从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

本方案提供了一种可行的方法，用于从大多数血液和实体组织中分离并收集特定的细胞外囊泡，尤其适用于分析其来源及蛋白质成分，从而为后续功能实验提供支持。除高得率和低污染外，本方案的主要优势在于能够分析细胞外囊泡的表面抗原和蛋白质载荷，这对于生理和病理研究具有重要意义。该方法可通过流式细胞仪检测细胞外囊泡来源细胞的表面标志物，进而促进癌症、炎症性疾病和骨质疏松症等疾病的诊断。

组织外泌体的量对后续实验至关重要。确保外泌体的浓度不要过高。耐心进行稀释操作。

首先，使用眼科镊子和剪刀分离上颌骨样本，并用 PBS 清洗，以去除软组织。然后将上颌骨放入 1.5 毫升离心管中，用剪刀将其剪成直径约 1 毫米的小块。加入适量 Liberase 消化液以完全覆盖组织，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

接下来，在4°C条件下以800 × g离心样品10分钟，并用移液器小心地将上清液转移至新的洁净1.5毫升离心管中。将制备好的血浆和骨样品在2,500 × g、4°C条件下离心15分钟，以去除大块细胞碎片和残留的血小板，然后小心地将上清液转移至新的洁净1.5毫升离心管中，并在4°C条件下以16,800 × g离心30分钟。随后，弃去上清液，并用1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重悬每管中的沉淀物。

离心并弃去上清液（操作如前所述）后，再次用50微升PBS重悬各管中的沉淀，并将这些样品置于4摄氏度保存少于24小时，或最好立即用于后续分析。用500微升PBS重悬样品，取50微升转移至新的洁净1.5毫升离心管中作为空白对照，标记为A管；另取50微升转移至另一洁净的1.5毫升离心管中，作为FITC染色管，标记为B管。向主离心管中加入0.5微升膜染料，用于膜染色，并在室温下孵育5分钟。将主离心管在16,800 ×g条件下离心30分钟，弃去上清液后，用200微升PBS重悬沉淀。

将每个50微升样品分装至四个1.5毫升离心管中，分别作为简单染色管（标记为C管）、PE标记管、表面标志物染色管（标记为D管）以及仅二抗对照管（标记为E管）。将破骨细胞相关受体的一抗与骨来源细胞外囊泡样品，以及CD18抗体与血浆来源细胞外囊泡样品分别加入B管和D管，于4°C孵育1小时。离心后弃去上清液，操作方法同前，然后用500微升PBS重悬沉淀。再次于16,800 ×g、4°C离心30分钟，以去除多余的一抗。

弃去上清液后，用50微升PBS重悬沉淀，并在E管中分别加入FITC标记的二抗。将所有试管于4°C避光孵育一小时。分别将一滴0.2、0.5和1微米大小的微球悬浮液稀释至1毫升PBS中。然后依次检测每种尺寸的微球，以确认用于细胞外囊泡的设门，并设置流式细胞仪的阈值，利用适当的前向散射光寻找微球和细胞外囊泡群体。

将终末条件设定为计算100,000个膜染色颗粒，并按照文中的描述通过流式细胞仪分析样品。将沉淀物重悬于50 µL RIPA裂解缓冲液中，冰上孵育30分钟。为通过BCA蛋白测定法定量96孔微孔板中所有样品的蛋白浓度，将2 mg/mL的BSA用0.9%生理盐水稀释至0.5 mg/mL。

在三个重复孔中加入终浓度为0.5毫克/毫升的BSA和0.9%生理盐水，体积根据需要确定。然后分别向三个重复孔中各加入2微升样品，并加入18微升生理盐水。通过将BCA试剂A与试剂B混合配制工作液后，向每孔加入200微升工作液，轻轻振荡30秒。

然后将96孔微孔板在37摄氏度下孵育20至25分钟，并使用分光光度计在596纳米处测定吸光度。接着导出数据，绘制标准曲线，并计算样品的蛋白质浓度。根据结果，用0.9%生理盐水和5倍浓度的SDS-PAGE上样缓冲液将样品稀释至每微升1微克，用封口膜严密封闭管口，并在100摄氏度下加热5分钟。

将蛋白ladder中的样品加入到4%至20%的HEPy's tris梯度凝胶中。在电泳缓冲液中以80伏电压运行，直至蛋白质形成一条线状条带，然后切换至120伏电压继续电泳1小时，直至上样染料迁移至凝胶底部。

使用湿转系统将凝胶转移至预先在甲醇中孵育20秒的聚偏二氟乙烯膜上，200毫安条件下转移1小时。配制5% BSA封闭缓冲液：将2.5克BSA和50毫升TBST加入50毫升离心管中。将膜置于该缓冲液中，室温下振荡封闭2小时。

将膜与用 TBST 稀释至适当浓度的特异性一抗在 4 摄氏度下孵育过夜。用洗涤缓冲液洗涤膜四次后，在室温下振荡孵育膜与合适的二抗一小时。再次用洗涤缓冲液洗涤膜四次后，使用化学发光试剂盒在凝胶成像系统中对膜进行成像。

透射电子显微镜和纳米颗粒追踪分析显示，细胞外囊泡典型的形态学特征为圆形和杯状，直径范围在500至300纳米之间。流式细胞术分析显示细胞外囊泡上表达的特异性膜标志物的百分比，提示其来源于母细胞。Western blot分析分别显示PGD和PKM2的表达，作为血浆细胞外囊泡和骨细胞外囊泡蛋白质含量的代表，反映其代谢状态。

在细胞外囊泡中，Golgin-84 呈阴性表达，同时存在线粒体膜蛋白 mitofilin、Alpha-actinin-4、Flotillin-1、Caveolin-1 和 Beta-actin，以及囊泡标志物 CD9，而 CD81 表达水平较低或缺失，且血浆来源的细胞外囊泡中缺乏 APO-A-1。研究人员需注意步骤 2.2，应充分完成组织样本的制备与消化，否则从组织中提取的细胞外囊泡数量将受限。

可将标记有荧光染料的细胞外囊泡注入口腔，以治疗与潜在功能相关的阶段。