</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hDPSC (18)</td>
			<td>88.1 ± 9.9</td>
			<td>0.558 ± 0.025</td>
			<td>0.331 ± 0.034</td>
			<td>0.227 ± 0.032</td>
			<td>0.00520 ± 0.00090</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p值</td>
			<td>1.5 x 10-8 *</td>
			<td>1.5 x 10-21 *</td>
			<td>1.3 x 10-4 *</td>
			<td>1.4 x 10-12 *</td>
			<td>9.2 x 10-6 *</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 异质性hDPSC/HUVEC和同质性hDPSC类球体的类球体直径、类球体核心处的强度比（Rc）与边缘处的强度比（Rp）、强度比差异（Rp-Rc）以及（Rp-Rc）/r值。对N个类球体进行t检验所得的p值用于表示统计学差异，并以星号标示。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>类球体类型 (N)</td>
			<td>直径 [µm]</td>
			<td>Rp [a.u.]</td>
			<td>Rc [a.u.]</td>
			<td>Rp-Rc [a.u.]</td>
			<td>(Rp-Rc)/r [a.u./µm]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hDPSC (18)</td>
			<td>88.1 ± 9.9</td>
			<td>0.558 ± 0.025</td>
			<td>0.331 ± 0.034</td>
			<td>0.227 ± 0.032</td>
			<td>0.00520 ± 0.00090</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物打印 hDPSC (23)</td>
			<td>80.9 ± 12.5</td>
			<td>0.584 ± 0.023</td>
			<td>0.323 ± 0.038</td>
			<td>0.261 ± 0.039</td>
			<td>0.00658 ± 0.00144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p 值</td>
			<td>0.054</td>
			<td>0.0024 *</td>
			<td>0.46</td>
			<td>9.9 x 10-4 *</td>
			<td>6.3 x 10-6 *</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 同质hDPSC类球体在生物打印前后其直径、类球体核心处的强度比（Rc）与边缘处的强度比（Rp）、强度比差异（Rp−Rc）以及（Rp−Rc）/r 值。统计分析的p值（N个类球体）。统计学差异以星号标示。

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。

多细胞球体是研究三维条件下组织和癌症生理学的重要工具，也常被用于组织工程中作为组织...

本方案有助于利用常规荧光显微镜对多细胞球状体进行氧合成像。通过该方法，可制备数千个经氧探针染色的球状微组织，并可进一步将其用于三维打印应用，例如带血管化的骨组织移植物。近红外氧探针可与其他染料（如绿色荧光染色）兼容使用。最终，这使得能够进行活体、多参数的长期分析。将微图案化PDMS印章从储存瓶转移至无菌培养皿中，并在无菌层流条件下，光滑面朝上晾干10分钟。将每块印章置于12孔无菌组织培养板各孔的中央位置。打开盖子风干一到两分钟。准备50毫升3%的均质琼脂糖溶液，并立即向12孔板的每个孔中加入约两毫升热琼脂糖溶液，以覆盖插入的PDMS印章。在无菌气流条件下孵育20分钟，使琼脂糖凝固。使用无菌刮铲将含有嵌入式PDMS印章的琼脂糖在每个孔中倒置。在印章光滑的上表面加入约200微升无菌水。用刮铲将印章从琼脂糖上分离，并将其从孔中取出。向琼脂糖印模中加入一毫升相应的无菌细胞培养基，直接使用。用盖子盖住培养板，并在4°C下孵育过夜。使用前，在二氧化碳培养箱中于37°C预热琼脂糖微图案化培养板一小时。用预热的 PBS 清洗 70% 至 90% 汇合度的细胞培养物。加入解离酶溶液，在 37 摄氏度下孵育 3 至 5 分钟。随后，用含有 10% FBS 的完全细胞培养基中和胰蛋白酶。为了获得单细胞悬液，使用1,000微升移液器吸头在血清学移液管顶部将细胞团块解离。使用计数板对细胞悬液每毫升中的细胞数量进行计数。将细胞悬液稀释至每毫升500,000个细胞，并加入浓缩的氧探针溶液。从12孔琼脂糖包被的细胞培养板的微图案孔中移除旧的培养基，并向孔中加入一毫升制备好的细胞悬液。将类球体在二氧化碳培养箱中培养2至5天，期间持续存在氧探针，以确保其在类球体形成和紧实过程中被加载。用吸头帽封闭无菌3立方厘米卡筒的末端，并通过移液加入生物墨水进行填充。将活塞插入墨盒中，并将其倒置。取下尖端帽，推动活塞朝向生物墨水，直至排空墨盒中的所有空气。将生物墨水置于生物打印机的加热套中，冷却至23摄氏度。用70%乙醇喷洒生物打印机，然后用吸水纸擦干。在 cartridge 顶部拧入压力适配器。在 cartridge 上安装一个22号锥形聚乙烯针头。将 cartridge 安装到基于挤出的打印头的加热套中。堵住压力入口，并打开入口处的夹子。将设计的 G-code 文件载入打印软件中。开始测量针头长度。通过在无菌培养皿中挤出少量生物墨水来调节打印压力。安装六孔板，打开孔板，关闭防护罩，然后开始打印。打印完成后，将支架在5°C下进行物理交联10分钟。使用紫外LED灯对打印的支架照射60秒。立即将含有双抗生素溶液的相应生长培养基加入到所有含有生物打印网格的孔中。将支架置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中进行培养。为进行显微镜观察，将打印的华夫格阵列转移至含有成像培养基的显微镜培养皿盖中。使用1毫升移液器，轻轻将经氧探针预染色的类球体从琼脂糖微孔中冲洗出来，并转移至15毫升锥底离心管中。为确保从微图案化孔中收集全部类球体，用额外的1毫升培养基冲洗孔内1至3次，并将所有类球体悬液合并至一个小管中。将小管垂直静置最多10分钟，使类球体沉降至管底。小心移除管中的培养基，避免扰动类球体。加入新鲜的培养基，培养基的量需足以支持每个样品皿中至少20个类球体，并用移液器轻轻重悬类球体。立即将等体积的类球体悬液加入每个预先包被的显微镜培养孔中。在37摄氏度下孵育一小时，使类球体贴附于显微镜培养孔表面。从显微镜培养板孔中移除培养基，并用成像培养基冲洗一次。向样品中加入准确体积的成像培养基。将经染色的类球体置于显微镜载物台上，设置好显微镜培养板孔。使用10倍物镜，在透射光下预览样品。对类球体进行初步聚焦，将其置于图像中心，并将所需高倍物镜移至工作位置。在透射光模式下，对类球体的赤道横截面进行聚焦。调整设置以采集氧探针的参考和敏感光谱通道的荧光或磷光信号，并启动成像过程。以合并模式打开包含参考和敏感光谱通道氧探针强度数据的 vsi 文件。从测量菜单中打开比值分析功能窗口。选择参考通道的强度作为R值计算的分子，敏感通道的强度作为分母。在比值分析窗口中，对每个光谱通道应用相应的强度阈值设置，以从合并的强度图像中扣除背景信号。应用于类球体图像的ROI掩膜用于确定类球体的边界。提高阈值，直至图像背景变为均匀的黑色。在比率分析窗口中，调整比率图像的缩放因子，直到预览图像呈现出所需的R梯度分辨率。强度比率分布图像将作为图层添加至原始多通道图像中。在多通道图像窗口中，激活带有伪彩色标尺的图层。在“调整显示”窗口中，使用固定缩放选项手动确定比率分布直方图的连接与断开阈值。打开类球体对应的透射光图像。选择线性标尺功能，测量类球体的直径。将数据导出为电子表格文件。选择所需大小和形状的感兴趣区域（ROI），并将其应用于类球体的周边和缺氧核心区域。将感兴趣区域（ROI）转换为测量对象，以分析所选ROI内的平均R值。以兼容电子表格的表格格式导出数据。对类球体的每个显微成像切面应用测量，获得类球体直径RC和RP的数据集，用于进一步计算和统计比较。将所有数据合并到一个电子表格文件中。MMIR1 探针具有较低的光漂白性，适用于实时研究不同线粒体刺激物对人牙髓干细胞球体快速呼吸反应的影响。FCCP 仅在某些区域表现出轻微的解偶联效应，随后略微降低了细胞呼吸。另一方面，鱼藤酮强烈抑制呼吸作用，导致类球体重新氧合，并在刺激后约80秒内消除从周边到核心的氧梯度。利用成像软件提供的逐像素强度比值自动计算程序，可实时检测并可视化所有类型类球体中从周边到核心的氧梯度，表现为氧合的外周区域与中心的缺氧微环境。本文中的图示展示了不同类型类球体赤道横截面的比值分布剖面。与同细胞hDPSC球体相比，异细胞hDPSC与HUVEC球体具有显著更陡的梯度。异细胞球体中外周到核心的氧梯度可能由其组成中的hDPSC产生，因为hDPSC球体的氧合表现出强烈的呼吸活性。图示显示，生物打印后的hDPSC球体其外周氧合程度显著高于生物打印前测量的球体，而它们的核心氧合水平则具有相似的数值。若探针偶尔发生沉淀而影响类球体的均匀形成，使用前需对探针溶液进行过滤或高速离心。校准针头长度测量和压力调节是匹配生物打印速率、支柱直径以及在多孔支架中打印微聚集体的关键步骤。选择适用于氧敏感探针成像的显微镜设置时，应考虑其对探针光稳定性的影响。氧气成像可与多种类型的活体显微镜测量兼容。成像后，还可进行免疫荧光染色、提取蛋白质用于蛋白质印迹分析，或进行基因表达分析。

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