成年小鼠视网膜的视网膜外植体作为研究视网膜神经血管疾病的离 体 模型

该协议介绍并描述了从成年小鼠获得的视网膜外植体的分离，解剖，培养和染色的步骤。该方法作为研究不同视网膜神经血管疾病（如糖尿病视网膜病变）的 离体 模型是有益的。

视网膜研究的挑战之一是研究不同细胞之间的串扰，例如视网膜神经元、神经胶质细胞和血管细胞。特别是，视网膜神经元的分离和培养具有挑战性。我们相信培养的视网膜外植体可以克服这一限制，并提供独特的离体系统，使我们能够在控制良好的生化参数下研究不同视网膜细胞之间的串扰，并且独立于血管系统。

此外，视网膜外植体是一种重要的筛选工具，用于研究各种视网膜血管和神经退行性疾病的新型药物干预，例如以血管和神经元损伤为特征的糖尿病视网膜病变。我们的实验室多年来一直在研究病理生理变化，促进微血管视网膜功能障碍。利用包括体内和体外模型在内的各种模型，使我们能够在实验室内优化许多技术。

在这里，我们描述了来自野生型成年小鼠的视网膜外植体的详细方案，该小鼠可以在培养中保存两周。将动物饲养在恒温和光控环境中。检查每只动物的健康、足够的食物和水。

确保为动物提供新鲜的食物和干净的水。每天或根据需要更换脏圈，以维护动物的健康。使用超过12周龄的雄性黑色6只小鼠。

通过过量吸入二氧化碳对家中笼子里的动物实施安乐死。完成手术后，通过适当的方法确认动物死亡，例如确认心脏和呼吸骤停或观察动物的固定和散大瞳孔。通过颈椎脱位等辅助安乐死方法确认死亡。

使用弯曲的镊子对眼眶施加压力，直到眼球突出。轻轻关闭眼睛后部的镊子，并以连续的运动抬高。将眼球浸入含有一毫升冰冷HBSS的1.5毫升管中。

将眼球转移到含有完整培养基的 1.5 或 2 毫升管中。现在它已准备好进行解剖。该图说明了解剖小鼠眼球以创建视网膜外植体的连续步骤。

沿着视角膜缘做圆周切口以打开眼球。通过沿角膜缘切口解剖去除角膜。然后取出晶状体和玻璃体，留下一个空的眼罩。

通过用细镊子握住视神经头的区域，轻轻地剥落眼睛的外层。在去除外套时要格外小心，以免损伤神经视网膜并使视网膜完全完整。然后，视网膜将被切成小块。

这将是一个很大的优势，因为它将允许您进行实验，其中您的对照组和实验组来自同一只动物。然而，将视网膜切成小块会使处理它更具挑战性。因此，我们开发了一种处理这些小视网膜碎片的技术，以确保视网膜培养的正确方向。

将解剖剪刀刀片打开，就在视网膜片下方。用打开的剪刀刀片的尖端慢慢抬高视网膜片，并将其轻轻转移到培养板上。外植体将分别转移到多孔板中的细胞培养插入物上，每个孔板包含300微升视网膜外植体培养基，神经视网膜侧朝上。

视网膜外植体培养物将保持在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿培养箱中。确保视网膜表面朝上。如果视网膜片翻转或折叠，请尝试将其轻轻调整到正确的方向。

未能将视网膜外植体放置在正确的方向，神经视网膜朝上将导致培养物中视网膜细胞的正常生长失败。在这里，我们可以看到免疫荧光染色在培养物中染色的视网膜外植体两周。将外植体固定并用NeuN染色用于视网膜神经元，GFAP用于神经胶质细胞，凝集素用于血管。

染色显示发育良好的视网膜细胞和视网膜血管。在这里，我们可以看到视网膜外植体的免疫荧光染色固定并用GFAP染色用于神经胶质细胞和凝集素用于血管。图像显示视网膜细胞和视网膜血管的染色缺陷和发育不全。

这是因为视网膜外植体被折叠并且未在培养板上正确定向。应特别注意外植体的正确方向，视网膜朝上。如果对照组来源于与处理组相同的单个动物，因此可以更可靠地比较不同的实验条件。

视网膜植入物可以为研究各种视网膜疾病的可能治疗靶点提供一个不错的平台，例如糖尿病视网膜病变和退行性视网膜疾病。