Name: 从血浆和实体组织中分离和分析可追溯和功能化的细胞外囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习从血浆和实体组织中分离细胞外囊泡的方法，利用流式细胞术分析表面抗原和蛋白质成分。该技术可获得高产量、低污染的囊泡，适用于癌症和炎症性疾病的诊断研究。

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本工作得到了国家自然科学基金（32000974、81870796、82170988 和 81930025）以及中国博士后科学基金（2019M663986 和 BX20190380）的资助。我们感谢国家基础医学实验教学示范中心（AMFU）提供的协助。

动物实验严格按照第四军医大学机构动物护理和使用委员会指南以及ARRIVE指南进行。本研究采用8周龄的C57Bl/6小鼠（对雌雄无偏好）。分离血浆和组织EV的步骤如图1所示。以血浆为代表，描述从体液中分离EV的操作流程；以上颌骨为代表，说明从固体组织中分离EV的操作流程。
1. 血浆和上颌骨样本的制备
<ol>
	<li>按照以下步骤准备血浆样本。
	<ol>
		<li>使用标准实验室天平测定小鼠的体重。</li>
		<li>向1.5 mL离心管中加入20 µL、2 mg/mL的肝素，并使用混匀仪（见材料表）使肝素附着于管壁。 
		注意：也可直接使用抗凝管采集血液。</li>
		<li>通过腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠（见材料表）对小鼠进行麻醉。用拇指和食指抓住小鼠颈部，用小指固定尾巴和左后肢，暴露腹部后使用1 mL注射器注射戊巴比妥钠。</li>
		<li>通过捏压足垫，确认小鼠角膜反射和肢体反应消失，以判断其是否已充分麻醉。</li>
		<li>使用弯头剪刀剃除眼部周围及睫毛处的毛发。</li>
		<li>抓住小鼠颈部皮肤，将眼部周围的皮肤向后颈部按压，使眼球突出。使用眼科镊迅速夹住眼球，并用步骤1.1.2中准备的1.5 mL离心管收集流出的血液。通过颈椎脱臼法处死小鼠。 
		警告：注意毛发和睫毛，因其可能引起溶血。</li>
		<li>轻轻将离心管上下颠倒数次，以防止血液凝固。 
		警告：应尽快将离心管上下颠倒。</li>
		<li>在4 °C条件下，以1,200 × g离心15分钟。</li>
		<li>小心将上清液转移至新的洁净1.5 mL离心管中，立即使用血浆样本，或在4 °C下保存数小时。</li>
		<li>用等体积的1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释上清液，并充分混匀。 
		&#8203;注意：上述采集血浆的方案为致死性操作。也可通过锁骨下静脉穿刺11采集血液，无需处死小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤准备上颌骨样本。
	<ol>
		<li>使用眼科镊和剪刀分离上颌骨，并用PBS冲洗，借助镊子去除软组织。</li>
		<li>将上颌骨放入1.5 mL离心管中，用剪刀剪成小块（直径需小于1 mm），加入适量Liberase（5 µg/mL，见材料表）覆盖组织（通常8周龄小鼠的骨样本使用1 mL），在37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>在4 °C条件下，以800 × g离心10分钟。</li>
		<li>用移液器小心将上清液转移至新的洁净1.5 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 外泌体的提取
<ol>
	<li>将步骤 1.1.10 和步骤 1.2.4 中制备的样品在 2,500 × g 条件下于 4 °C 离心 15 分钟，以去除大块细胞碎片和残留的血小板。</li>
	<li>小心将上清液转移至新的洁净 1.5 mL 离心管中，并在 16,800 × g 条件下于 4 °C 离心 30 分钟。 
	注意：离心速度可设置为超过 10,000 × g 以提取 EVs12。离心速度越高，获得的 EVs 数量越多。由于我们所用离心机的速度上限为 16,800 × g（见材料表），因此本方案中选择此速度。</li>
	<li>弃去上清液，每管沉淀物用 1 mL PBS 重悬。在 16,800 × g 条件下于 4 °C 离心 30 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，每管沉淀物用 50 µL PBS 重悬。样品可在 4 °C 保存不超过 24 小时，但最好立即用于后续分析（步骤 3–5）。 
	&#8203;警告：不可在 -80 °C 保存，因为这会降低 EVs 的浓度并增加 EVs 的粒径13，从而影响后续对 EVs 的分析。</li>
</ol>
3. 细胞外囊泡的形态学鉴定
<ol>
	<li>进行NTA分析。
	<ol>
		<li>根据EVs的量（大致通过沉淀物的大小判断，50 µL血浆的颗粒为最低量），取5-50 µL重悬液（步骤2.4），用0.22 µm滤器过滤的PBS缓冲液稀释至10 mL，并用1 mL移液枪头充分混匀。将此最终悬液用于颗粒检测。</li>
		<li>使用无菌1 mL注射器以适中且恒定的速度注入至少5 mL蒸馏水，直至检测界面显示的颗粒数少于5个。 
		注意：当通过整个通道注入1 mL蒸馏水后，检测界面上会直接显示颗粒数量。如果颗粒数仍超过5个，则继续每次注入1 mL蒸馏水，直至满足标准。</li>
		<li>将1 µL校准液溶于1 mL蒸馏水中，配制成原液，再取100 µL原液加入25 mL蒸馏水中，制备标准储备液（1:250,000）。将此工作试剂在4 °C保存，可使用1周。</li>
		<li>使用标准储备液（步骤3.1.3）对NTA仪器进行校准。用1 mL无菌注射器注入1-5 mL工作校准液，冲洗仪器通道，直至检测界面显示的颗粒数在50-400之间（理想值约为300）。运行校准程序。</li>
		<li>每次样品检测前，重复步骤3.1.2以冲洗仪器通道。</li>
		<li>使用无菌1 mL注射器以恒定速度注入至少2 mL缓冲液冲洗仪器通道，直至检测界面显示的颗粒数少于10个。</li>
		<li>以适中且恒定的速度（推荐速度为0.5-1 mL/s）注入1 mL步骤3.1.1制备的EV样品。 
		注意：最佳颗粒浓度应使检测界面显示的颗粒数在50-400范围内，理想值约为300。若颗粒数过高，应立即重复步骤3.1.2冲洗仪器通道，以避免颗粒在通道壁上滞留，并根据步骤3.1.1调整EV样品浓度，然后从步骤3.1.5重新开始。</li>
		<li>按照制造商说明书进行颗粒分析，并生成分析报告（见材料表）。</li>
		<li>若样品珍贵，可用1 mL注射器将EV样品泵回，并收集至1.5 mL离心管中。重复步骤2.2提取EVs。</li>
		<li>检测完所有样品后，向仪器通道注入至少2 mL缓冲液，再注入至少5 mL蒸馏水，直至检测界面显示的颗粒数少于5个。</li>
		<li>使用无菌5 mL注射器以恒定速度（推荐速度为1 mL/s）注入至少10 mL空气，以清除通道中的水分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行TEM分析。 
	注意：以下步骤需使用新鲜的EV重悬液。Formvar-碳涂层电子显微镜载网有两面，工作面为中央网格发亮的一面。用于本实验流程提取EVs的最低血浆体积为50 µL。
	<ol>
		<li>将EV样品（步骤2.4）与等体积的4%多聚甲醛（PFA）混合。取4 µL EVs滴加于一张载网上，在室温（RT）孵育15分钟。</li>
		<li>在聚乙烯薄膜上放置四滴PBS（每滴等于50 µL）（见材料表）。用洁净的显微镊子转移载网，并将载网的工作面依次在各滴PBS中清洗。</li>
		<li>用滤纸吸除载网上残留的多余PBS。</li>
		<li>将载网的工作面浸入1%磷钨酸（见材料表）中2分钟，然后重复步骤3.2.2。 
		警告：由于磷钨酸具有毒性，该操作必须在通风橱中进行，且废弃的磷钨酸需专门回收，不得直接丢弃。</li>
		<li>将载网正面朝上放置于铺有滤纸的10 cm培养皿中。载网可在室温下保存数年。</li>
		<li>按照制造商说明书在电子显微镜下观察载网（见材料表）。 
		&#8203;注意：为确保观察到单个颗粒，必须调整EVs的浓度，且悬液应澄清无明显浑浊。滴样前应充分混匀样品。代表性TEM和NTA分析结果见图2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞外囊泡（EVs）的来源分析
注意：确定细胞外囊泡（EVs）的细胞来源需要使用典型细胞膜标志物的抗体。进行以下操作步骤所需的血浆最小体积为 300 µL。基于 EVs 的脂质双分子层结构，可使用膜染料对其进行标记。对于血液血浆样本，选择淋巴细胞标志物 CD1814 作为代表；对于上颌骨样本，则以破骨细胞相关受体（osteoclast-associated receptor, OSCAR）作为破骨细胞的示例15。在进行流式细胞术（FC）之前，需确保流式细胞仪已针对 EVs 检测进行了适配16，因为不同流式细胞仪对检测下限尺寸的要求存在显著差异。
<ol>
	<li>将样品（步骤 2.4）用 500 µL PBS 重悬，取 50 µL 转移至新的洁净 1.5 mL 离心管中作为空白对照（管 A），另取 50 µL 转移至另一新的洁净 1.5 mL 离心管中作为 FITC 简单染色管（管 B）。向原管中加入 0.5 µL 膜染料用于膜染色，室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>将主离心管在16,800 x g条件下离心30分钟 g （4 °C）。弃去上清液，用 200 µL PBS 重悬沉淀。</li>
	<li>将每个50 µL样品均分至四个1.5 mL离心管中，分别用于PE染色管（C管）、表面标志物染色（D管）和仅二抗对照（E管）。</li>
	<li>在骨EV样本中加入OSCAR的一抗，在血浆EV样本中加入CD18抗体（参见 材料表将溶液分别加入 B 管（步骤 4.1）和 D 管（步骤 4.3）中（稀释比例为 1:100）。在 4 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>将离心管在16,800 x g条件下离心30分钟 g （4 °C）。弃去上清液，用 500 µL PBS 重悬沉淀，然后在 16,800 x g 条件下再次离心 30 分钟 g （4 °C）以去除多余的一抗。</li>
	<li>弃去上清液，用 50 µL PBS 重悬沉淀，随后加入 FITC 标记的二抗（参见 材料表），分别按1:200稀释（E管）。向B管（步骤4.1）和D管（步骤4.3）中加入相同的二抗。所有管于4 °C避光孵育1小时。 
	注意：也可使用直接荧光标记的抗体进行流式细胞术检测，但需设置相应的同型对照。</li>
	<li>稀释一滴0.2、0.5和1 µm的微球（参见 材料表) 悬浮液分别加入1 mL PBS中，先依次检测各尺寸的微球，以确认用于EVs的设门范围。使用适当的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），设置流式细胞仪的阈值，用于寻找微球和EV群体。
	<ol>
		<li>将终止条件设置为计算100,000个膜染色颗粒。分析样品 通过 根据制造商说明使用流式细胞仪（参见 材料表。代表性结果如图所示 图3. 
		&#8203;注意：具有荧光通道的NTA设备也可用于来源分析，其样品制备方法与FC相同。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞外囊泡蛋白质含量分析
注意：EVs 中蛋白质含量的分析操作如下进行 通过 western blot。例如，选择血浆和骨来源的细胞外囊泡（EVs）来分析6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）和丙酮酸激酶M2（PKM2）以评估代谢状态。Golgin84（高尔基体标志物）用作阴性对照，Flotillin（膜蛋白）、Caveolin（小窝蛋白的整合膜蛋白）和β-actin（细胞骨架蛋白）17 作为细胞样本的阳性对照用于EVs分析。选择Mitofilin和α-Actinin-4作为大EV标志物，而CD9和CD81作为小EV标志物，以示EV亚群的存在。18Apoa1被选作血浆脂蛋白颗粒的标志物19有关相应试剂的详细信息，请参见 材料表.
<ol>
	<li>将沉淀（步骤 2.4）重悬于 50 µL RIPA 裂解缓冲液中，冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用 BCA 蛋白检测试剂盒在 96 孔微孔板中测定所有样品的蛋白浓度（参见材料表）。
	<ol>
		<li>用 0.9% 的生理盐水（NS）（含 0.9% (w/v) 氯化钠）将 2 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）稀释至 0.5 mg/mL。将 0.5 mg/mL 的 BSA 和 0.9% NS 按照表 1所示体积分别加入三个重复孔中。</li>
		<li>取 2 µL 样品（步骤 5.1）分别加入含 18 µL NS 的三个重复孔中。</li>
		<li>通过将 BCA 试剂 A 与试剂 B 按 50:1 的比例混合配制工作液。每孔加入 200 µL 工作液，轻轻振荡 30 秒。</li>
		<li>将 96 孔微孔板在 37 °C 孵育 20–25 分钟。</li>
		<li>使用分光光度计在 596 nm 处测定吸光度（OD）（参见材料表）。</li>
		<li>导出数据。</li>
		<li>绘制标准曲线并计算样品的蛋白浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据测定结果，用 0.9% NS 和 5× SDS-PAGE 上样缓冲液（250 mM Tris·HCl，pH 6.8，10% SDS，30% (v/v) 甘油，10 mM DTT，0.05% (w/v) 溴酚蓝，参见材料表）将样品稀释至 1 µg/µL。用封口膜密封管口，在 100 °C 加热 5 分钟。</li>
	<li>将样品和蛋白 Marker 加入浓度梯度为 4%–20% 的 Hepes-Tris 凝胶中（参见材料表）。 
	注意：根据目标蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。</li>
	<li>在电泳缓冲液中以 80 V 电压电泳，直至蛋白条带连成一条线，然后切换至 120 V 继续电泳 1 小时，直至上样染料迁移至凝胶底部。 
	注意：电泳时间可能因所用设备或凝胶类型及浓度不同而有所变化。</li>
	<li>将凝胶转移至已预先在甲醇中孵育 20 秒的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（参见材料表）上。使用湿转系统在 200 mA 条件下转膜 1 小时。 
	警告：确保转膜系统中无气泡，并保持 PVDF 膜湿润。 
	注意：转膜时间可能因目标蛋白分子量而异；通常每 1 KD 需要 1 分钟。</li>
	<li>在 50 mL 离心管中，将 2.5 g BSA（参见材料表）加入 50 mL Tris 缓冲盐水-Tween（TBST）（在 2 L PBS 溶液中加入 2 mL Tween）中，配制成 5% BSA 封闭缓冲液。振荡至粉末完全溶解。在室温下振荡封闭膜 2 小时。</li>
	<li>将膜与用 TBST 稀释至适当浓度的特异性一抗（Mitofilin，1:1000；α-Actinin-4，1:1000；CD9，1:1000；CD81，1:1000；Apoa1，1:1000；Golgin84，1:1000；Flotillin-1，1:1000；Caveolin-1，1:1000；PGD，1:1000；PKM2，1:1000；β-actin，1:3000）在 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（在 2 L PBS 溶液中加入 2 mL Tween）洗涤膜 4 次，每次 15 分钟，然后在室温下振荡孵育合适的二抗（1:4000）1 小时。</li>
	<li>用洗涤缓冲液再次洗涤膜 4 次，每次 15 分钟，然后使用化学发光试剂盒和凝胶成像系统对膜进行成像（参见材料表）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

在研究细胞外囊泡（EVs）的特征、命运和功能时，以高得率和低污染的方式分离EVs至关重要。目前存在多种EVs提取方法，例如密度梯度离心法（DGC）、尺寸排阻色谱法（SEC）和免疫捕获检测。4,20这里采用了一种最常用的方法——差速离心法；该方法的优点在于耗时较短，能够从有限的样本中获得较高产量的细胞外囊泡（EVs），并易于分离，且可根据样本来源对方法进行优化。在分析循环EVs功能时，最好选择血浆，因为血浆能更真实地反映EVs的实际状态 体内，而非血清。这是因为在采集血清的过程中，凝血过程会释放大量血小板来源的细胞外囊泡（EVs）21，而血小板被去除 通过 血浆外泌体分离前的离心步骤22需要注意的是，用于血浆EV分离的抗凝剂选择仍存在争议。肝素的抗凝机制更接近生理状态，因此通过该方法分离得到的EV可能更能反映体内的真实情况 体内 状态。必须指出，肝素会导致PCR出现假阴性结果...

细胞外囊泡（EVs）被定义为细胞释放的、由脂质双层膜包裹的细胞外结构1，其在多种生理和病理过程中发挥重要作用2。健康细胞释放的EVs大致可分为两类：一类是通过细胞内吞作用途径形成的外泌体（或小EVs）3，另一类是通过细胞质膜向外出芽形成的微囊泡（或大EVs）4。尽管许多研究集中于体外培养细胞收集的EVs功能in vitro5，但来源于循环系统或组织的EVs更为复杂且具有异质性，其优势在于能够真实反映生物体内的实际状态in vivo6。此外，几乎所有类型的组织在体内均可产生EVs in vivo，这些EVs可在组织内部充当信使，或通过各种体液（尤其是外周血）进行转移，从而实现系统性通讯7。循环系统和组织中的EVs也是疾病诊断和治疗的重要靶点8。
尽管近年来外泌体已被广泛研究，微囊泡也具有重要的生物学功能，并且无需超速离心即可轻松提取，从而促进了基础与临床研究9。值得注意的是，从循环系统和组织中分离出的细胞外囊泡（EVs）存在一个关键问题，即它们来源于不同类型的细胞10。由于微囊泡是由质膜出芽形成，且富含细胞表面分子9，因此利用亲代细胞的膜标志物来鉴定这些EVs的细胞来源是可行的。具体而言，可应用流式细胞术（FC）检测膜标志物。此外，研究人员还可分离EVs，并基于其功能分子 cargo 进行进一步分析。
本方案提供了从细胞外囊泡（EVs）中提取并进行表征的完整操作流程 体内 样品。EVs 被分离 通过 差速离心，以及细胞外囊泡（EVs）的表征包括形态学鉴定 通过 纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM），来源分析 通过 FC 及蛋白质货物分析 通过 western blot。以小鼠的血液血浆和上颌骨作为代表性样本。研究人员可参考本方案处理其他来源的EVs，并进行相应的调整。

<table><tbody><tr><td>4% 多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Biosharp</td><td>143174</td><td>透射电子显微镜</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔二抗</td><td>Yeason</td><td>34306ES60</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的兔抗山羊二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>抗 CD18 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab131044</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>抗 CD81 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab109201</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>抗 CD9 抗体</td><td>Huabio</td><td>ET1601-9</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>抗 Mitofilin 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab110329</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>APOA1 兔多克隆抗体</td><td>Abclone</td><td>A14211</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>TIANGEN</td><td>PA115</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>BLUeye 预染蛋白 Marker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94964-500UL</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>MP Biomedical</td><td>218072801</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Caveolin-1 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53564</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>CellMask Orange 细胞膜染料</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>化学发光试剂</td><td>Amersham Biosciences</td><td>N/A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>弯头手术剪</td><td>JZ 外科器械</td><td>J21040</td><td>EV 分离</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>智科</td><td>ZK-DST</td><td>EV 分离</td></tr><tr><td>Epoch 全波长酶标仪</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Eppendorf 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>EV 分离</td></tr><tr><td>Flotillin-1 抗体</td><td>PTM BIO</td><td>PTM-5369</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Tanon</td><td>4600</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Golgin84</td><td>Novus</td><td>nbp1-83352</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>载网 - 200 目 Formvar/碳膜铜网</td><td>Polysciences</td><td>24915</td><td>透射电子显微镜</td></tr><tr><td>肝素溶液</td><td>StemCell&amp;nbsp;</td><td>7980</td><td>EV 分离</td></tr><tr><td>Liberase 研究级酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td>EV 分离</td></tr><tr><td>显微镊子</td><td>JZ 外科器械</td><td>JD1020</td><td>EV 分离</td></tr><tr><td>NovoCyte 流式细胞仪</td><td>ACEA</td><td>N/A</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>Omni-PAGE Hepes-Tris 凝胶（Hepes 4~20%，10 孔）</td><td>Epizyme</td><td>LK206</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>OSCAR(D-19) 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-34235</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>PBS (2x)</td><td>ZHHC</td><td>PW013</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-33-0</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>115-035-003</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>111-035-003</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>磷钨酸</td><td>RHAWN</td><td>12501-23-4</td><td>透射电子显微镜</td></tr><tr><td>PKM2(d78a4) xp 兔单克隆抗体&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>4053t</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>聚乙烯（PE）膜</td><td>湘仪</td><td>200150055</td><td>透射电子显微镜</td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯膜&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>3010040001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>重组抗 PGD 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab129199</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 上样缓冲液 (5x)</td><td>Cwbio</td><td>CW0027S</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>粒径标准微球</td><td>Invitrogen</td><td>F13839</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>台式高速微量离心机</td><td>Hitachi</td><td>CT15E</td><td>EV 分离</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>HITACHI</td><td>H-7650</td><td>透射电子显微镜</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>19472</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Vortex Mixer Genie 涡旋混合器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI0425</td><td>EV 分离</td></tr><tr><td>ZetaView BASIC NTA - 纳米颗粒追踪分析视频显微镜 PMX-120</td><td>Particle Metrix</td><td>N/A</td><td>纳米颗粒追踪分析</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Actinin-4 兔单克隆抗体</td><td>Abclone</td><td>A3379</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin</td><td>Cwbio</td><td>CW0096M</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

循环和组织驻留的细胞外囊泡（EVs）作为新型诊疗生物标志物具有广阔前景，同时在维持机体稳态以及多种疾病的发生发展中发挥着重要作用。尽管当前研究主要聚焦于起源于内体的内源性外泌体，但由质膜出芽形成的微囊泡在健康与疾病状态中的重要性也日益受到关注，其特征在于富含能够重现亲本细胞膜特征的表面分子。本文介绍了一种基于差速离心法的可重复性操作流程，用于从血浆及骨等实体组织中分离和表征EVs。该方案进一步描述了对EVs表面抗原及其携带蛋白的分析方法，从而可追溯其来源并鉴定与潜在功能相关的组分。该方法将有助于在生物学、生理学和病理学研究中对EVs进行相关性、功能性和机制性分析。

根据实验流程，可从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡（EVs）（图1）。一只8周龄小鼠的上颌骨质量约为0.1 ± 0.05 g，可从小鼠体内收集约300 µL血浆。按照实验方案步骤，分别可获得0.3 mg和3 µg的EVs。通过透射电镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）分析，EVs典型的形态特征为圆形或杯状膜性囊泡，直径范围为50–300 nm（图2）。流式细胞术（FC）可在有效对照条件下检测膜染料标记的EVs，FC分析显示EVs表面特定膜标志物的表达百分比，提示其来源于母细胞（图3）。Western blot分析分别显示血浆EVs和骨EVs中前列腺素D合成酶（PGD）和丙酮酸激酶M2型（PKM2）的表达，代表其蛋白质组成，反映代谢状态（图4）。EVs中Golgin84呈阴性表达，同时可检测到Mitofilin、α-Actinin-4、Flotillin-1、Caveolin-1和β-actin的存...

本实验方案描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡，并对其表面抗原和蛋白载荷进行分析的方法。

循环和组织驻留的细胞外囊泡（EVs）作为新型诊疗生物标志物具有广阔前景，并且正逐渐成为重要的……

本方案提供了一种可行的方法，用于从大多数血液和实体组织中分离并收集特定的细胞外囊泡，尤其适用于分析其来源及蛋白质成分，从而为后续功能实验提供支持。除高得率和低污染外，本方案的主要优势在于能够分析细胞外囊泡的表面抗原和蛋白质载荷，这对于生理和病理研究具有重要意义。该方法可通过流式细胞仪检测细胞外囊泡来源细胞的表面标志物，进而促进癌症、炎症性疾病和骨质疏松症等疾病的诊断。组织外泌体的量对后续实验至关重要。确保外泌体的浓度不要过高。耐心进行稀释操作。首先，使用眼科镊子和剪刀分离上颌骨样本，并用 PBS 清洗，以去除软组织。然后将上颌骨放入 1.5 毫升离心管中，用剪刀将其剪成直径约 1 毫米的小块。加入适量 Liberase 消化液以完全覆盖组织，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。接下来，在4°C条件下以800 × g离心样品10分钟，并用移液器小心地将上清液转移至新的洁净1.5毫升离心管中。将制备好的血浆和骨样品在2,500 × g、4°C条件下离心15分钟，以去除大块细胞碎片和残留的血小板，然后小心地将上清液转移至新的洁净1.5毫升离心管中，并在4°C条件下以16,800 × g离心30分钟。随后，弃去上清液，并用1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重悬每管中的沉淀物。离心并弃去上清液（操作如前所述）后，再次用50微升PBS重悬各管中的沉淀，并将这些样品置于4摄氏度保存少于24小时，或最好立即用于后续分析。用500微升PBS重悬样品，取50微升转移至新的洁净1.5毫升离心管中作为空白对照，标记为A管；另取50微升转移至另一洁净的1.5毫升离心管中，作为FITC染色管，标记为B管。向主离心管中加入0.5微升膜染料，用于膜染色，并在室温下孵育5分钟。将主离心管在16,800 ×g条件下离心30分钟，弃去上清液后，用200微升PBS重悬沉淀。将每个50微升样品分装至四个1.5毫升离心管中，分别作为简单染色管（标记为C管）、PE标记管、表面标志物染色管（标记为D管）以及仅二抗对照管（标记为E管）。将破骨细胞相关受体的一抗与骨来源细胞外囊泡样品，以及CD18抗体与血浆来源细胞外囊泡样品分别加入B管和D管，于4°C孵育1小时。离心后弃去上清液，操作方法同前，然后用500微升PBS重悬沉淀。再次于16,800 ×g、4°C离心30分钟，以去除多余的一抗。弃去上清液后，用50微升PBS重悬沉淀，并在E管中分别加入FITC标记的二抗。将所有试管于4°C避光孵育一小时。分别将一滴0.2、0.5和1微米大小的微球悬浮液稀释至1毫升PBS中。然后依次检测每种尺寸的微球，以确认用于细胞外囊泡的设门，并设置流式细胞仪的阈值，利用适当的前向散射光寻找微球和细胞外囊泡群体。将终末条件设定为计算100,000个膜染色颗粒，并按照文中的描述通过流式细胞仪分析样品。将沉淀物重悬于50 µL RIPA裂解缓冲液中，冰上孵育30分钟。为通过BCA蛋白测定法定量96孔微孔板中所有样品的蛋白浓度，将2 mg/mL的BSA用0.9%生理盐水稀释至0.5 mg/mL。在三个重复孔中加入终浓度为0.5毫克/毫升的BSA和0.9%生理盐水，体积根据需要确定。然后分别向三个重复孔中各加入2微升样品，并加入18微升生理盐水。通过将BCA试剂A与试剂B混合配制工作液后，向每孔加入200微升工作液，轻轻振荡30秒。然后将96孔微孔板在37摄氏度下孵育20至25分钟，并使用分光光度计在596纳米处测定吸光度。接着导出数据，绘制标准曲线，并计算样品的蛋白质浓度。根据结果，用0.9%生理盐水和5倍浓度的SDS-PAGE上样缓冲液将样品稀释至每微升1微克，用封口膜严密封闭管口，并在100摄氏度下加热5分钟。将蛋白ladder中的样品加入到4%至20%的HEPy's tris梯度凝胶中。在电泳缓冲液中以80伏电压运行，直至蛋白质形成一条线状条带，然后切换至120伏电压继续电泳1小时，直至上样染料迁移至凝胶底部。使用湿转系统将凝胶转移至预先在甲醇中孵育20秒的聚偏二氟乙烯膜上，200毫安条件下转移1小时。配制5% BSA封闭缓冲液：将2.5克BSA和50毫升TBST加入50毫升离心管中。将膜置于该缓冲液中，室温下振荡封闭2小时。将膜与用 TBST 稀释至适当浓度的特异性一抗在 4 摄氏度下孵育过夜。用洗涤缓冲液洗涤膜四次后，在室温下振荡孵育膜与合适的二抗一小时。再次用洗涤缓冲液洗涤膜四次后，使用化学发光试剂盒在凝胶成像系统中对膜进行成像。透射电子显微镜和纳米颗粒追踪分析显示，细胞外囊泡典型的形态学特征为圆形和杯状，直径范围在500至300纳米之间。流式细胞术分析显示细胞外囊泡上表达的特异性膜标志物的百分比，提示其来源于母细胞。Western blot分析分别显示PGD和PKM2的表达，作为血浆细胞外囊泡和骨细胞外囊泡蛋白质含量的代表，反映其代谢状态。在细胞外囊泡中，Golgin-84 呈阴性表达，同时存在线粒体膜蛋白 mitofilin、Alpha-actinin-4、Flotillin-1、Caveolin-1 和 Beta-actin，以及囊泡标志物 CD9，而 CD81 表达水平较低或缺失，且血浆来源的细胞外囊泡中缺乏 APO-A-1。研究人员需注意步骤 2.2，应充分完成组织样本的制备与消化，否则从组织中提取的细胞外囊泡数量将受限。可将标记有荧光染料的细胞外囊泡注入口腔，以治疗与潜在功能相关的阶段。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从血浆和实体组织中分离和分析可追溯和功能化的细胞外囊泡

血液中存在的细胞外囊泡被认为可作为多种疾病的新型生物标志物。本文介绍了一种从外周血样本中分离大型质膜来源微囊泡的实验方案，并通过常规流式细胞术和蛋白质印迹法对其进行后续分析。...

外周血微囊泡的分离与表征

本方案用于从肝脏中分离组织来源的细胞外囊泡（EVs）。该方案描述了一个两步法流程，包括先进行胶原酶灌注，再通过差速超速离心，以分离肝脏组织中的细胞外囊泡。...

从肝脏中分离组织细胞外囊泡

在本实验方案中，我们描述了从人全血中快速分离细胞外囊泡并通过基于荧光的纳米颗粒追踪分析对特定标志物进行表征的完整流程。所展示的结果具有高度可重复性，且该方法可调整用于细胞培养上清液的分析。...

基于纳米颗粒示踪分析的单个细胞外囊泡在人血中快速荧光表征

本文提供了一种从完整组织（包括脑组织和肿瘤样本）中分离小细胞外囊泡（EVs）的详细方案。该方法可重复地从实体组织中提取EVs，用于后续下游分析。...

从完整组织中提取细胞外囊泡

本报告重点阐述了从小胶质细胞或血液单核细胞中分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。在体外实验中，评估了小胶质细胞来源的EV对神经突起生长的调控作用，同时研究了血液单核细胞来源的EV对C6胶质瘤细胞侵袭的调控功能。研究目标是更深入地理解这些EV作为免疫介质在特定微环境中的生物学功能。...

免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

本方案表明，可利用尺寸排阻色谱法从细胞培养条件培养基中有效分离出细胞外囊泡。...

利用尺寸排阻色谱法从细胞条件培养基中分离细胞外囊泡

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45...

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

本方案详细描述了利用功能化磁珠高效分离尿液细胞外囊泡的方法。此外，还包括后续分析步骤，如蛋白质印迹、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学。...

基于化学亲和力的生物流体细胞外囊泡分离用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

本文介绍了一种分离、表征和定量人血浆来源的细胞外囊泡（EV）的方法，并提供了一个利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对EV蛋白质组进行无标记分析的工作流程。...

用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

表征生物体液中的细胞外囊泡

本方案描述了从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡的方法，该方法结合酶消化和尺寸排阻色谱技术，能够从结构复杂且产量较低的组织中可重复地回收富含囊泡的组分，用于后续分子分析。...

通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

学习从血浆和实体组织中分离细胞外囊泡的方法，利用流式细胞术分析表面抗原和蛋白质成分。该技术可获得高产量、低污染的囊泡，适用于癌症和炎症性疾病的诊断研究。

从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

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